Summary
Här presenterar vi ett protokoll att bestämma proteas specificitet i rå mus vävnad extrakt med MALDI-TOF-spektrometri.
Abstract
Proteaser har flera biologiska funktioner, inklusive protein aktivering och inaktivering och mat matsmältning. Identifiera proteas specificitet är viktigt för att avslöja proteas funktion. Den metod som föreslås i denna studie bestämmer proteas specificitet genom att mäta molekylvikten för unika substrat med Matrix-assisted Laser Desorption/jonisering Time-of-Flight (MALDI-TOF) masspektrometri. Substratesna innehåller iminobiotin, medan klyvs webbplatsen består av aminosyror och distansringen består av polyetylenglykol. Klyvs underlaget kommer att generera en unik molekylvikt med hjälp av en aminosyra som klyvs. En av fördelarna med denna metod är att det kan utföras i en kruka med rå prover, och den är också lämplig för att bedöma flera prover. I den här artikeln beskriver vi en enkel experimentell metod optimerad med prover ur musen lungvävnad, inklusive vävnad utvinning, placering av mag substrat i prover, rening av mag substrat under olika pH förhållanden , och mätning av de substrat molekylvikt med hjälp av MALDI-TOF-masspektrometri. Sammanfattningsvis kan denna teknik för identifiering av proteashämmare specificitet i rå prover från vävnad extrakt med MALDI-TOF masspektrometri, som enkelt kan skalas för flera prov bearbetning.
Introduction
Proteaser reglera fysiologiska processer genom att klyva proteiner och inledandet av proteas aktivitet på bestämda tider och platser är reglerade1. Det är därför viktigt att identifiera uttryck och aktivitet av vävnader som regleras lokalt, och att utveckla en ny metod för att upptäcka proteaser. Metoden som föreslås i denna studie syftar till att identifiera proteas specificitet parallellt till att upptäcka proteaser.
Det finns några metoder för att upptäcka proteas specificitet. Azocasein metoden är välkänt för dess användning för detektion av proteaser2 men är begränsad i sin förmåga att få ytterligare information. Zymography är en annan omfattande proteas detektionsmetod som kan användas för att bestämma molekylvikten för proteaser3, men det kan inte användas för att undersöka substrat specificitet. Proteas specificitet kan bestämmas av spektrometriska analyser, använder substrat såsom p-nitroanilide4, och fluorometric analyser, använder kumarin substrat5 eller fluorescens resonans energi överföring (bandet) analyser6. Dessa metoder aktivera single-specificitet detektering av substrat som ingår i en enda brunn. I den aktuella studien undersöks proteas specificitet vävnad extrakt under olika villkor, eftersom dessa utdrag innehåller flera proteaser. Proteas aktivitet styrs av flera faktorer, inklusive pH, coenzymer, prosthetic grupper och ion styrka. Nyligen, proteomik-baserade metoder har använts för att identifiera proteas specificitet; till exempel, den metod som rapporterats av Biniossek et al. 7 använder proteomet för att avgöra substrat specificitet även i rå extrakt och tillåter noggrann bestämning av aktiviteten klyvning av proteaser som känner igen flera amino syra ordnar8. Men är denna metod inte lämplig för analys av många prover. Däremot vår metod möjliggör samtidig bearbetning av flera prover, och användningen av laser Laser Desorption/jonisering Time-of-Flight (MALDI-TOF) masspektrometri för provanalys underlättar snabb och enkel detektion av den klyvs substrat.
Detta dokument beskriver en metod för att utvärdera proteas specificitet med hjälp av MALDI-TOF masspektrometri för att mäta molekylvikten för unika substrat. De molekylära formerna av klyvs substrat, tillsammans med deras teoretiska molekylvikt, visas i figur 1 och tabell 1. Tidigare studier har använt substrat som innehåller polyglycine distanser och biotin9. dessa substrat är dock bristfällig eftersom den polyglycine sekvensen kan vara klyvs av enzymer som känner igen sekvensen glycin. Dessutom kan hög affinitet mellan avidinen och biotin leda till en låg återvinningsgrad. Att förbättra dessa nackdelar, i denna studie vi syntetiseras en unik substrat, som bestod av polyetylenglykol (PEG), iminobiotin och en aminosyra som kunde identifiera webbplatsen klyvning (figur 1). För att diskriminera mellan aminosyror av liknande molekylvikter, lades D-serine mellan PEG mellanlägget och den amino syran på webbplatsen klyvs.
N-terminalen av substratet var märkt med iminobiotin, som möjliggör affinitet rening från rå prover. Användning av iminobiotin i stället för biotin är kritisk; Biotin har en stark samhörighet med avidinen, vilket resulterar i låg återvinningsgrad av biotin-märkt substrat från avidinen harts, medan iminobiotin's affinitet för avidinen kan ändras av pH. Iminobiotin-märkt substrat binder till avidinen i villkoren ovan pH 9, medan metoden släpper iminobiotin-märkt substrat i villkoren nedan pH 4. Därför användes iminobiotin för affinitet rening10. Sammanfattningsvis beskriver vi ett detaljerat protokoll för att upptäcka proteas specificitet med hjälp av unika substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djura experimentella protokoll godkändes av Nihon läkemedels universitetets etiska kommitté och utförs i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur vid Nihon läkemedels universitetet. Protokollet har justerats för vävnad extrakt härrör från ICR möss. ICR möss köptes från Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japan)
1. beredning av substratet Iminobiotin-märkt
Substratet genomgår fasta fasen syntes använder 9-fluorenylmethyloxycarbonyl grupp (Fmoc)-skyddade aminosyror som beskrivs nedan11. Använd tabell 2 för att avgöra Fmoc-föreningen används, beroende på önskad aminosyra och skede av syntes.
- Matrester 0,2 g Fmoc-NH-SAL Resin med 10 mL N, N-dimetylformamid (DMF) i en syntes kolumn.
- Tillsätt 5 mL 30% Piperidin i DMF. Rock lösningen för 10 min att klyva Fmoc-gruppen.
-
Kontrollera Fmoc klyvning med trinitrobenzenesulfonic syra (TNBS) testa12: tillsätt 10 µL av 1% TNBS i DMF och 10 µL av diisopropylethylamine (DIPEA) till en 10 x 75 mm2 glas provrör, sedan överföra en liten mängd harts att glaset rör. Fmoc-avspjälkar kådan bör utveckla en orange färg.
- Upprepa steg 1.2-1.3 om detta resultat är negativt.
- Tvätta tre gånger med 5 mL DMF kådan.
-
Tillsätt 5 mL DMF innehållande 0,3 mmol av Fmoc-föreningen som anges i tabell 2 (start med den förening som används i steg 1), 0,3 mmol O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorofosfat (HCTU), 0,3 mmol av 1- Hydroxy-1H-bensotriazol, monohydrat (HOBt), och 0,6 mmol av diisopropylethylamine (DIPEA). Rock lösningen för 30 min till par den med harts.
- Kontrollera detta steg med TNBS test. Om resultatet är positivt, innebär det att reaktionen inte har tillräckligt gått och detta steg upprepas.
- Tvätta tre gånger med 5 mL DMF kådan.
- Upprepa töjning reaktionen genom att upprepa steg 1.2-1.6, ändra Fmoc-föreningen använde i steg 1,5 enligt tabell 2.
- Tillsätt 1 mL 2,5% vatten, 1% triisopropylsilane (TIS) och 2,5% ethanedithiol (EDT) i trifluorättiksyra klyva peptider från grupperna harts och skydd. Rock lösningen för 60 min.
- Filtrera och samla filtratet i en 50 mL tub.
- Tillsätt 40 mL kall dietyleter etanol och store över natten vid-20 ° C.
- Centrifugera 4000 x g vid-20 ° C i 30 min. samla pelleten.
- Använd en torkugn för 3 h för att avlägsna dietyletern.
- Tillsätt 1 mL 50% acetonitril till vatten och lös upp de rå peptiderna. Lyophilize lösningen för att ta bort trifluorättiksyra. Upprepa detta flera gånger.
-
Rena de peptider som använder en C18 patron kolumn.
- Aktivera kådan i kolumnen C18 patron med 3 mL acetonitril (ACN).
- Jämvikta med 5 mL 5% ACN, 0,1% transfettsyror i H2O.
- Läsa in de rå syntetiska peptiderna i kolumnen C18 patron.
- Skölj med 10 mL 5% ACN, 0,1% transfettsyror i H2O.
- Eluera proverna med 3 mL 60% ACN, 0,1% transfettsyror i H2O.
-
Kontrollera peptiderna genom att mäta deras molekylvikt med hjälp av MALDI-TOF-masspektrometri.
- Pipettera 1 µL av eluenten på en måltavla. Tillsätt omedelbart mättad α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) lösning i 50% acetonitril i 0,1% trifluorättiksyra
- Kristallisera blandningen genom lufttorkning.
- Förvärva masspektra av prover enligt instrumenttillverkarens protokollet.
- Manuellt ställa in den MALDI-TOF masspektrometer till en positiv återspeglar läge.
- Kalibrera den masspektrometer använder CHCA, bradykinin fragment 1-7 (monoisotopic molekylvikt = 756.3997 Da), och angiotensin II (monoisotopic molekylvikt = 1,045.5423 Da).
- Förvärva masspektra av syntetiska peptider och sedan utvärdera genom att jämföra den med den teoretiska molekylvikten.
2. beredning av vävnad extrakt
- Söva ICR hanmöss i en isofluran inandning kammare och kontrollera anestesi djup via tå nypa. Euthanize möss av cervikal dislokation.
- Med sax, göra en mittlinjen buk snitt genom den hud som sträcker sig upp till den xiphoid processen.
- Skär genom membranet och samla alla lungvävnad. Skär vävnaden i små bitar.
- Tvätta vävnaden tre gånger med iskall 50 mM Tris-buffrad koksaltlösning (pH 7,4).
- Väga av vävnader och överföra ca 100 mg av vävnader till ett 12 x 75 mm2 glasrör.
- Tillsätt 0,3 mL utvinning bufferten (50 mM Tris-buffert, pH 7,4, som innehåller 0,1% poly (oxyethylene) octylphenyl eter).
-
Homogenisera lung vävnadsproverna med hjälp av en blandande Homogenisatorer.
- Cool proverna på is.
- Homogenisera proverna vid 20.000 rpm för 30 s i en mixer. Upprepa detta steg tills proven är helt homogen.
Obs: Inte homogenisera under mer än 1 minut kontinuerligt, för att undvika en ökning av temperaturen.
- Över 1000 µL av Homogenatet i en 1,5 mL rör och Centrifugera under 5 minuter vid 10 000 x g vid 4 ° C.
- Överföra 500 μl av supernatanten till ett nytt 1,5 mL plaströr.
- Använd 10 µL av provet för att bestämma proteinkoncentration, med metoder såsom bicinchoninic syra (BCA) eller metoden Coomassie Brilliant Blue (CBB).
- För att förhindra frysning, lägga till 80% glycerol proverna för en slutlig koncentration på 50% glycerol.
- Lagra proverna vid-80 ° C tills vidare användning.
3. rötning av substrat i modell proteas och vävnad extrakt
-
Tillsätt 10 µL 0,1 µg/µL av N-tosyl-L-fenylalanin klormetyl keton (TPCK)-trypsin, 0.1 µg/µL av Staphylococcus aureus V8 proteashämmare eller 10 µg/µL av vävnad extrakt i 890 µL av matsmältningen buffert.
- För att förtydliga skillnaden i proteas specificitet beroende på pH, Använd buffertar justerad till pH 3, 5, 7 och 9. Sammansättningen av matsmältningen bufferten visas i tabell 3.
- Genomföra en negativ kontroll med inaktiva proteashämmare i vävnad extrakt, förberett genom inkubation i kokande vatten (eller uppvärmning vid 100 ° C) i 10 min.
- Tillsätt 10 µL av iminobiotin-märkta substrat (upplöst i dimetyl sulfoxid (DMSO), slutlig koncentration = 100 pmol/10 µL).
- Inkubera under 3 timmar vid 37 ° C att smälta iminobiotin-märkt substrat.
- Efter inkubation, stoppa rötning av substrat med kokande vatten (eller genom uppvärmning vid 100 ° C) i 10 min.
- Centrifugera de smält substratesna för 5 min vid 10 000 x g vid 4 ° C.
- Över supernatanten till en ny 1,5 mL tub.
4. rening av substratet Iminobiotin-märkt
-
Tillsätt 50 µL av 50% streptividin sepharose pärlor i 1 M Tris-buffert (pH 9) innehållande 0,1% polyoxyeten octylphenyl eter.
- Använd pH-test papper för att lösningen ska vara runt pH 9. Om lösningen pH är lågt, justera det till ca pH 9 genom att lägga till 1 M Tris-buffert (pH 9) innehållande 0,1% polyoxyeten octylphenyl eter. Detta steg är viktigt, eftersom det handlar om bindande av iminobiotin-märkta substrat till streptividin.
- Inkubera över natten vid 4 ° C med kontinuerlig mild blandning på en rotator hjul att binda de iminobiotin-märkt substratesna till streptividin. Pärlorna ska vara avstängda under hela inkubationstiden.
- Centrifugera i 1 minut vid 10 000 x g vid 4 ° C. Ta bort supernatanten.
-
Tvätta pärlorna fem gånger enligt följande:
- Lägga till 1000 µL av en tvättlösning (50 mM Tris-buffert, pH 9) pärlorna.
- Tvätta under 10 minuter vid 4 ° C med kontinuerlig mild blandning på en rotator hjul. Pärlorna ska vara avstängda under hela inkubationstiden.
- Centrifugera i 1 minut vid 10 000 x g vid 4 ° C och ta bort supernatanten.
-
Tillsätt 100 µL 0,2% trifluorättiksyra till pärlorna.
- Använd pH-test papper för att säkerställa att lösningen är lägre pH 2. Om pH-värdet i lösningen är hög, justera pH till nedan 2 genom att lägga till 1% trifluorättiksyra.
- Inkubera i 30 min i rumstemperatur med kontinuerlig mild blandning på en rotator hjul.
- Centrifugera i 1 minut vid 10 000 x g vid 4 ° C och sedan överföra supernatanten till en ny 1,5 mL tub.
5. prova beredning och Matrix-Assisted Laser Desorption/jonisering Time-of-Flight masspektrometri (MALDI-TOF masspektrometri)
Obs: Alla lösningar i följande steg bör förberedas med högupplösande vätskekromatografi (HPLC)-grade eller aminosyra sekvensering-grade vatten.
- Pipettera 500 µL av acetonitril till en C18 harts att aktivera den. Ta bort den använda acetonitril. Upprepa detta tre gånger.
- Temperera C18 kådan med 100 µL 0,1% trifluorättiksyra. Ta bort eluenten. Upprepa detta tre gånger.
- För att ladda proverna, binda proverna till harts med pipett.
- Tvätta kådan med 20 µL 0,1% trifluorättiksyra. Upprepa fem gånger.
- Eluera proverna med 3 µL av 60% acetonitril i 0,1% trifluorättiksyra. Pipettera eluenten på en måltavla för MALDI-TOF-masspektrometri. Tillsätt omedelbart mättad α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) lösning i 50% acetonitril i 0,1% trifluorättiksyra.
- Kristallisera blandningen genom lufttorkning.
-
Förvärva masspektra av prover enligt instrumenttillverkarens protokollet.
- Manuellt ställa in den MALDI-TOF masspektrometer till en positiv återspeglar läge.
- Kalibrera den masspektrometer använder CHCA, bradykinin fragment 1-7 (monoisotopic molekylvikt = 756.3997 Da), och angiotensin II (monoisotopic molekylvikt = 1,045.5423 Da).
- Förvärva masspektra av prover, betala nära uppmärksamhet till masspektra från 700 till 900 Da för klyvs form av de biotin-märkt substratesna.
- Identifiera de detekterade topparna med hjälp av tabell 1. Identifiering av lämpliga molekylvikt anger klyvning på C-terminus av relevanta aminosyran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvärdering av metoden för identifiering av proteashämmare specificitet av modell proteas
Effektiviteten av detta system utvärderades med hjälp av TPCK-trypsin och V8-proteas, vars substrat särdrag erhölls. TPCK-trypsin och V8 proteashämmare uppskattades för att klyva den amino syra ordningen på C-terminalen av lysin och arginin rester, och vid karboxi sidan av asparaginsyra och glutaminsyra rester, respektive. Tabell 1 visar den teoretiska molekylvikten av substratet och rötas fragment klyvs av specifika proteaser. Substratet uppslutning med TPCK-trypsin producerade kluvna fragment, varav två kunde upptäckas vid 839.81 Da och 796.76 Da (figur 2A). Molekylvikt av dessa fragment var noga i linje med de teoretiska molekylvikter fragment klyvs från C-terminalen av lysin och arginin, respektive. Dessutom omvandlas den V8 proteasen föregångare substrat till deras klyvs form, med molekylvikt av 769.78 Da och 755.62 Da (figur 2B), som matchade den teoretiska m/z av glutaminsyra och asparaginsyra, respektive. Dessa resultat tyder på att denna metod skulle kunna användas att framgångsrikt identifiera proteas specificitet med MALDI-TOF-masspektrometri.
Utvärdering av substrat specificitet vid olika pH-nivåer med hjälp av musen lung extrakt
En av fördelarna med denna teknik var att ett stort antal prover kan behandlas samtidigt. Denna studie visade att substrat specificitet förändrats enligt pH-nivån (figur 3). I sura förhållanden (figur 3B; pH 5) var ett klyvs fragment molekylvikt 770.13 Da och 826.66 Da. Dessa resultat visade att lunga vävnad extraktet innehåller proteaser med förmåga att klyva på C-terminus glutaminsyra och tryptofan. Som pH-nivån gradvis ökas, topparna av fragment klyvs av glutaminsyra och tryptofan gradvis minskade, medan topparna av fragment avspjälkar av arginin och lysin successivt ökat (figur 3C, D, pH 7 och 9). Dessa resultat visade att lungan extraktet innehöll två eller flera proteaser som hade olika optimala pH och klyvning särdrag.
Figur 1: Schema för detektion av proteashämmare specificitet. (A) iminobiotin-märkt substrat för proteas specificitet struktur. (B) substratesna hade iminobiotin, distanshylsa polyetylenglykol och en cleavable aminosyra webbplats. (C) spektra av iminobiotin-märkta substrat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: utvärdering av metoden att bestämma proteas specificitet med hjälp av en renade enzymet. (A) spektra för iminobiotin-märkt substrat behandlas med TPCK-trypsin. 839.81 och 796.76 topparna matchade fragment som genereras av klyvning vid C-terminal sidan av lysin och arginin, respektive teoretiska molekylvikt. (B) spektra för iminobiotin-märkt substrat behandlas med V8 proteashämmare. 769.78 och 755.62 topparna matchade fragment som genereras av klyvning vid C-terminal sidan av glutaminsyra och asparaginsyra, respektive teoretiska molekylvikt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: utvärdering av metoden att bestämma proteas specificitet med hjälp av vävnad extrakt. Spektra för iminobiotin-märkt substrat som behandlats med en lungvävnad extrahera. Dessa spektra visar toppar erhålls vid (A) pH 3, (B) pH 5, (C) pH 7 och (D) pH 9. (E) de iminobiotin-märkt substrat inkuberas med vävnad extraktet inactivateds med värmebehandling att utvärdera icke-specifik matsmältningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| X | Föregångare | Klyvs form |
| G | 886.58 | 697.58 |
| A | 900.60 | 711.60 |
| S | 916.59 | 727.59 |
| P | 926.61 | 737.61 |
| V | 928.63 | 739.63 |
| T | 930.61 | 741.61 |
| C * | 1003.57 | 814.57 |
| Jag * | 1013.64 | 824.64 |
| L | 942.64 | 753.64 |
| N * | 1014.60 | 825.60 |
| D | 944.59 | 755.59 |
| Q | 957.62 | 768.62 |
| K * | 1028.65 | 839.65 |
| E | 958.60 | 769.60 |
| M * | 1031.60 | 842.60 |
| H | 966.62 | 777.62 |
| F | 976.63 | 787.63 |
| R | 985.66 | 796.66 |
| Y | 992.62 | 803.62 |
| W * | 1015.64 | 826.64 |
| *: D-Ser-Xaa form | ||
Tabell 1: teoretisk molekylvikten för iminobiotin-märkt substrat och proteas fragment förväntade molekylvikt. Asterisker (*) indikerar tillägg av D-serin mellan polyeten mellanlägget och cleavable aminosyran.
| Xaa: Gly, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, Leu, Asp, Gln, Glu, hans, Phe, Arg, Tyr | |||
| Skede | Fmoc-förening | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Iminobiotin | ||
| Xaa: Cys Ile, Asn, Lys, träffade, Trp | |||
| Skede | Fmoc-förening | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-D-Ser (tBu)-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 6 | Iminobiotin | ||
Tabell 2: Sekventiell lista över reagens som används för substrat syntes.
| pH | sammansättning | ||
| 9 | 50 mM Tricine som innehåller 0.1 M NaCl och 10 mM CaCl2 | ||
| 7 | 50 mM Tris-HCl som innehåller 0.1 M NaCl och 10 mM CaCl2 | ||
| 5 | 50 mM natriumacetat som innehåller 0.1 M NaCl och 10 mM CaCl2 | ||
| 3 | 50 mM citronsyra som innehåller 0.1 M NaCl och 10 mM CaCl2 | ||
Tabell 3: Kompositioner av buffertlösningar används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll används MALDI-TOF masspektrometri för att identifiera proteas specificitet i rå prover från vävnad extrakt och kan enkelt skalas för flera prov bearbetning. I synnerhet manipuleras vi pH för att orsaka en förändring i substrat specificitet.
Avidinen-biotin komplexa (ABC) metoden som har använts i biokemi på grund av dess bindande särart, utnyttjades i våra protokoll. På grund av den starka samhörighet av ABC är bindningen av metoden att biotin nästan oåterkalleliga. Affinitet rening för ABC är därför mycket ineffektiv. Av denna anledning rapportera vi att återvinningsgraden för biotin-märkt substrat förväntas vara låg. I denna studie använde vi bara en låg pH-nivå för eluering; deglycosylated avidinen-harts13 eller monomer avidinen-harts14 kan dock också användas att rena biotin-märkt substrat.
Den metod som föreslås i denna studie kan justeras för olika experimentella system och tillämpningar. med tanke på att den MALDI-TOF masspektrometer är oförmögen att utföra kvantitativ analys. När substratet specificitet har bestämts, kan det vara bättre att utföra kvantifiering med spektrometriska analyser, fluorometric analyser eller fluorescens resonans energi överföring (bandet).
Kalibrering av masspektrometri var det viktigaste steget i detta protokoll. I fall där substrat med liknande molekylvikter upptäcks, kan noggrannheten i resultaten förbättras genom att lägga till den molekylära vikten av prekursorer.
Eftersom enzymet reaktion förstärks med tiden, är det möjligt att utvidga reaktionstiden om enzymet inte kan identifieras. Dock resulterar att låta reaktionen fortsätter under mer än 24 h i sidoreaktioner som genererar oönskade toppar. Därför är det tillrådligt att utföra reaktionen för upp till 18 h eller för att styra testning med värme behandlade prover. Denna procedur kunde avgöra proteas specificitet till inom några femtomol av trypsin.
Avslutningsvis presenterar vi en bekväm metod som använder iminobiotin-märkt substrat för att utvärdera proteas specificitet. Denna metod möjliggör samtidig bearbetning av flera prover och kan användas för att förenkla proteas screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av den Nihon farmaceutiska universitet forskningsanslag från Nihon läkemedels universitet (2016) och den MEXT KAKENHI Grant nummer JP17854179.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin) |
Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
