Summary
핵 accumbens에 있는 도파민 D1-알파 수용 체의 식별은 중앙 신 경계 질환 중 D1 수용 체 역 기능을 명확히 중요 합니다. 우리는 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 시각화 특정 뇌 영역에 하나의 RNA 분자를 수행.
Abstract
중앙 신경 조직에서 D1-알파 하위 수용 체 (Drd1α)은 가장 풍부한 도파민 (DA) 수용 체, 조절 신경 성장 및 개발에 중요 한 역할을. 그러나, Drd1α 수용 체 이상 행동 응답을 중재 하 고 변조 작업 메모리 기능을 기본 메커니즘을 아직 명확 하지 않다. 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 사용 하 여, 현재 연구 식별 도파민 Drd1α 수용 체와 티로신 hydroxylase (TH) RNA 식 핵 accumbens (NAc) 지역과 substantia nigra 지역 (SNR)에 다 관련 회로에서 각각. Drd1α 식은 NAc에 얼룩 패턴 "개별 점"을 보여줍니다. 분명 성 다름 Drd1α 식에서 관찰 되었다. 반면, 일 "클러스터 된" 얼룩 패턴을 보여 줍니다. 일 식에 관한 여성 쥐 남성 동물을 기준으로 셀 당 더 높은 신호 식 표시. 여기에 제시 된 방법을 중앙 신 경계 질환의 진행 하는 동안 변경 내용을 도파민 시스템 장애에서를 조사 소설 현장에서 교 잡 기술을 제공 합니다.
Introduction
부전 striatal 도파민 시스템의 여러 neurocognitive 질병에서 관찰 하는 임상 증상의 진행에 포함 된다. 도파민 D1 수용 체는 두뇌의 전 두 엽 피 질 (PFC) 지역과 striatal에 존재 하 고 무 겁 게 영향 인지 프로세스1, 작동 메모리, 시간 처리, 및 기관차 동작2,3 등 , 4 , 5 , 6 , 7. 이전 연구는 도파민 D1 수용 체의 변화 주의 적자 과다 장애 (ADHD)8, 정신 분열 증9, 에 neurocognitive 증상의 진행과 관련 된 했다 해명 10 , 스트레스 감수 성11. 특히, 정신 분열 증, 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 연구 엽 외피가 있는 도파민 D1 수용 체의 바인딩을 능력 높은 인식 적자와 부정적인 증상11의 존재에 관련 된 표시. 전 두 엽 피 질 도파민 D1 수용 체에 의해 통제에서 흥분 성의 뉴런의 수지상 성장 스트레스 민감성을 완화 한다. 또한, 내측 전 두 엽 피 질 (mPFC) 신경 수용 체 D1의 최저 사회 패배 스트레스로 사회적 회피12향상 시킬 수 있습니다.
여기, RNA 교 잡 제자리에서 신선한-냉동 조직 샘플 셀에 단일 RNA 분자를 시각화의 새로운 기술을 소개 합니다. 현재 기술은 현재 문학 내에서 존재 하는 방법에 비해 여러 장점이 있습니다. 첫째, 현재 프로시저는 조직의 공간 및 형태학 컨텍스트를 유지 하 고 신선한 요구 하는 다른 절차, 조직에 포함 되지 않은 현재 방법으로 결합 될 수 있습니다 있도록 신선한 냉동 조직 샘플에서 수행 되었다. 포 르 말린 고정 및 파라핀 끼워 넣어진 조직에 유사한 절차는 단일 전송 해상도는 RNA 제자리에서 교 잡 기술은13를 사용 하 여 달성 될 수 있다 설명 했다. 우수한 감도 낮은 복사 번호 식으로 다른 핵 산 탐지 방법으로 얻을 수 없는 개별 셀 수준에서 유전자 발현을 비교 하는 기회를 제공 하는 단일 전사 수준에서 RNA의 검출 같은 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기술. 현재 메서드의 단일 대상 RNA 사본에 때 교배 하 고 순차적으로 신호 증폭 분자 검출에의 묶인 매우 구체적인 RNA 프로브를 통해 높은 신호 대 잡음 비율을 사용 하 여 이미지를 유지 하는 또한, 시스템입니다. 마지막으로, 현재 기술 우리의 조사 시스템 관련 마커 단백질에 의해 감지와 같은 단 하나의 클래스를 제한 하는 것 보다는 그것의 특정 대상 독점 프로브, 여러 생물 학적 시스템을 평가 하는 기회 제공 immunohistochemistry 방법입니다.
우리의 연구에서 우리 둘 다 남성과 여성 F344/N 쥐의 핵 accumbens (NAc)에 Drd1α 수용 체 식과 티로신 hydroxylase (TH) 식 substantia nigra (SNR)에서 평가를이 소설 RNA 제자리에서 교 잡 사용. 교 잡 제자리에서 혁신적인 RNA 우리 모두 다 통풍 관 및 다 출시 동시에 영향을 미치는, striatal 다 시스템의 복잡성에 대 한 우리의 이해를 향상 시키는 메커니즘을 조사를 활성화. 신선한 냉동 뇌 조각 및 다른 얼룩 패턴에 대 한 데이터 분석의 방법 제공 절차, 설명: "개별 점" 또는 "클러스터".
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Protocol
실험 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 사우스 캐롤라이나 대학에 의해 승인 되었다 (연방 보증 번호: A3049-01).
1입니다. 신선한 냉동된 뇌 섹션의 준비
- F344/N 쥐 긴장을 사용 하 여: 각 성의 3 쥐 13 개월, 몸 무게 약 320 g.
- 5% (sevoflurane의 과다) sevoflurane 농도 조정 합니다. 추가 분에 대 한 중지를 호흡 후 sevoflurane 노출을 계속 합니다.
- 목을 벨 쥐 하 고 두뇌를 제거 합니다.
- 15 액체 질소에 쥐 뇌 잠수함 s 조직 수확의 5 분 이내.
- -20 ° c에서 1 h cryostat 뇌 equilibrate
- 30 µ m 섹션을 잘라내어 슬라이드 ( 재료의 표참조)에 전송.
- 핵 accumbens 지역 Bregma14앞쪽 2.28 m m 약 2.76 m m에서에서 섹션을 선택 하십시오.
- 지속적으로 쥐의 stereotaxic 두뇌 구조에 따라 핵 accumbens 영역을 통해 후 각 전구에서 쥐 뇌를 슬라이스.
- 샘플 슬라이드에 탑재 합니다. 건조 10 분 동안-20 ° C에서 섹션을 유지.
- 즉시 미리 냉장된 4% paraformaldehyde 1 h 4 ° c.에 대 한 슬라이드를 담가
- 실 온 (RT)에서 증가 에탄올 그라데이션에서 슬라이드 배치: 50% EtOH 5 분; 70% EtOH 5 분; 그리고 100% EtOH 5 분.
- 신선한 100%와 반복 EtOH.
- 흡수 성 종이에 슬라이드를 배치 하 고 건조 한 공기.
- 장벽 펜으로 각 섹션 주위 방 벽을 그리기 ( 재료의 표참조). 1 분 동안 완전히 건조 하는 배리어를 하자.
2입니다. 뇌 섹션의 전처리
- 오븐에 설정 하 고 설정 온도 40 ° c
- 전처리 4 시 약 3 방울 (90 µ L)을 추가 ( 재료의 표참조) 각 뇌 섹션 (슬라이드 당 하나의 섹션)에.
- 실시간에서 30 분에 대 한 섹션을 품 어
- 신선한 1 x PBS와 실시간 반복에서 1 분 동안 1 x PBS에 슬라이드 잠수함
참고: 슬라이드 1 x PBS 15 분 이상에 체류 하지 해야 합니다.
3. RNA 제자리에서 교 잡 형광 다중 분석 결과
- 따뜻한 물 욕조에 40 ° C에서 10 분 동안 대상 조사와 다음 실시간에 멋진
- RNA 시 장소 (예를 들어, 앰프 1-4 층)에서 실시간
- 슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).
- 샘플 조각에 Drd1α 프로브 (C1)의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 2 h 40 ° c.에 대 한 품 어
- 워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.
- 슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).
- 앰프 1-샘플 조각에 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에 30 분 동안 품 어
- 슬라이드 1 워시 버퍼 실시간 반복에서 2 분에 대 한 신선한 1wash 버퍼와 잠수함
- 슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).
- 샘플 조각에 앰프 2 층의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에서 15 분 동안 품 어
- 워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.
- 슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).
- 앰프 3-샘플 조각에 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에 30 분 동안 품 어
- 워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드 잠수함
- 슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).
- 앰프 4-플로리다-Alt A 샘플 조각에의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에서 15 분 동안 품 어
- 워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.
- 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 하 고 즉시 장착 시 약의 2 방울의 장소 ( 테이블의 자료를 참조) 각 섹션에.
- 22 m m 22 m m coverslip 장소 ( 테이블의 자료를 참조) 각 뇌 섹션.
- 건조까지 2-8 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장 합니다.
- Confocal 현미경 켜고 60 X 목표 전환.
- Confocal 현미경으로 Z-스택 이미지를 얻을. 공초점 이미지의 세부 절차에 대 한 보충 비디오를 참조 하십시오.
- 핵 accumbens 영역에서 셀을 표시 하는 Drd1α의 이미지 (여기: 488 nm; 방출: 515/30 nm).
참고: 섹션 인큐베이션 단계 사이 밖으로 건조 하는 두뇌를 게 하지 마십시오.
4. 데이터 분석
- 반 정량적 얼룩 패턴 분석: "개별 점".
- 이미지에서 개별 셀을 지정 하려면 DAPI 얼룩 핵 표식으로 수행 합니다. 그러나, 그것은 여전히 핵 세포의 불규칙 한 모양으로 여러 종류의 세포는 뇌 조직의 특정 부분을 분석 어렵다. 여기, 두 경험이 풍부한 연구자 별도로 각 셀 셀 영역을 정의 하는 이미지에서 할당 합니다.
- 시각적으로 특정 조건 (그림 1B)를 사용 하 여 셀 당 도트 수에 따라 대표 confocal 이미지 내의 각 셀 점수.
- 각 카테고리에 총 셀 수를 결정 하 고 모든 조직 단면도 (그림 2A)와 남성 및 여성에 대 한 각 범주 내에서 세포의 백분율 주파수를 표시 하는 상대 주파수 그래프를 만들 총 셀 수 x100로 나누면 별도로 (그림 2E).
- 모든 이전 범주 내에서 셀의 합계를 별도로 셀과 남성과 여성에 대 한 모든 조직 단면도 (그림 2B)에 대 한 누적 횟수를 확인 하려면 총 셀 수 x100 나누어 (그림 2F).
- 통계적으로 분석 하는 "개별 점" 얼룩 패턴 (선택 사항).
- 여 지 없이 변수 (즉, 낮은 셀 식 (1)에서 가장 높은 셀 식 (9) 각 순위 범주에가 셀 수) 자연에 서 수를 제공 하는 셀 당 도트 수 검사 추가 통계 분석에 대 한.
- 검사 후 기술 통계의, 세 가지 주요 방법을 사용 하 여: 벽난로-Haenszel 통계, 맨-휘트니 U 테스트 및 Kruskal-월리스 테스트. 비록 정확한 통계 접근에 의존 될 것입니다 관심, 통계 의사 결정 트리 (그림 4)의 실험 설계 및 연구 질문의 분석 방법에 관한 결정에 도움이 수 있습니다.
- 얼룩 패턴에 대 한 관심 (ROI)의 신호 강도 계량: "클러스터".
- 다음 수식을 사용 하 여 각 이미지의 신호 강도 계산.
신호 강도 = 투자 수익 이미지-(평균 배경 강도 × 총 이미지 영역)의 총 강도 - 셀 당 대략적인 신호 식 계산 ROI 이미지 내의 셀의 총 수를 계산 합니다. 신호 강도/이미지 셀/이미지의 수에 있는 그룹 차이 신호 식/셀에서 본 그룹 차이에 기여할 수 있는 메커니즘을 고려 하는 관심 있을 수 있습니다 (그림 3B-3D).
- 다음 수식을 사용 하 여 각 이미지의 신호 강도 계산.
- "클러스터" (선택 사항) 패턴을 얼룩이 지는 통계적으로 분석 합니다.
- 신호 식/추가 통계 분석에 대 한 연속 변수를 제공 하기 위해 셀을 검사 합니다. 독립 샘플 t-테스트 및 분산 분석 (ANOVA), 과목 사이의 요인의 수에 따라 두 가지 방법, 디자인에 포함 된 사용 합니다. 통계적 의사 결정 트리 (그림 4)는 가장 적절 한 통계적 접근에 관한 결정에 도움이 수 있습니다.
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Representative Results
현재의 연구는 관찰 F344/N 쥐 (그림 1A)에서 NAc의 도파민 D1-알파 수용 체 (Drd1α)에서 RNA 식에 대 한 패턴을 얼룩이 지기 "개별 점". 개별 형광 신호 쉽게 확인 하 고 각 셀 내에 단일 RNA 사본을 나타내는 단일 "점"으로 볼 수 있습니다. "이산 점 들" 얼룩 패턴을 표시 하는 NAc에서 이미지에 대 한 우리 반 정량 분석 (그림 1A, 그림 2A및 2B)를 사용 하 여 식의 동적 범위를 평가 합니다. 각 셀은 "0-9에서" 셀 당 도트 수에 따라 득점 했다. 이 "교배 신호"-점수 (H 점수) 방법 따라서 평가할 수 범위와 변화 Drd1α 식에 대 한 개별 셀에 걸쳐.
"이산 점" 얼룩 패턴에 대 한 반 양적 접근 범주 변수를 추가 통계 분석에 대 한 (즉, 셀에서 가장 낮은 순위 (1) 최고 (9) 당 도트 수)를 자연 속에서 서 수를 제공 합니다. 현재 연구에서 우리는 NAc에 Drd1α 식에 한 과목 사이의 요소 (즉, 섹스)의 효과 검사에 관심이 있었다. 중첩 된 데이터 구조 (즉, NAc에 셀을 표시 하는 Drd1α의 2 개의 Z 스택 이미지 각 동물에 대 한 가져온)에 대 한 계정, 평균 개수 값 각 범주에 대 한 계산 되었고 통계 분석을 위해 사용 (남성: n= 3, 여성: n = 3). 맨-휘트니 U 2 개 그룹 (즉, 남성, 여성)와 한 사이 주제 요소 (즉, 섹스)에 차이 검사에 우리의 관심을 감안할 때 테스트 중간 셀 수 (그림 2D)에 차이 평가 하기 위해 실시 됐다. 맨-휘트니 U 테스트 남성 동물 상대적인 감소 중간 셀 점수를 표시 하는 여성 동물과 섹스 [z= 5.8 p≤0.001]의 중요 한 주 효과를 밝혔다. 두 가지 방법을 사용 하 여 각 카테고리에 셀의 주파수를 설명 하는 그림 2E 와 2F : 상대적인 주파수 및 누적 주파수. 여성 동물 남성 동물에 상대적으로 낮은 순서 카테고리에 셀의 큰 주파수 분포에 상당한 변화를 표시. 협회의 벽로 선반-Haenszel 테스트 통계적으로 섹스의 중요 한 효과 공개 배포 검사 실시 [χ2수소(1) 67.3, p≤0.001 =]. 따라서, 전반적으로, 결과 NAc에 Drd1α 식에서 분명 섹스 차이 건의 한다.
성적 증명서의 복사본 수 매우 높은 경우에는 신호 클러스터로 나타날 수 있습니다. 여기, 티로신 hydroxylase 식 (TH) SNR 지역에서 "클러스터" 얼룩 패턴 (그림 3A) 보여주었다. 이 높은 표현 마커를 계량, 우리는 먼저 배경 강도 8 개의 다른 배경 분야에서 평균. 평균 배경 강도 위에 최소 강도 임계값을 설정한 후 조정된 이미지 강도으로 목의 셀 마다 신호 분석
검사 한 주제 사이 요소 (즉, 섹스)에 우리의 관심을 감안할 때, 독립 샘플 t-테스트는 적절 한 통계적 접근 이다. 분석을 위해 데이터 로그 변환 했다. 중첩 된 데이터 구조 (즉, SNR에 세포 분류의 2 개의 Z 스택 이미지 각 동물에 대 한 가져온)에 대 한 계정, 평균값 계산 되었고 통계 분석을 위해 사용 (남성: n= 2, 여성: n= 3). 여성 동물 평균 신호 강도 (그림 3B), 남성 동물 기준으로 총 목 식의 높은 수준의 암시에 상당한 증가 표시 (t(3) = 3.3, p0.05). 그러나, 중요 한 섹스 차이가 관찰 되었다에 이미지 당 셀 수 (t(3) = 2.0, p> 0.05; 그림 3C) 또는 셀 당 식 신호 평균 (t(3) = 2.0, p> 0.05; 그림 3D)입니다. 혼합 디자인 ANOVA, 주제 내 요인으로 세 가지 조치를 고려 하 고 또한 섹스의 중요 한 주요 효과 밝혀 [F (1, 3) 10.6, p0.05 =].
그림 1: 얼룩 패턴에 대 한 셀 당 점의 평균 수에 반 정량 분석의 기준: "개별 점". A. 대표적인 confocal 이미지 (60 X) 다른 점수에 Drd1α 식의 (원래 사진 크기를 기준으로 250% 규모 증폭) 2. 특정 "점수" 범주 각 기준에 대 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: F344/N 쥐의 핵 Accumbens 지역에서 도파민 D1-알파 수용 체 (Drd1α) RNA 수준. A. 각 "점수" 카테고리의 상대 주파수 %. B. 자형 복용량 응답 곡선 제공 설명된 잘 맞는 (r2= 0.99) 95% 신뢰 간격 (CI; 점선으로 표시)의 각 "점수" 카테고리의 누적 빈도 %를 맞게 되었다. C. 대표 confocal (60 X)의 이미지는 "이산 점 들" 얼룩 패턴 남성 및 여성 쥐에 Drd1α 식. 남성 및 여성 쥐에 있는 평균 셀 점수 D. 대표 그래프. 오차 막대 (SEM)의 표준 오차를 뜻한다. E. 비교 컷과 여성 쥐에서 조직에 식 각 "점수" 카테고리의 상대 주파수 %. F. 자형 복용량 응답 곡선이 제공 설명된 잘 맞는 (r2s = 0.99) 남성과 여성 쥐 사이 각 "점수" 카테고리의 누적 빈도 %를 95% 신뢰 간격. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: F344/N 쥐에 Substantia Nigra (SNR) 지역에서 티로신 hydroxylase RNA 수준 (TH). A. 대표적인 confocal 이미지 (60 X; 여기: 543 nm; 방출: 590/50 nm) 표현의 일 남성 및 여성 쥐에 있는 "클러스터" 얼룩 패턴. B-디. 셀 마다 신호 강렬의 대표적인 분석입니다. 신호 식 / 셀 (배경 위의 강도 임계값 설정)와 이미지의 신호 강도 측정 하 고 이미지 내의 셀의 숫자로 그것을 나누어에서 파생 될 수 있다. 오차 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 권장된 통계 분석에 대 한 진단트리. 의사 결정 트리는 통계 분석의 연구 질문에 대 한 가장 적절 한 결정에 대 한 지침을 제공 합니다. 의사 결정 트리는 철저 하 고 경우에 따라 다른 분석 적절 한 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에 우리가 현장에서 교 잡 신선한 냉동 두뇌 분할 영역 핵 accumbens (NAc)에 Drd1α 수용 체 식과 티로신 hydroxylase (TH) 식 substantia nigra (SNR) 지역에서 평가 하의 소설 기법을 설명 합니다. 우리는 또한 다른 얼룩 패턴에 대 한 데이터 분석의 방법 제공: "개별 점" 또는 "클러스터".
교 잡 시험 현장에서 성공적인 멀티플렉스 형광 RNA에 대 한 중요 한 단계가 포함 되어 있습니다. 일단 목이 쥐 그리고 두뇌 제거 액체 질소 5 분 이내에 뇌 동결 4 %paraformaldehyde 고정까지-20 ° C에서 뇌 섹션을 유지. 전처리 4의 외피의 30 분 후 슬라이드 15 분 이상 1 x PBS에 체류 하지 해야 합니다. 뇌를 섹션 증폭 단계 사이 밖으로 건조 하지 마십시오. Confocal 영상 보여주는 명확한 얼룩 신호 조직 샘플에서 높은 품질의 이미지를 제공 하는 매우 도움이 됩니다. 교 잡 오븐을 사용 하 여 신속 하 고 효율적으로 나타납니다 샘플을 40 ° c
NAc에 Drd1α 수용 체 식의 개별 형광 신호는 단일 "점," 각각 나타내는 셀 내의 단일 RNA 사본으로 확인 되었다. 중요 한 것은, "점" 크기 차이 분석 결과 조건에서 샘플 준비, 및 다른 요인 보다는 Drd1α RNA 식 수준을 반영합니다. 마찬가지로, 개별 "점"의 신호 강도 Drd1α RNA 식 수준에 무관 하다. 우리 반 정량 분석 "0-9로" 범위 Drd1α 식에 대 한 가변성을 평가할 수 있는 셀 당 도트 수에 따라 득점으로이 식의 동적 범위를 평가 합니다. 게다가, 셀 당 도트 수의 검사 추가 통계 분석을 위한 범주 변수를 제공 한다.
기술 통계의 시험에 따라 우리의 프로토콜 통계적으로 제시 "개별 점" 추가 분석에 대 한 서 수 변수를 제공 하는 패턴을 얼룩이 지는 신호를 분석 하 세 가지 주요 방법을 권장 합니다. 특히, 비패라메트릭 맨-휘트니 U 테스트, 비패라메트릭 Kruskal-월리스 테스트 및 협회의 벽로 선반-Haenszel 테스트는 것이 좋습니다. 맨-휘트니 U 테스트 및 Kruskal-월리스 테스트 때 단 하나 검사 사이-주제 요소 (예: 성) 가장 적합 하다. 또한, 협회의 벽로 선반-Haenszel 테스트 분포의 변화를 조사 하기 위한 적절 한 수 있습니다. 더 복잡 한 통계 분석, 일반화 추정 방정식 또는 일반 선형 혼합된 모델을 포함 하 여 수 있습니다 적절 한 추가 요소가 포함 되어 있습니다. 권고는 철저 한, 그리고 정확한 통계 접근 실험 설계 및 관심의 연구 질문에 종속 됩니다.
그러나, 성적 증명서의 복사본 수 매우 높은 경우에는 신호 클러스터로 나타날 수 있습니다. 여기, SNR 지역에서 일 식을 "클러스터" 얼룩 패턴을 보여주었다. 높은 표현 일 마커를 계량, 우리는 이미지 강도 평균 배경 강도 위에 최소 강도 임계값 설정에 따라 고로 목의 셀 마다 신호 분석 조정 독립을 사용 하 여 snr, TH를 통계적으로 분석할 수 같은 얼룩 패턴, "클러스터"를 제공 하는 신호 샘플 t-테스트 또는 그룹을 비교 하려면 ANOVA.
이 소설 RNA 제자리에서 교 잡의 분석 결과의 한계가 있다. "이산 점" 얼룩 패턴, 이러한 개별 셀을 더 정확 하 게 정의 하는 방법을 포함 합니다. 우리의 연구에서 이미지에서 개별 셀을 식별 하기 위해 우리가 수행 DAPI 핵 표식으로 얼룩. 그러나, 그것은 여전히 핵 세포의 불규칙 한 형태와 여러 종류의 세포는 뇌 조직의 특정 부분을 분석 어렵다. 여기, 두 경험이 풍부한 연구자 별도로 각 셀 셀 영역을 정의 하는 이미지에서 할당 합니다. "클러스터" 얼룩 패턴, 특정 소프트웨어 설정 임계값 또는 자동 셀 recognization 선택 되어야 한다.
따라서, 혁신적인 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 우리 모두 다 통풍 관 및 다 출시 동시에 영향을 미치는, striatal 다 시스템의 복잡성의 이해를 개선 하는 메커니즘을 조사를 활성화. 전반적으로, 출현 및 뇌 질환의 진행 하는 동안 dopaminergic 표식에 역 기능 변화를 조사할 때 연구원은 교 잡 기술을 현장에서 새로운 RNA에서 혜택 것 이다.
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Disclosures
선언 하는 관심의 없습니다 충돌을 확인 하 고 있습니다.
Acknowledgments
현재 작품은 HD043680, MH106392, DA013137, 및 NS100624 건강 (NIH)의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 부분 기금 NIH T32 훈련 그랜트 생물 행동 과학에 의해 제공 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe - Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe - Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
References
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