Article de méthode

Génération de cellules épithéliales nasales humaines sphéroïdes pour mucoviscidose individualisé Transmembrane Conductance Regulator étude

DOI :

10.3791/57492

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11 avril 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici une méthode pour générer des cultures sphéroïde en trois dimensions des cellules épithéliales nasales humaines. Sphéroïdes sont alors stimulés au lecteur Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)-ion charge et sécrétion de liquide, quantifier le changement de la taille de luminal sphéroïde comme approximation de fonction CFTR.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alors que l’introduction de médicaments modulateur Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) a révolutionné les soins dans la fibrose kystique (FK), le modèle de thérapie axée sur le génotype en cours d’utilisation présente plusieurs limites. Groupes de mutation premier, rares ou peu étudiée sont exclus des essais cliniques définitives. En outre, comme drogues de modulateur supplémentaires entrer sur le marché, il deviendra difficile d’optimiser les choix de modulateur pour un sujet individuel. Ces deux problèmes sont abordés avec l’utilisation de systèmes individualisés, dérivé de patient modèle préclinique de fonction CFTR et modulation. Cellules épithéliales nasales humaines (HNEs) constituent une source facilement accessible du tissu respiratoire pour un tel modèle. Ici, nous décrivons la génération d’un modèle tridimensionnel sphéroïde de fonction CFTR et modulation en utilisant HNEs primaires. HNEs sont isolés des sujets de façon mini-invasive, élargi dans les conditions de reprogrammation conditionnelles et ensemencé dans la culture de l’ellipsoïde. Dans les 2 semaines des semis, cultures de sphéroïde génèrent des sphéroïdes HNE qui peuvent être stimulés avec 3', 5'-l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc)-générer des agonistes pour activer la fonction CFTR. Gonflement de sphéroïde est ensuite quantifié comme indicateur d’activité CFTR. Sphéroïdes HNE capitaliser sur l’origine peu invasive, mais respiratoire de cellules nasales pour générer un modèle accessible, personnalisé, pertinent à un épithélium reflétant la mortalité et la morbidité de la maladie. Par rapport aux cultures HNE interface air-liquide, sphéroïdes sont relativement rapides à maturité, ce qui réduit le taux global de contamination. Dans sa forme actuelle, le modèle est limité par un débit faible, mais cela est compensé par la facilité d’acquisition de tissu. Sphéroïdes HNE permet de quantifier et de caractériser l’activité CFTR au niveau individuel de façon fiable. Une étude en cours de lier cette quantification à in vivo la réaction aux médicaments déterminera si les sphéroïdes HNE sont un vrai prédicteur préclinique de la réponse du patient à la modulation de CFTR.

Introduction

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Fibrose kystique (FK) est une maladie récessive autosomique fatale affectant plus de 70.000 personnes dans le monde1. Cette maladie génétique de la vie-raccourcissement est dû à des mutations la Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) de protéines2. CFTR est membre de la famille de triphosphate d’adénosine-binding cassette et fonctions comme un canal ionique permettant le mouvement du chlorure et du bicarbonate à travers les membranes apicales de l’épithélium polarisé multiples, y compris le tube digestif, glandes sudoripares, respiratoire et des arbres, entre autres3,4. À ce titre, dysfonctionnelle CFTR entraîne multisystémique dysfonction épithéliale, avec la mortalité découlant de la maladie respiratoire1. Dans le poumon CF, perte du CFTR-conduit des voies respiratoires surface liquide (ASL) Règlement et du mucus libération conduit à mucus épaissi, obstruction des voies respiratoires, infection chronique et remodelage des voies aériennes progressive et poumon fonction1,5.

Malgré l’identification des dysfonctionnement CFTR comme étant la cause de la maladie, thérapies dans FC traditionnellement concentré sur l’atténuation des symptômes (par exemple, thérapie de remplacement d’enzymes pancréatiques, thérapies de dégagement des voies respiratoires)1. Cette approche a été récemment révolutionnée par l’apparition de nouveaux médicaments, appelés « Modulateurs CFTR, » qui ciblent directement dysfonctionnelle CFTR. Cette approche a changé le paysage clinique de gestion des symptômes de modificateurs de la maladie en charge, mais comporte plusieurs limites6,7,8,9,10. Activité de modulateur est spécifique à la défectuosité de la protéine qui accompagne chaque mutation CFTR et limité à sélectionner en génétique des populations,11. Cette limitation est entraînée par l’hétérogénéité des défauts de la protéine, mais aussi par l’impraticabilité des essais cliniques dans les groupes de mutation rare. En outre, chez les sujets présentant des génotypes bien étudiés (par exemple, F508del/F508del CFTR, la mutation CFTR la plus courante), il est grande variabilité en maladie fardeau et modulateur réponse6,7,8 ,9,11.

Pour résoudre ces deux problèmes, les chercheurs ont proposé l’utilisation de modèles personnalisés pour les essais précliniques12. Ce concept utilise des tissus spécifiques au patient pour générer un système de modèle individualisé ex vivo pour les essais en enclos, prédiction en vivo sujet réaction aux traitements de façon personnalisée. Une fois validé, un tel modèle pourrait servir par les cliniciens à la thérapie de précision lecteur quel que soit le génotype CFTR sous-jacent du patient.

Humaine (HBE) les cellules épithéliales bronchiques provenant du tissu de l’explant au moment de la transplantation pulmonaire a créé la possibilité d’un tel modèle pour CF13,14. HBEs cultivées à l’interface air-liquide (ALI) permettant de quantification fonctionnelle de CFTR directement par des tests électrophysiologiques, ou indirectement par le biais de mesures d’ASL homéostasie13,15. Ce modèle a été essentiels à la compréhension de la biologie CFTR et a été un facteur clé dans le développement de CFTR modulateurs16. Malheureusement, les modèles d’HBE ne sont pas tenable comme un modèle personnalisé en raison de la nature invasive de l’acquisition (transplantation pulmonaire ou brossage bronchique) et des échantillons pour ceux qui ont des mutations rares ou maladie bénigne. À l’inverse, tissu intestinal, obtenu à partir des spécimens de biopsie rectale ou duodénal, peut être utilisé pour la mesure de courant intestinale (ICM) ou une analyse axée sur l’enflure organoïde pour étude individualisée CFTR fonction17,18, 19. organoïde essais, en particulier, sont des modèles très sensibles du CFTR activité20,21,22. Les deux modèles sont limités par la source de tissu (tissu intestinal, tandis que la plupart pathologie de la maladie est respiratoire) et la méthode semi-invasive de l’acquisition. Par ailleurs, plusieurs chercheurs ont étudié nasale (HNE) les cellules épithéliales humaines au modèle CFTR restauration23,24,25. HNEs peuvent être récoltées en toute sécurité au pinceau ou curetage chez les sujets de tout âge et, lorsqu’il est cultivé dans la région ALI, récapituler beaucoup de caractéristiques de HBEs25,26,27,28. Des cultures monocouches HNE ont traditionnellement été limités par transformation squameuse et beaucoup de temps à maturité29. En outre, indiqué de court-circuit mesurer le courant dans HNEs est plus petits que ceux de HBEs, suggérant une petite fenêtre pour détecter l’efficacité thérapeutique25.

Compte tenu de la nécessité d’un modèle de culture de tissus personnalisés, non invasif, respiratoire de fonction CFTR, nous avons cherché à fusionner la sensibilité d’un gonflement, organoïde test avec le caractère non invasif et respiratoire de HNEs. Nous décrivons ici, notre méthode de production de cultures 3 dimensions « sphéroïde » de HNEs pour étude individualisée de CFTR dans un essai gonflement30. Sphéroïdes HNE polarisent de manière fiable avec l’apex épithélial vers le centre de la sphère, ou lumen. Ce modèle reprend de nombreuses caractéristiques d’un épithélium respiratoire inférieur et arrive à maturité plus rapidement que les cultures d’ALI. Comme un test fonctionnel, sphéroïdes HNE quantifient fiablement une fonction plage de CFTR, mais aussi modulation dans les groupes de mutation bien étudiés (par exemple, F508del CFTR). Cette analyse axée sur l’enflure capitalise sur les propriétés de transport des ions/sel de CFTR, mesurer indirectement afflux fluide dans l’ellipsoïde comme l’eau suit l’efflux sel apicale. De cette façon, des sphéroïdes stimulées avec CFTR entièrement fonctionnel gonflent robuste, tandis que ceux avec dysfonctionnelle CFTR moins gonflent ou rétrécissement. C’est quantifiée par analyse d’image des prébiotiques et sphéroïdes de stimulation après 1 h, zone luminale de mesure et de déterminer le pourcentage de changement. Cette mesure peut alors être comparée à travers des groupes expérimentaux à l’écran pour la bioactivité de la drogue de façon spécifique au patient.

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Protocole

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Échantillons de l’HNE ont été achetés auprès de sujets recrutés par le Cincinnati Children Hospital Medical Center CF Research Center. Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Institutional Review Board (IRB) de Cincinnati Children Hospital Medical Center. Consentement a été obtenu de tous les sujets avant le test.

1. préparer les médias de l’Expansion et antibiotiques

  1. Rassembler les composantes médias énumérés au tableau 1. Décongeler des surgelés matériaux à température ambiante et faire des solutions courantes nécessaires comme indiqué au tableau 1 en vertu de le « Expansion Media ».
    Remarque : Faites attention lorsque vous manipulez la toxine cholérique, qui est toxique si ingéré et est une peau, des yeux et irrite les voies respiratoires. Faire et combiner toutes les solutions et les médias dans des conditions propres à la biosécurité du cabinet.
  2. À l’aide d’une pipette sérologique de 50 mL, retirez et jetez 50 mL de milieu de base (Dulbecco Modified Eagle Medium/F12) d’un conteneur à compenser l’addition d’autres matières. Verser tous les supports de base à la main dans une bouteille en verre 1 L autoclavés.
  3. En utilisant une pipette sérologique de 50 mL ou une pipette 1 mL selon le cas, transférer tous les composants restants de l’Expansion section « médias » du tableau 1 dans la bouteille en verre stérilisé contenant les médias. Doucement agiter la bouteille à la main pour mélanger.
  4. Masses filtrantes dans un frais, stérile, 1 L, 0,22 µm polyéthersulfone (PES) flacon de filtre en utilisant les instructions du fabricant et d’annoter avec « Expansion Media » et la date.
  5. Préparer les milieux antibiotiques. Faire des solutions mères antibiotiques nécessaires comme il est indiqué dans le tableau 1 sous « Médias antibiotique ».
    1. À l’aide d’une pipette sérologique de 50 mL, transférer 150 mL d’Expansion Media dans une bouteille de verre stérilisés à l’autoclave de fraîches 250 mL.
    2. À l’aide d’une pipette 1 mL, ajouter tous les composants de l’antibiotique section « médias » du tableau 1 dans le flacon de verre stérilisé contenant les médias. Agiter à la main pour mélanger jusqu'à ce que le support soit uniform en apparence.
    3. Masses filtrantes dans une fraîche et stérile 250 mL, 0,22 µm du fiole filtrante du PSE en utilisant les instructions du fabricant et d’annoter avec « Antibiotique Media » et la date.
  6. Entreposer le milieu à 4 ° C pendant environ un mois, ignorant si nuageux, ce qui suggère de contamination.

2. préparer les milieux de la différenciation

  1. Rassembler les composantes médias figurant au tableau 2. Décongeler des surgelés matériaux à température ambiante et faire des solutions courantes nécessaires tel qu’indiqué dans le tableau 2.
    Remarque : Soyez prudent lorsque vous manipulez l’acide rétinoïque, qui est un toxique pour la reproduction, peut être toxique si avalé et provoque une irritation cutanée. Réaliser, aliquote et combiner toutes les solutions et les médias dans des conditions propres à la biosécurité du cabinet.
  2. Retirez et jetez les 52 mL de milieu de base d’un conteneur à compenser l’addition d’autres matières. Verser tous les supports de base dans une bouteille en verre 1 L autoclavés.
  3. En utilisant une pipette sérologique de 25 mL ou une pipette 1 mL le cas échéant, transférer tous les éléments restants du tableau 2 à la bouteille en verre stérilisé contenant les médias et agiter doucement à la main pour mélanger.
  4. Masses filtrantes dans un frais, stérile, 1 L, 0,22 µm polyéthersulfone (PES) flacon de filtre en utilisant les instructions du fabricant et d’annoter avec « Différenciation des médias » et la date.
  5. Entreposer le milieu à 4 ° C pendant environ un mois, ignorant si nuageux, ce qui suggère de contamination.

3. manteau Pétri et blanc sur plaque de fibroblastes Feeder

Remarque : Effectuez toutes les étapes dans des conditions propres à la biosécurité du cabinet.

  1. Mélangez 0,5 mL de stock de collagène et 37,5 mL d’eau stérile dans un tube conique de 50 mL.
  2. Pipetter 4 à 5 mL de solution de collagène dans chaque boîte de Petri propre P100, assurer que la totalité de la surface est couverte.
  3. Couvrir les plats avec des couvercles et incuber une nuit à 37 ° C et 5 % de CO2.
  4. Dans la prévention des risques biotechnologiques armoire, supprimer tous les couvercles de plat. Agiter la solution pour couvrir le plat, puis aspirer.
  5. Stériliser à l’exposition aux ultraviolets (UV) pour couvercles Place 1 h. retour sur les plats, plats pile et couvrir avec du papier aluminium.
  6. Plats de magasin couché à 4 ° C pendant 3 à 6 mois, re-stérilisation sous exposition aux UV light 15-30 min avant utilisation de la culture des cellules.
  7. 24 h avant d’obtenir un échantillon HNE, stériliser un plat revêtu et étiquette que les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) et la date.
  8. Ajouter le support d’Expansion pour couvrir la plaque (environ 5 mL) avec une pipette sérologique.
  9. Décongeler un flacon de 2 x 106 irradiés MEFs dans un bain-marie à 37 ° C. Dès le MEF est décongelés, ajouter la moitié du flacon (environ 106 cellules) dans le plat avec une pipette de 1 mL, agitant à la main pour disperser.
  10. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant la nuit en préparation pour la culture de l’HNE.
    Remarque : Si nécessaire, mesures 3,7-3.10 peuvent être réalisé plus tard que 60 min avant électrodéposition cellules, bien que du jour au lendemain est idéal.

4. obtenir et traiter l’échantillon HNE

  1. Assurer le consentement approuvés par la CISR est obtenue pour tous les sujets.
  2. Ont le nez coup patient pour dégager le mucus lâche.
  3. Visualiser les cornets à l’aide d’un rhinoscope inférieure. Assurer aucune lésions ou des polypes ne sont présent qui peut empêcher le prélèvement de l’échantillon.
  4. Prélever des cellules nasales de la narine première par curetage ou brossage.
    1. Curetage : Curette virage à mi-parcours pour créer une légère, angle ~ 135° avec l’apex de la coupe de la curette. Insérez la curette dans la narine et de faire progresser la coupe curette sous le cornet inférieur. Doucement appuyer sur la coupe de la curette contre l’inférieure cornet et gratter le cornet en tirant la curette avance, répétition total des 3 - 4 fois.
    2. Brosse : Pass la cytologie brosse ci-dessous l’inférieure cornet, puis tourner et déplacer la brosse-and-out légèrement 4 - 5 fois, sans sortir de la narine.
  5. Place curette/pinceau dans un 15 mL conique rempli de médias aux antibiotiques. Répétez les étapes 4.3-4.4 pour l’autre narine, plaçant la curette/brosse dans le même tube à fond conique.
  6. Magasin conique sur la glace jusqu’au moment de la transformation. S’assurer que le traitement se produit moins de 4 h de l’acquisition de l’échantillon, mais peut survenir aussi tard que 24h après acquisition si nécessaire.

5. traiter et développez l’HNE des cellules dans les plats

Remarque : Effectuez toutes les étapes dans des conditions propres à la biosécurité du cabinet.

  1. À l’aide d’une pipette 1 mL et les médias de l’échantillon conique, laver toutes les cellules de brosses curettes/cytologie dans le même tube conique. Une fois propre, jetez curettes / pinceaux.
  2. Centrifuger conique à 360 x g et 4 ° C pendant 5 min.
  3. Aspirer le surnageant, en veillant à ne pas déranger le culot cellulaire.
  4. Resuspendre le culot dans 3 mL de solution de détachement cellulaire, pipette avec une pointe de 1 mL à homogénéiser le mélange.
  5. Centrifuger conique à 360 x g et 4 ° C pendant 5 min.
  6. Répétez les étapes 5,3 à 5,5 fois.
  7. Aspirer le surnageant restant, en prenant soin de ne pas pour déranger le culot cellulaire.
  8. Resuspendre le culot dans 1 mL de médias antibiotique et comte de cellules avec un hémocytomètre.
  9. À l’aide d’une pipette 1 mL, plaque de cellules goutte à goutte sur le plat enduit, des fibroblastes graines préparées à l’étape 3.10. Ajouter des éléments multimédias aux antibiotiques pour couvrir le plat entièrement et de disperser les cellules sur la surface. Plat avec le contenu et la date de l’étiquette et incuber à 37 ° C et 5 % de CO2.
  10. Après 48 h, faire en sorte que les cellules soient attachées à la boîte de Pétri. Aspirer les médias et remplacer avec les médias antibiotique assez frais pour couvrir la plaque.
  11. Changer de média 3 x par semaine, aspirer les anciens médias avec une ligne vide et la pipette Pasteur et remplaçant assez supports neufs pour couvrir la plaque. Après 5 jours sur support d’antibiotique, remplacez les médias médias Expansion, continuant à remplacer trois fois par semaine.
    Remarque : Risque de Contamination est élevé dans la première semaine de la culture. Conserver les échantillons frais dans un incubateur distinct afin de minimiser le risque de contamination croisée.
  12. Vérifier la croissance de la cellule plusieurs fois par semaine. Une fois que les cellules sont environ 70-80 % anastomosé, procéder aux cellules de passage.

6. passage des cellules HNE

  1. Préparer la solution de trypsine de 0,1 % en acide tétraacétique (EDTA).
    Remarque : Soyez prudent trypsine, qui est un irritant des yeux peau, respiratoire, de la manutention.
    1. Peser 15 mg de trypsine du pancréas de porc dans un tube à fond conique.
    2. Peser 56 mg d’EDTA dans un tube conique distinct.
    3. Dans le cabinet de prévention des risques biotechnologiques, transférer la trypsine et EDTA dans une bouteille en verre stérilisés à l’autoclave de 250 mL. Utiliser une petite aliquote de sérum physiologique tamponnée au phosphate (PBS) pour rincer les tubes de la trypsine/EDTA afin d’effectuer le transfert.
    4. Ajouter PBS stérile pour porter la solution totale à 150 mL. Fermer le couvercle hermétiquement.
    5. Incuber les solution de trypsine dans un bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que complètement dissous. Vérifier toutes les 15 min et retirer rapidement une fois dissous.
      Remarque : Ne pas laisser décochée pendant de longues périodes de temps (par exemple, du jour au lendemain), comme la trypsine dans solution va dénaturer lorsqu’elles sont chauffées pendant trop longtemps.
    6. Nettoyer la bouteille avec 2-3 pulvérisations d’éthanol à 70 % et revenir à la biosécurité du cabinet.
    7. Filtrer les 0,1 % solution de trypsine-EDTA dans un frais, stérile 250 mL, 0,22 µm du fiole filtrante du PSE en utilisant les instructions du fabricant et annoter avec le contenu et la date.
    8. Stocker la solution de trypsine-EDTA à 4 ° C pendant environ un mois, jeter si nuageux.
  2. Apporter la différenciation Media, 0,1 % solution de trypsine-EDTA et PBS stérile à température ambiante pendant 30 min Clean avec 70 % d’éthanol et transfert dans une armoire de biosécurité propre.
  3. Dans la prévention des risques biotechnologiques armoire, utilisez une ligne vide et la pipette Pasteur pour aspirer et jeter des supports de culture de tissu plat. Laver le plat en ajoutant, en tourbillonnant et en aspirant les 5 mL de PBS à l’aide d’une pipette propre sérologique.
  4. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, ajouter 5 mL de solution de trypsine-EDTA 0,1 % dans le plat de culture de tissus et revenir à l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 5 min.
  5. Visualiser les cellules sur un microscope inversé à 4-10 X. Vérifiez que les cellules se détachent de la capsule, devient rondes et flottent. Tapotez doucement le côté de la boîte de Pétri pour déloger les cellules, et/ou ré-incuber pendant un 5 min supplémentaire jusqu'à ce que la plupart des cellules sont détachés.
    Remarque : Prendre des précautions pour enlever rapidement les cellules une fois détachés de la boîte de Petri ; une exposition prolongée à 0,1 % trypsine-EDTA nuira viabilité cellulaire.
  6. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, ajouter 5 mL d’Expansion Media au plat et recueillir tout le contenu liquid (10 mL au total) dans un tube conique étiquetées, stérile de 50 mL.
  7. Si les cellules restent adhérentes à la boîte de Petri, répétez les étapes 6,4 6,6 à vers le haut à deux reprises, collecte de matières dans le même tube conique.
    1. Si les cellules restent adhérentes à la boîte de Petri, après trois tours de l’exposition de solution de trypsine, utilisez un grattoir de cellules stériles enlever délicatement le reste. Après avoir enlevé le plat, lavez le grattoir et plat avec 5 mL d’Expansion Media et s’accumuler dans le même tube conique étiqueté.
      Remarque : Si le passage à sphéroïdes, modifier cette procédure pour effectuer la trypsinisation d’une différentielle. Après avoir ajouté la trypsine solution (point 6.4), vérifiez le plat fréquemment jusqu'à ce que les fibroblastes ont détaché (généralement 1-2 min), laissant les cellules épithéliales seulement polygonales attaché au plat. Recueillir et mettre de côté ce surnageant, qui peuvent être repiquées avec impatience pour l’expansion. Répétez les étapes à l’aide de la même solution de trypsine de 6,4 à 6,6 et recueillir seulement les cellules épithéliales restants pour la culture de sphéroïde.
  8. Centrifuger conique à 360 x g pendant 5 min et 4 ° C. Aspirer les médias de la conique.
  9. Resuspendre le culot dans 1 mL d’Expansion médias et nombre de cellules en utilisant un Hémacytomètre.
  10. Une fois quantifiés, les cellules se divisent si nécessaire et repiquées en avant sur une autre boite de culture (y compris la préparation de co-culture de fibroblastes, étape 3 et bordé de cellules pour l’expansion, étapes 5,9-5.12) ou cultivées comme sphéroïdes (étape 7).
    Remarque : Si, passage à une nouvelle boîte de Pétri pour l’expansion, une densité de semis de 0,5 à 1 × 106 cellules dans un plat de P100 est recommandé.

7. ensemencement de cellules pour Cultures de sphéroïde HNE

NOTE : Effectuer toutes les procédures dans cette étape, autres que de centrifugation, dans une armoire de biosécurité propre.

  1. Dégelez la matrice de la membrane basale sur la glace selon les instructions du fabricant (100 µL par puits sphéroïde).
    Remarque : Pensez à faire stérile 500 µL d’extraits de la matrice de la membrane basale à la réception ; ce montant sèmerai une seule plaque de 4 puits.
  2. Séparer un nombre adéquat de cellules différentiellement trypsinisés, repiquées (de l’étape 6,9) pour une concentration finale de 500 000 cellules / mL de la matrice. Pour une plaque de 4 puits, utilisez 200 000 cellules. Rassembler dans un tube de 1,5 mL.
  3. Centrifuger le mélange cellulaire et les médias à 360 x g pendant 5 min à 4 ° C. Complètement, mais soigneusement aspirer et jeter les média à l’aide d’une pipette 1 mL, en prenant soin de ne pas pour déranger le culot cellulaire.
  4. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL, ajouter 100 µL par prévu bien de la matrice de la membrane basale dans le tube de 1,5 mL contenant les cellules. Maintenir le tube sur la glace.
  5. Pipeter monte et descend à soigneusement et complètement remettre en suspension les cellules dans la matrice de la membrane basale. Se déplacer rapidement pour éviter la solidification de la matrice. Éviter de vider complètement la pipette pour s’assurer que les bulles d’air ne sont pas introduites dans le mélange de la cellule de la matrice /.
  6. Dans chaque puits d’une plaque de culture de FIV 4 puits de graines 100 µL d’extraits matrice.
    1. À l’aide d’une propre paire de ciseaux, coupez la partie distale 3-4 mm d’une pointe de pipette de 200 µL.
    2. À l’aide de la pointe taillée, soigneusement Pipetter 100 µL du mélange cellule/matrice dans le centre de chaque puits. Pipetter lentement, dans le but de faire une seule matrice « goutte » au centre de chaque puits. La baisse devrait rester sphérique et ne doit pas toucher les côtés du puits. Lors du déplacement de la plaque, le faire avec tant de soin quant à ne pas perturber ces gouttes.
    3. Incuber les gouttes de matrice de membrane basale à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 30 min, jusqu'à ce que solide.
    4. Soigneusement Pipeter 500 µL de différenciation médias dans chaque puits, prenant soin de ne pas pour déranger la chute de la matrice. S’assurer que la couverture de quelques médias la matrice drop et en rajouter si nécessaire.

8. faire la différence et d’âge mûr sphéroïdes HNE

  1. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL, aspirez doucement tous les médias du puits ; éviter d’aspirer de la matrice qui détruira les sphéroïdes dans cette partie de la matrice, bien que n’importe quel sphéroïdes laissés pour compte peuvent demeurer viables.
  2. À l’aide d’une pointe de pipette frais 1 mL, doucement ajouter 500 µL de médias de différenciation dans le puits autour de la matrice. Ne pas toucher la matrice à l’aide de la pipette et éviter de déranger la chute de la matrice.
  3. Retour sphéroïdes à l’incubateur à 37 oC et 5 % de CO2 pour la croissance en cours. Répétez les étapes 8,1 8,3 à trois fois par semaine.
  4. Évaluer la morphologie sphéroïde quotidiennement sous un microscope inversé à 20 X. Sphéroïdes devraient former dans les 3-5 jours de placage et atteignent la maturité dans les 10 jours environ.

9. Prétraitez, stimuler et Image HNE sphéroïdes pour analyse

  1. Prétraitez les sphéroïdes comme vous le souhaitez avant l’imagerie comme décrit précédemment30.
    Remarque : Pour le prétraitement VX809, ajouter 3 µM de VX809 aux médias pendant 48 à 72 h avant l’imagerie. Mélanger 1 µL de 10 mM VX809 stock (voir Table des matières) à 3,3 mL des médias pour cette concentration.
  2. Chacun changer bien des sphéroïdes à 1 mL de supports neufs de différenciation, y compris le prétraitement (étapes 8.1-8,3) avant d’imagerie sphéroïdes.
  3. Préparer une stimulation douce drogue (la forskoline, 3-isobutyl-1-méthylxanthine [IBMX], VX770 et CFTR inhibiteur 172 [Inh172]) provenant des stocks (voir Table des matières). Pour la forskoline/IBMX, ajouter 1 µL de chaque stock à 98 µL d’eau stérile dans un seul marqué tube 1,5 mL. Pour VX770 et Inh172, ajouter 1 µL de chaque stock à 99 µL d’eau stérile dans des tubes distincts étiquetés 1,5 mL. Faire un volume total permettant 50 µL de solution pour chaque puits testés. Préparer des solutions dans des conditions stériles dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
  4. Transfert en plaque ellipsoïde à une chambre couvée, affectez à 37 ° C et 5 % CO2, monté sur un microscope inversé équipé du logiciel de capture d’image électronique et une platine mécanique d’ajustement XY. Allumez le microscope et caméra, ainsi que l’imagerie informatique.
  5. Capturer des images de base des sphéroïdes dans un puits.
    1. Ouvrez le logiciel de capture d’image (5,5 Slidebook pour les instructions ci-dessous). Une fois initialisé, ouvrez un nouveau fichier en cliquant sur « Fichier », puis « Nouveau ». Nommez le fichier en conséquence, puis cliquez sur « Enregistrer ».
    2. Avec précaution, retirez le couvercle de plaque de culture et centrer une matrice goutte sur l’objectif.
    3. Commençant par le haut de la chute de la matrice, se déplacer dans une grille de trouver des sphéroïdes grossissement 20 x avec l’oculaire du microscope. L’accent haut et en bas pour capturer la sphère à son point le plus large. Annoter à l’emplacement de chaque ellipsoïde sur une carte de la chute de la matrice à identifier de nouveau après l’imagerie.
    4. Dans le logiciel, cliquez sur « Capture d’Image ». Pour l’exposition, choisissez « Manuel » et entrez 50 m s’assurer que les autres paramètres sont appropriés (facteur Bin : 1 x 1, Tél : 512, H: 512, X et Y de décalage : 0). Entrez un nom approprié pour chaque image dans la zone « Nom » (p. ex. sphéroïde 1 Baseline). Cliquez sur « Start » pour afficher une image en direct et « Enregistrer » pour capturer une image de référence.
    5. Répétez les étapes 9.5.1-9.5.4 jusqu'à ce que le nombre de but est atteint, ou chute de la matrice entière est imagé.
      Remarque : Les différences de groupe peuvent être détectés avec aussi peu que 3-5 sphéroïdes par condition, cependant, il est devenu notre pratique à 10 ou plusieurs sphéroïdes par condition d’augmenter la puissance de l’image. Variabilité du dosage est illustrée dans la Figure 2 de la section « Résultats représentant », avec des échantillons des sphéroïdes de 8-10 par sujet, par exemple.
  6. Stimuler les sphéroïdes.
    1. À l’aide d’une pipette de 200 µL, ajouter 50 µL de la drogue de stimulation approprié dans les médias dans le puits, en prenant soin de ne pas pour déranger la matrice.
      NOTE : Après cette dilution de 10 fois (50 µL dans 500 µL de médias), la concentration du médicament final sera : la forskoline 10 µM, IBMX 100 µM, VX770 1 µM, Inh172 10 µM.
    2. Pour le cAMP seulement, ajouter seulement la forskoline/IBMX.
    3. Pour le cAMP + VX770, ajouter la forskoline/IBMX premier, puis VX770 après 2 min.
    4. Pour des conditions inhibées, ajouter Inh172 d’abord, puis la forskoline/IBMX après 2 min.
  7. Immédiatement après la stimulation, surveiller sphéroïde gonflement par imagerie timelapse pendant 1 h. Dans le logiciel, cliquez sur « Capture d’Image ». Cliquez sur « Timelapse » et définissez l’intervalle à 30 s, d’une durée de 60 min. Entrez un nom approprié et cliquez sur « Enregistrer » pour démarrer le timelapse.
    Remarque : Timelapse Standard consiste à capturer des images d’un sphéroïde unique toutes les 30 s pour assurer une haute qualité vidéo. Vous pouvez également exécuter capture faible grossissement du puits entière (par exemple, 4 X) et moins d’images capturées si vous le souhaitez. Si une étape automatique est utilisée, effectuez timelapse des sphéroïdes tous à l’aide de coordonnées prédéfinies ; Sinon, utilisez timelapse d’un sous-ensemble des sphéroïdes de procéder à un examen qualitatif de gonflement et d’assurer qu'aucun problème systématique ne surviennent au cours de l’imagerie (par exemple, détachement de matrice du puits).
  8. Immédiatement après avoir terminé l’image de timelapse de 1 h, capturer des images après stimulation des sphéroïdes tous (par étape 9,5) à l’aide de la carte, créée à l’étape 9.5.3.
    1. Renvoient à des images de stimulation préalable pour assurer que le même plan de mise au point est utilisé pour les images suivis (la qualité focale d’entourant les cellules, les sphéroïdes ou débris grandement faciliter ce processus).
    2. Enregistrer les fichiers avec une annotation appariée de l’étape 9.5.4 (p. ex. sphéroïde 1 après Stimulation).
      Remarque : remplir cette étape immédiatement après le timelapse, comme sphéroïdes peuvent continuer à gonfler.
  9. Remplacer le support dans la représentation bien avec les supports neufs de différenciation.
  10. Répétez les étapes 9,5 par l’intermédiaire de 9,9 pour chaque puits/condition, médicaments de stimulation de réglage comme indiqué pour des conditions expérimentales.
  11. Une fois que toute l’imagerie est terminé, retour sphéroïdes à l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.
    Remarque : Selon la stérilité de la chambre de microscope couvés, contamination après stimulation des sphéroïdes peut être assez fréquente. Laissez les sphéroïdes imagés dans un incubateur distinct, pour minimiser les risques de contamination croisée, ou jeter des sphéroïdes immédiatement après l’imagerie.

10. analyser les Images de sphéroïde HNE

  1. Exporter toutes les images dans un format compatible avec l’analyse d’images. Dans le logiciel, cliquez sur « View », survolez « Export » et sélectionnez « Default vues de toutes les Images sous TIFF... ». Enregistrer sur le disque dur ou un lecteur flash pour l’analyse.
    Remarque : une analyse commerciale logiciel (Table des matières) et des fichiers .tiff bons résultats et sont décrits ici, bien que l’analyse peut également être effectuée en utilisant d’autres plates-formes. Lorsque vous nommez des fichiers, personnel, analyse d’images doit être aveugle aux conditions expérimentales, mais conscient de quelles images sont jumelés (avant et après stimulation) afin d’assurer une analyse équivalente.
  2. À l’aide de logiciels d’analyse, délimiter la zone luminale de chaque image de sphéroïde et exporter dans un logiciel d’analyse de données.
    1. Logiciel d’analyse ouverte. Cliquez sur « Fichier », puis « ouvrir » et naviguez jusqu’au dossier de fichiers contenant des images de sphéroïde. Sélectionnez toutes les images pour l’analyse, puis cliquez sur « Ouvrir ».
    2. Cliquez sur « Mesure » et sélectionnez « Région Measurements ». Dans la boîte de dialogue région mesures, sélectionnez le droptab « Configuration » et vérifiez « Image Name » et « Espace » cases correspondantes sont cochées.
    3. Cliquez sur « Log » et sélectionnez « Open Data Log ». Cliquez sur « OK » sur le fichier de nom et boîte de dialogue données Log en conséquence (par exemple, Condition X, Date). Cela va transférer toutes les mesures dans une feuille de calcul.
    4. Sélectionnez « Trace région » outil bouton et tracer avec soin le lumen de l’ellipsoïde dans la première image pour analyse. Dans la boîte de dialogue région mesure, cliquez sur « Log Data » pour enregistrer la mesure dans Excel.
    5. Répétez les étapes 10.2.2-10.2.4 jusqu'à ce que tous les sphéroïdes sont analysés.
  3. Calculer la variation en pourcentage (100 * [Post-stim - Baseline] ÷ Baseline) dans la zone luminale de ligne de base pour chaque sphéroïde individuel paire d’images et de compiler des données pour analyse.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HNEs devrait fixer à la boîte de Petri et forment des îlots de cellules dans les 72 h d’ensemencement ; exemples de formation de l’île de bonne et mauvaise à une semaine sont présentés dans la Figure 1bis et 1 b, respectivement. Ces îles doivent se développer pour couvrir le plat au cours de 15 à 30 jours. Petits ou sous-optimal des échantillons peuvent prendre plus de temps et souvent ne donneront pas utiles sphéroïdes. Contamination par des...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la génération dérivé de patient nasal sphéroïde de cultures de cellules capables de produire un modèle de fonction CFTR individualisé, spécifique. Il y a plusieurs étapes clés dans le processus qui doit être étroitement assisté pour éviter les difficultés. Tout d’abord est une acquisition bon échantillon du nez du patient. Doit avoir un bon échantillon > 50 000 cellules, limitée glaire/débris et être prêt pour le traitement de moins de 4 h (même si le succès est aussi facilement réalisable avec nuit e...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, octroyer le numéro CLANCY14XX0 et par le biais de la Fondation de la fibrose kystique, octroyer le numéro CLANCY15R0. Les auteurs tiennent à remercier Kristina Ray pour son aide dans le recrutement de patients et de la surveillance réglementaire. Les auteurs tiennent également à remercier le groupe de travail HNE, soutenu par la Fondation de la fibrose kystique, qui ont aidé à la génération des capacités de culture HNE : Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Salomon Marty et Katherine Tuggle.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube Eppendorf de 1,5 mlUSA Scientific  ;4036-3204
Fiole filtrante de 150 mLMidsci  ;TP99150Pour filtrer le média
15 mL Tube coniqueMidsci  ;
Flacon filtrant de 1 là mi-parcoursTP99950Média filtrant Antenne
parabolique à fond de verre de 35 mmMatTek CorporationP35G-0-20-C
3-Isobutyl-1-Méthylxanthine (IBMX)optionFisher Scientific  ;AC228420010Préparez une solution mère de 100 mM de 22,0 mg dans 1 mL de DMSO
50 mL Tube coniqueMidsci  ;  ;
AccutaseInnovative Cell Technologies, Inc.AT-104Solution de détachement cellulaire
AdénineSigma-AldrichA2786-25GVoir le tableau 1
Amphotéricine BSigma-AldrichA9528-100MGVoir le tableau 1
Extrait de cerveau bovin (9mg/mL)Lonza  ;CC-4098Voir le tableau 2
Hydrate de ceftazidimeSigma-AldrichC3809-1GVoir le tableau 1
Racleurs cellulaires 20 cm  ;Midsci  ;
CFTR Inh172Tocris Bioscience3430Préparez une solution mère de 10 mM de 4,0 mg dans 1 mL de DMSO
Toxine cholérique B (de Vibrio cholerae)Sigma-AldrichC8052-.5MGVoir le tableau 1
CYB-1Medical Packaging CorporationCYB-1Brosse de cytologie
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD5879-500ML
Média Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)/F12 Hepes  ;Technologies de la vie  ;11330-057Base Moyenne ; Voir tableaux 1 et 2
Facteur de croissance épidermique (protéine humaine recombinante, sans origine animale)Thermo Fisher ScientificPHG6045Voir tableau 1
ÉpinéphrineSigma-AldrichE4250-1GVoir Tableau 2
ÉthanolFisher Scientific  ;2701
ÉthanolamineSigma-AldrichE0135-500ML16,6 mM solution ; Voir le tableau 2
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)TCI America  ;E0084
Sérum fœtal bovin (FBS haute performance)Invitrogen  ;10082147Voir le tableau 1
ForskolinSigma-AldrichF6886-50Préparez une solution mère de 10 mM de 4,1 mg dans 1 mL de DMSO
Growth-Factor ShrinkMatrigel Corning, Inc.356231Matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit (DFG) de Corning, sans rouge de phénol, sans LDV, 10 mL.
HémacytomètreHausser Scientific1483
Solution de collagène humain, type I (VitroCol ; 3 mg/mL)Advanced BioMatrix5007-ASolution de collagène
HyClone (alias FetalClone II)  ;GE Healthcare  ;SH30066.03HIVoir le tableau 2
HydrocortisoneStemCell Technologies07904Voir les tableaux 1 et 2
Insuline recombinante humaine, solution de zincLife Technologies  ;12585014 solution à 4 mg/mL ; voir le tableau 2
Boîte de FIV à 4 puits,NUNC non traité (via Fisher Scientific)12566350plaque à 4 puits pour les sphéroïdes ; taille de puits similaire à une plaque à 24 puits
MEF-CF1-IRRGlobalstemGSC-6001GFibroblastes embryonnaires murins irradiés
Metamorph 7.7DispositifsmoléculairesLogiciel d’analyse ; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software pour un devis
Olympus IX51 Microscope inverséOlympus CorporationDiscontinuedImaging Microscope. Remplacement : Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  ; pour un devis
Pen StrepLife Technologies  ;15140122Voir le tableau 2
PhsophoryléthéanolamineSigma-AldrichP0503-5GVoir le tableau 2
Acide rétinoïqueSigma-AldrichR2625-50MGVoir le tableau 2
RhinoprobeArlington Scientific, Inc.96-0905Curette nasale
Slidebook 5.53i, Intelligent Imaging InnovationsLogiciel d’imagerie abandonné. Remplacement : Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook pour un devis
Saline stérile tamponnée au phosphate (PBS)Thermo Fisher Scientific20012050
Eau stérileSigma-AldrichW3500-6X500ML
Plat de culture tissulaire 100Techno Plastic Products93100Plat de culture tissulaire pour expansion
TobramycinSigma-AldrichT4014-100MGVoir le tableau 1
Transferrine (Transferrine humaine 0,5 mL)Lonza  ;CC-4205Voir le tableau 2
TriiodothryonineSigma-AldrichT6397-1G3,3&prime ;,5-Triiodo-L-thyronine sel sodique  ; [T3] ; Voir le tableau 2
Trypsine du pancréas porcinSigma-AldrichT4799-10G
Ultroser-GCrescent Chemical (via Fisher Scientific)NC039302420 mL de poudre lypophilisée ; Voir le tableau 2
Chlorhydrate de vancomycine de Streptomyces orientalisSigma-AldrichV2002-5GVoir le tableau 1
VX770Selleck ChemicalsS1144Préparer une solution mère de 1 mM de 0,4 mg dans 1 mL de DMSO
VX809Selleck ChemicalsS1565Acheter ou préparer une solution mère de 10 mM de 4,5 mg dans 1 mL de chlorhydrate de DMSO
Y-27632  ; Inhibiteur de ROCK  ;Enzo LifeSciences  ;ALX-270-333-M025  ;Voir le tableau 1
TP91015 en TP91050TP99010

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Cellules pith liales nasales humainestude de la fonction CFTRG n ration de cultures de sph ro desConditions de reprogrammation conditionnelleAgonistes g n rateurs d AMPcEssai de gonflement des sph ro desIncubation dans le milieu de diff renciationMatrice de membrane basalevaluation au microscope inversTest de modulateurs de CFTR

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