Summary
여기 우리 인간의 비 강 상피 세포의 3 차원 회전 타원 체 문화를 생성 하는 방법을 설명 합니다. Spheroids는 다음 드라이브 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR) 자극-종속 이온 및 액체 분 비, CFTR 함수에 대 한 프록시로 회전 타원 체 luminal 크기의 변화를 측정.
Abstract
낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR) 변조기 약물의 도입 치료 낭 성 섬유 증 (CF)에 혁명 하고있다, 그러나 현재 사용 되 고 있는 유전자 이동 치료 모델은 몇 가지 제한이 있습니다. 첫 번째, 희귀 또는 understudied 돌연변이 그룹 확실 한 임상 시험에서 제외 됩니다. 또한, 추가 변조기 마약 시장에 진입, 그것은 변조기 선택 개별 주제에 대 한 최적화 하기가 될 것입니다. CFTR 기능 및 변조, 개별 환자 파생 전 임상 모델 시스템의 사용으로 이러한 문제를 모두 해결 합니다. 인간의 비 강 상피 세포 (HNEs)는 이러한 모델에 대 한 호흡기 조직의 쉽게 접근할 수 있는 소스입니다. 여기는 CFTR 기능과 기본 HNEs를 사용 하 여 변조의 3 차원 회전 타원 체 모델의 생성에 설명 합니다. HNEs 과목 조건부 재활 조건에서 확장 및 회전 타원 체 문화에 시드, 최소 침 습 방식 으로부터 격리 됩니다. 뿌리기의 2 주 안에 회전 타원 체 문화 HNE spheroids와 3', 5'-주기적인 아데노신 monophosphate (캠프) 자극 될 수 있는 생성-생성 촉진제 CFTR 기능을 활성화. 회전 타원 체 붓기는 CFTR 활동의 프록시 다음 정량 된다. HNE spheroids 질병 사망률 및 사망을 반영 하는 상피에 관련 된 접근, 맞춤 모델을 생성 하 비 강 세포의 침 습, 아직 호흡기 근원에 대문자로 표기 합니다. 공기 액체 인터페이스 HNE 문화에 비해, spheroids는 상대적으로 빨리 성숙, 전체 오염 속도 감소 시키는 있습니다. 그것의 현재 모양에서 모델이 조직 취득 상대적으로 완화에 의해 상쇄 됩니다 비록 낮은 처리량에 의해 제한 됩니다. Spheroids HNE 안정적으로 계량 CFTR 활동 개별 수준에서 특성을 사용할 수 있습니다. Vivo에서 마약 응답을이 정량화를 넥타이 하는 지속적인 연구 HNE spheroids CFTR 변조에 환자의 응답의 진정한 전 임상 예언자 인지 결정 됩니다.
Introduction
낭 성 섬유 증 (CF) 이상 7 만명 세계적으로1에 영향을 미치는 치명적인, 상 염색체 열성 질병 이다. 이 수명 단축의 유전 질환 돌연변이 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 단백질 (CFTR)2에 의해 발생 합니다. CFTR의 멤버인 아데노신 3 인산 염 바인딩 카세트 가족과 기능으로 위장, 땀 샘을 포함 하 여 여러 편광된 epithelia의 꼭대기 막 걸쳐 염화 중 탄산염의 움직임을 허용 하는 이온 채널 그리고 호흡 나무, 다른 사람의 사이에서,34. 따라서, 역 기능적인 CFTR multisystem 상피 부전, 호흡기 질환1에서 형태소 분석 대부분 사망률과 리드. CF 폐, CFTR 구동 기도 표면 액체 (ASL) 규정과 점액 릴리스 리드의 굵은 점액, 기도 방해, 만성 감염, 및 진보적인 기도 개장 손실 및 폐 기능1,5.
질병의 원인으로 CFTR 부전의 식별에 불구 하 고 CF에 치료 증상 (예, 췌 장 효소 대체 요법, 기도 클리어런스 치료)1의 완화에 전통적으로 집중 했다. 이 접근은 최근 "CFTR 변조기," 직접 역 기능적인 CFTR 대상 되 나 새로운 치료제의 출현에 의해 혁명을 일으켰다. 이 방법은 이동 했다 임상 가로 증상 관리에서 질병을 수정 상관 하지만 몇 가지 제한6,7,8,,910. 변조기 활동은 각 CFTR 돌연변이 동반 하는 단백질 결함을 구체적이 고 유전 인구11선택 제한. 이 제한은 단백질 결함의 이질적인 본질 뿐만 아니라 희귀 돌연변이 그룹에서 임상 시험의 비에 의해 구동 됩니다. 또한, 잘 공부 genotypes (예를 들어, F508del/F508del CFTR 가장 일반적인 CFTR 돌연변이), 과목 중 거기에 넓은 가변성 질병 부담 및 변조기 응답6,7,8 ,,911.
모두 이러한 문제를 극복 하기 위해 수 사관 전 임상 테스트12맞춤된 모델의 사용을 제안 했다. 이 개념 맞춤된 패션에서 치료 주제 응답 vivo에서 예측는 개별 비보 전 모델 시스템 복합 테스트 생성 하 환자 관련 조직을 활용 합니다. 일단 확인, 이러한 모델 임상 드라이브 정밀 치료 환자의 기본 CFTR 유전자 형에 의해 사용 될 수 있습니다.
폐 이식 시 explant 조직에서 얻은 인간 기관지 상피 (HBE) 셀 CF13,14에 대 한 이러한 모델의 가능성을 설립. 공기 액체 인터페이스 (알리)에서 성장 하는 HBEs 기능 CFTR 정량화 electrophysiologic 테스트를 통해 직접 또는 간접적으로 ASL 항상성13,15의 조치를 통해 하실 수 있습니다. 이 모델은 CFTR 생물학을 이해 하는 중요 한 되었고 CFTR 변조기16의 개발의 핵심 드라이버 했다. 불행히도, HBE 모델 희귀 돌연변이 또는 가벼운 질병에 대 한 맞춤된 모델 수집 (폐 이식 또는 기관지 솔 질)의 침략 적인 본질과 샘플의 부족으로 유지할 수 없습니다. 반대로, 장 조직, 직장 또는 십이지 장 생 검 표본에서 얻은를 사용할 수 있는 장 전류 측정 (ICM) 또는 붓기 기반 organoid 분석 결과 대 한 개별적인된 CFTR 함수17,18, 연구 19. Organoid 분석 실험, 특히 CFTR 활동20,,2122의 매우 중요 한 모델 이다. 두 모델은 조직 소스 (장 조직, 대부분 질병 병 리는 호흡) 및 수집의 반 침략 적 방법에 의해 제한 됩니다. 또는, 여러 조사 모델 CFTR 복원23,,2425인간의 비 강 상피 (HNE) 세포를 공부 했다. HNEs는 브러쉬 또는 소파 어떤 나이의 주제에 의해 안전 하 게 수확 하실 수 있습니다 그리고, 알리, 경작 하는 때 HBEs25,26,,2728의 많은 특성을 정리. HNE 단층 문화는 전통적으로 편평 변화와 성숙29에 오랜 시간에 의해 제한 되었습니다. 또한, 보고 단락 회로 전류 측정 HNEs에는 HBEs, 치료 효능25를 감지 하는 작은 창을 제안에 그 보다 작은.
CFTR 기능의 개인, 비-침략 적, 호흡기 조직 문화 모델에 대 한 필요성을 감안할 때, 우리 HNEs의 비-침략 적 및 호흡기 자연과 붓기-기반, organoid 분석 결과의 감도 병합 하고자 했다. 여기, 붓기 기반 분석 결과30에 개별된 CFTR 연구에 대 한 HNEs의 3 차원 "회전 타원 체" 문화를 생성 하는 우리의 방법을 설명 합니다. HNE spheroids 구 중심, 또는 루멘으로 상피 정점으로 안정적으로 분극. 이 모델은 낮은 호흡기 상피의 수많은 특성이 고 알리 문화 보다 더 빨리 성숙. 기능 시험으로 HNE spheroids 안정적으로 CFTR 범위 기능 뿐만 아니라, 잘 공부 돌연변이 그룹 (예를 들어, F508del CFTR)에 변조를 계량. 이 붓기 기반 분석 결과 직접 측정 하지 유체 유입은 회전 타원 체로 물 꼭대기 소금 경과 다음과 같이 CFTR의 이온/소금 전송 속성에 대문자로 바꿉니다. 이 패션에 완벽 하 게 기능적인 CFTR와 자극된 spheroids 팽창 견고 하 게, 그 역 기능 CFTR 덜 팽창 또는 수축 하는 동안. 이 사전 이미지 분석을 통해 정량은 고 1 시간 후 자극 spheroids, luminal 영역을 측정 하 고 결정 하는 백분율 변경 합니다. 이 측정 후 실험 그룹 환자 전용 패션에 약 bioactivity에 대 한 화면을 통해 비교할 수 있습니다.
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Protocol
HNE 샘플 신시내티 아동 병원 의료 센터 CF 연구 센터를 통해 채용 하는 과목에서 조달 했다. 여기에 설명 된 모든 메서드는 신시내티 아동 병원 의료 센터의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었습니다. 서 면된 동의 테스트 전에 모든 과목에서 얻은 했다.
1. 확장 미디어와 항생제 미디어 준비
- 표 1에 나열 된 미디어 구성 요소를 수집 합니다. 냉동된 재료 실 온에서 해 동 하 고 "확장 미디어" 아래 표 1 에 표시 된 대로 필요한 재고 솔루션을 확인 합니다.
참고: 콜레라 독 소는 독성, 섭취 하는 경우는 피부, 눈, 호흡기 자극을 처리할 때 주의 사용 합니다. 확인 하 고 모든 솔루션 및 캐비닛 biosafety에 깨끗 한 조건 하에서 미디어를 결합 하 여. - 50 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 제거 하 고 다른 재료의 추가 대 한 보상을 한 컨테이너에서 기본 매체 (Dulbecco 수정이 글 매체/F12) 50 mL를 삭제. 압력가 1 L 유리 병에 손으로 모든 기본 미디어를 붓는 다.
- 미디어를 포함 하는 압력가 마로 소독 유리 병에 표 1 의 "확장 미디어" 섹션에서 모든 나머지 구성 적절 한 전송으로는 50 mL 혈 청 학적인 피 펫 또는 1 mL 피 펫을 사용 합니다. 부드럽게 섞어 손으로 병을 소용돌이 친다.
- 필터 미디어는 신선 하 고, 멸 균 1 L, 0.22 μ m polyethersulfone (PES)에 제조업체의 지침을 사용 하 여 플라스 크를 필터 및 주석을 "확장 미디어"와 날짜.
-
항생제 미디어를 준비 합니다. "항생제 미디어." 아래 표 1에 표시 된 대로 필요한 항생제 재고 솔루션 확인
- 50 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 신선한 250 mL 압력가 유리병 150 mL 확장 미디어의 전송.
- 1 mL 피 펫을 사용 하 여 미디어가 있는 압력가 마로 소독 유리 병에 표 1 의 "항생제 미디어" 섹션에서 모든 구성 요소를 추가 합니다. 혼합 미디어 외관에서 통일 될 때까지 손으로 소용돌이 친다.
- "항생제 미디어"와 날짜 주석 및는 신선 하 고 살 균 250 mL, 제조업체의 지침을 사용 하 여 0.22 μ m PES 필터 플라스 크에 미디어를 필터링 합니다.
- 흐린, 오염 제안 하는 경우 삭제까지 한 달 동안 4 ° C에서 미디어를 저장 합니다.
2. 차별화 미디어 준비
- 표 2에 나열 된 미디어 구성 요소를 수집 합니다. 냉동된 재료 실 온에서 해 동 하 고 표 2에 표시 된 대로 필요한 재고 솔루션을 확인 합니다.
참고: 사용 주의 retinoic 산, 생식 독 소는 처리할 때, 삼 킨 경우에 유독 할 수 있다 및 피부 자극. Aliquot, 확인 하 고 모든 솔루션 및 캐비닛 biosafety에 깨끗 한 조건 하에서 미디어를 결합 하 여. - 제거 하 고 다른 재료의 추가 대 한 보상을 한 컨테이너에서 기본 매체의 52 mL를 삭제. 모든 기본 미디어 압력가 1 리터 유리병에 붓으십시오.
- 적절 한 25 mL 혈 청 학적인 피 펫 또는 1 mL 피 펫을 사용 하, 포함 하는 미디어 압력가 유리 병 표 2 에서 모든 나머지 구성 요소를 전송 하 고 섞어 손으로 부드럽게 소용돌이.
- 필터 미디어는 신선 하 고, 멸 균 1 L, 0.22 μ m polyethersulfone (PES)에 제조업체의 지침을 사용 하 여 플라스 크를 필터 및 주석을 "차별화 미디어"와 날짜.
- 흐린, 오염 제안 하는 경우 삭제까지 한 달 동안 4 ° C에서 미디어를 저장 합니다.
3. 코트 문화 요리 접시 급지대 Fibroblasts 및
참고: 캐비닛 biosafety에 깨끗 한 조건 하에서 모든 단계를 수행 합니다.
- 콜라겐 재고와 37.5 mL 50 mL 원뿔 튜브에 살 균 물 0.5 mL를 혼합.
- 콜라겐 솔루션의 4 ~ 5 mL를 플라스틱 각 깨끗 한 P100 문화 접시에 전체 표면 커버 확보.
- 요리 뚜껑을 커버 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어.
- 캐비닛 biosafety에 모든 접시 뚜껑을 제거 합니다. 요리, 커버 다음 발음 솔루션을 소용돌이 친다.
- 자외선 (UV) 요리에 다시 1 h. 장소 뚜껑, 알루미늄 호 일 스택 및 커버 요리에 대 한 빛에 노출에 의해 소독.
- 4 ° C에서 3-6 개월, 다시 자외선에서 살 균 코팅 저장소 요리 빛 셀 문화 사용 하기 전에 15-30 분.
- HNE 샘플을 얻기 전에 24 시간 소독 미리 코팅된 접시와 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF) 및 날짜 레이블.
- Serologic 피 펫 플레이트 (약 5 mL)을 충당 하기 위해 확장 미디어를 추가 합니다.
- 37 ° C waterbath에서 2 x 106 반구 MEFs의 병 동 MEFs는 해 동 되 자 마자 1 mL 피 펫, 분산을 손으로 소용돌이 함께 접시에 유리병 (약 106 셀)의 절반을 추가 합니다.
- 밤새 HNE 문화에 대 한 준비에에서 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어.
참고: 필요한 경우, 단계 3.7-3.10 수 도금 셀, 전에 60 분 늦게 수행 하지만 하룻밤 이상적 이다.
4. 고 HNE 샘플 처리
- 모든 과목에 대 한 IRB 승인 동의/동의 가져온 확인 합니다.
- 느슨한 점액을 환자 타격 코가 있다.
- 열 등 한 rhinoscope를 사용 하 여 비를 시각화 합니다. 병 변 또는 폴립은 현재 샘플 컬렉션을 배제 수 있습니다 확인 하십시오.
-
소파 또는 칫 솔 질에 의해 첫 번째 콧구멍에서 비 강 세포를 수집 합니다.
- 소파: 벤드 퀴 렛 퀴 렛 컵에서 꼭대기를 약간, ~ 135° 각도 만들려고 그것의 중간점에. 콧구멍에는 퀴 렛을 삽입 하 고 비 열 등에서 퀴 렛 컵 사전. 부드럽게 열 등 한에 대 한 퀴 렛 컵 비 누르고 긁은 퀴 렛을 당겨서는 비 앞으로, 반복 3-4 회 총.
- 브러쉬: 패스는 세포학 열 등 한 아래 비, 다음 회전 고는 콧구멍을 종료 하지 않고 약간 4-5 회, 아웃 솔을 이동.
- 15 ml 원뿔 장소 퀴 렛/브러쉬 항생제 미디어 가득합니다. 다른 콧구멍, 퀴 렛/브러쉬 같은 원뿔 관으로 배치 단계 4.3-4.4 반복 합니다.
- 원뿔에 저장 얼음 처리에 대 한 준비까지. 확인 처리 샘플 수집의 4 h에서 발생 하지만 필요한 경우 취득 후 24 h 늦게 발생할 수 있습니다.
5. 처리 하 고 요리에서 HNE 셀 확장
참고: 캐비닛 biosafety에 깨끗 한 조건 하에서 모든 단계를 수행 합니다.
- 1 mL 피 펫 및 원뿔 샘플에서 미디어 using, 동일한 원뿔 튜브에 curettes/세포학 브러쉬의 모든 셀 세척. 일단 깨끗 하 고, 삭제 curettes / 브러쉬.
- 원뿔 360 x g와 5 분 동안 4 ° C에서 원심.
- Aspirate 상쾌한, 셀 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용
- 다시 세포 분리 솔루션, 균질 혼합물을 1 mL 팁 pipetting 3 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
- 원뿔 360 x g와 5 분 동안 4 ° C에서 원심.
- 한 번 5.3-5.5 단계를 반복 합니다.
- 셀 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용 나머지 상쾌한 발음
- 다시 항생제 미디어와는 hemocytometer count 셀의 1 mL에 펠 릿을 일시 중단 합니다.
- 1 mL 피 펫을 사용 하 여, 세포 단계 3.10에서에서 준비 코팅, 섬유에 씨를 뿌리고 접시에 dropwise 플레이트. 항생제 및 미디어를 완벽 하 게 커버 접시는 세포 표면에 걸쳐 분산을 추가 합니다. 레이블 내용 및 날짜와 함께 요리 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.
- 48 h 후 셀 문화 접시에 연결 되어 있는지 확인 합니다. 미디어를 발음 하 고 접시를 충당 하기 위해 충분 한 신선한 항생제 미디어 바꿉니다.
- 변경 미디어 3 주간, 진공 라인과 파스퇴르 피 펫, 오래 된 미디어를 발음 하 고 접시를 충당 하기 위해 충분 한 신선한 미디어 교체 x. 5 일 후에 항생제 미디어, 미디어 확장 미디어, 세 번 매주 교체를 계속 변경 합니다.
참고: 오염 위험 높은 문화의 첫 번째 주에는. 교차 오염의 위험을 최소화 하기 위해 별도 보육에서 신선한 샘플을 유지. - 세포 성장 매주 여러 번 확인 합니다. 일단 세포는 약 70-80% 합칠, 통로 셀으로 이동 합니다.
6. 통로 HNE 셀
-
Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)에 0.1 %Trypsin 솔루션을 준비 합니다.
참고: 주의 호흡기, 피부 및 눈 자극은 트립 신 처리를 사용 합니다.- 원뿔 튜브에 트립 신 돼지 췌 장에서의 15 밀리 그램 무게.
- 별도 원뿔 튜브에 EDTA의 56 밀리 그램 무게.
- Biosafety 내각에 압력가 250 mL 유리병에 트립 신 그리고 EDTA를 전송. 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 작은 약 수를 사용 하 여 완전 한 전송 되도록 트립 신/EDTA 튜브를 헹 굴.
- 150 ml 전체 솔루션을가지고 살 균 PBS를 추가 합니다. 단단히 뚜껑을 닫습니다.
- 트립 신 솔루션 완전히 해산 때까지 37 ° C waterbath에서 품 어. 매 15 분을 확인 하 고 신속 하 게 한 번 녹 제거.
참고: 두지 마십시오 확인 되지 않은 (예를 들어, 하룻밤), 시간의 연장된 기간에 대 한으로 너무 오래가 열 하는 경우 솔루션에 트립 신 변성 됩니다. - 70% 에탄올의 2-3 스프레이 병을 깨끗 하 고 캐비닛는 biosafety에 반환.
- 250 mL, 제조업체의 지침을 사용 하 여 0.22 μ m PES 필터 플라스 크 신선한, 메 마른에 0.1% 트립 신-EDTA 용액을 필터 및 날짜와 내용을 주석.
- 흐린 경우 삭제까지 한 달 동안 4 ° C에서 트립 신-EDTA 용액을 저장 합니다.
- 실내 온도 이상 30 분 클린 70% 에탄올과 깨끗 한 biosafety 캐비닛에 차별화 미디어, 0.1% 트립 신-EDTA 솔루션 및 살 균 PBS를 가져와.
- Biosafety 내각에서 발음 하 고 조직 배양 접시에서 미디어를 삭제 하는 진공 라인과 파스퇴르 피 펫을 사용 합니다. 추가, 소용돌이, 그리고 깨끗 한 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 PBS의 5 mL을 발음 하 여 접시를 씻어.
- 5 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 조직 문화 접시에 0.1% 트립 신-EDTA 용액 5 mL를 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C, 5% CO2 배양 기를 반환 합니다.
- 4-10 x는 거꾸로 한 현미경 셀을 시각화. 셀 접시에서 분리 되 고 라운드, 그리고 부동 확인 하십시오. 부드럽게 꺼내 셀, 및 대부분의 세포 분리 될 때까지 다시 추가 5 분 동안 품 어 문화 접시의 측면을 누릅니다.
참고: 주의 신속 하 게 한 번 문화 접시;에서 분리 된 세포를 제거 하 트립 신-EDTA 손상 됩니다 0.1%에 장기간된 노출 세포 생존 능력. - 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 접시를 확장 미디어의 5 mL을 추가 하 고 레이블, 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 모든 액체 내용 (총 10 mL)를 수집 합니다.
-
셀 남아 있으면 문화 접시에 부착, 반복 6.4 통해 6.6까지 단계 두 번, 동일한 원뿔 튜브에 수집 내용.
- 셀 남아 있으면 문화 접시에 부착 3 라운드 트립 신 솔루션 노출의 사용 후 살 균 세포 스 크레이 퍼 부드럽게 제거 나머지. 접시에 근 근이, 후 스 크레이 퍼와 확장 미디어의 5 mL 접시 세척 하 고 동일한 레이블이 원뿔 튜브에 수집 합니다.
참고: spheroids에 뿌리고, 차동 trypsinization 수행이 절차 수정. 트립 신을 추가한 후 솔루션 (단계 6.4.), 자주 요리 확인 섬유 아 세포 (일반적으로 1-2 분)를 분리 했으면 때까지 접시에 연결 된만 다각형 상피 세포를 떠난다. 수집 하 고 정해이 표면에 뜨는는 확장에 대 한 앞으로 passaged 수 있습니다. 6.4 6.6 같은 트립 신 솔루션을 사용 하 여 단계를 반복 하 고 회전 타원 체 문화에 대 한 나머지 상피 세포만을 수집 합니다.
- 셀 남아 있으면 문화 접시에 부착 3 라운드 트립 신 솔루션 노출의 사용 후 살 균 세포 스 크레이 퍼 부드럽게 제거 나머지. 접시에 근 근이, 후 스 크레이 퍼와 확장 미디어의 5 mL 접시 세척 하 고 동일한 레이블이 원뿔 튜브에 수집 합니다.
- 5 분 및 4 ° c.에 대 한 360 x g에서 원뿔 원심 원뿔에서 미디어 발음
- 1 ml는 hemacytometer를 사용 하 여 확장 미디어와 count 셀의 셀 펠 릿을 resuspend.
- 필요한 경우 셀 분할 될 수 있다 일단 정량, 그리고 passaged (섬유 공동 문화, 3, 단계의 준비를 포함 하 여 및 확장 단계 5.9-5.12 셀 도금) 새로운 문화 접시에 전달 하거나 spheroids (7 단계)로 경작.
참고: 확장, 0.5-1 × 10의 시드 밀도 대 한 새로운 문화 접시에 뿌리고 P100 접시에6 셀 것이 좋습니다.
7. 시드 셀 HNE 회전 타원 체 문화에 대 한
참고:이 단계에서 원심 분리, 깨끗 한 biosafety 캐비닛에 다른 모든 절차를 실시 합니다.
- 제조업체의 지침 (회전 타원 체 잘 당 100 µ L) 당 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스 녹여
참고: 영수증;에 지하실 멤브레인 매트릭스의 메 마른 500 µ L aliquots를 만드는 것이 좋습니다 이 금액은 단일 4-잘 접시를 씨앗 것입니다. - 전지의 차동 trypsinized, passaged (에서 단계 6.9) 행렬의 mL 당 500, 000 셀의 최종 농도 대 한 적절 한 번호를 구분 합니다. 4-잘 접시 200, 000 셀을 사용 합니다. 1.5 mL 튜브에 수집 합니다.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 360 x g에서 셀 및 미디어 혼합물을 원심 완전히, 하지만 신중 하 게 발음 하 고 셀 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용 1 mL 피 펫을 사용 하 여 미디어를 삭제.
- 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 셀을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 지하실 멤브레인 매트릭스의 잘 계획 당 100 µ L를 추가 합니다. 얼음에 튜브를 유지.
- 위쪽 및 아래쪽을 신중 하 게 플라스틱 하 고 철저 하 게 지하실 막 매트릭스 셀을 resuspend. 행렬의 응고를 피하기 위해 빠르게 이동 합니다. 완전히 공기 방울 행렬/셀 혼합으로 도입 하지는 되도록 피 펫 팁을 비우는 하지 마십시오.
-
4 잘 IVF의 각 음에 씨앗 100 µ L 매트릭스 aliquots 격판덮개 문화.
- 깨끗 한가 위의 쌍을 사용 하 여, 원심 3-4 m m 200 µ L 피 펫 팁의 떨어져 트림.
- 각 우물의 센터에 셀/매트릭스 혼합물의 100 µ L를 플라스틱 신중 하 게 손질된 팁을 사용 하 여. 각의 센터에서 단일 매트릭스 "드롭"를 만들기의 목표와 함께 천천히, 플라스틱. 드롭 구형, 남아 있어야 하 고 우물의 측을 터치 하지 말아야. 접시를 이동할 때 이러한 방울 방해 방지 하는 것 너무 신중 할.
- 고체까지 30 분 동안 37 ° C, 5% CO2 지하실 멤브레인 매트릭스 방울을 품 어.
- 조심 스럽게 플라스틱 500 µ L 차별화 미디어의 각 음에 매트릭스 드롭 방해 하도록 하지. 행렬 삭제 하 고 필요한 경우 더 추가 미디어 그냥 커버를 확인 합니다.
8. 분화 및 성숙 HNE Spheroids
- 부드럽게 잘;에서 모든 미디어를 발음 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여, 남겨진 어떤 spheroids 가능한 남아 있을 수 있습니다 하지만 행렬의 그 부분에 spheroids을 파괴할 것 이다 매트릭스를 발음 하지 마십시오.
- 부드럽게 신선한 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 행렬 주위 잘 차별화 미디어의 500 µ L를 추가 합니다. 피펫으로와 매트릭스를 터치 하지 고 매트릭스 드롭 방해 하지 마십시오.
- 37 oC에 인큐베이터과 지속적인 성장을 위한 5% CO2 spheroids를 반환 합니다. 반복 단계 8.1부터 8.3 세 번 매주.
- 매일 20 X에는 거꾸로 한 현미경 아래에서 회전 타원 체 형태를 평가 합니다. Spheroids 도금의 3-5 일 안에 형성 하 고 약 10 일 이내 만기에 도달 해야 합니다.
9. pretreat, 자극, 및 분석을 위한 HNE Spheroids 이미지
- 앞에서 설명한30영상 전에 원하는 대로 spheroids pretreat
참고: VX809 전처리에 대 한 이미징 이전 48-72 h에 대 한 미디어 VX809의 3 µ M를 추가 합니다. 믹스 1 µ L 10 m m의 VX809 주식 ( 자료 표참조)이이 농도 대 한 미디어의 3.3 ml에서. - 각 변경 spheroids 이미징 하기 전에 전처리 (8.1-8.3 단계)를 포함 한 신선한 차별화 미디어의 1 mL에 spheroids의.
- 신선한 자극 약물 솔루션 (산림, 3-isobutyl-1-methylxanthine [IBMX], VX770, 및 CFTR 억제제 172 [Inh172]) 주식 ( 자료 표참조)를 준비 합니다. 산림/IBMX 단일 레이블이 1.5 mL 튜브에에서 살 균 물의 98 µ L를 각 주식의 1 µ L를 추가 합니다. VX770 및 Inh172에 대 한 별도 레이블된 1.5 mL 튜브에 살 균 물의 99 µ L를 각 주식의 1 µ L를 추가 합니다. 각 테스트에 대 한 솔루션의 50 µ L에 대 한 수 있도록 전체 볼륨을 확인 합니다. Biosafety 내각에서 무 균 조건 하에서 솔루션을 준비 합니다.
- 37 ° C, 5% CO2, 전자 이미지 캡처 소프트웨어와 XY 조정 위한 기계적인 단계는 거꾸로 한 현미경에 장착 된 설정 incubated 챔버를 회전 타원 체 격판덮개 전송. 현미경과 카메라, 뿐만 아니라 이미징 컴퓨터를 켭니다.
-
한 우물에 spheroids의 초기 이미지를 캡처하십시오.
- 이미지 캡처 소프트웨어 (아래 방향에 대 한 Slidebook 5.5)를 엽니다. 초기화 되 면 "파일" 다음 "새로운"을 클릭 하 여 새 파일을 엽니다. 그에 따라 파일 이름을 지정 하 고 "저장"을 클릭 합니다.
- 조심 스럽게 문화 접시 뚜껑을 제거 하 고 목표를 통해 하나의 매트릭스 드롭 센터.
- Starting 매트릭스 드롭의 상단에, 이동에 20 배 확대 현미경 접 안 렌즈와에서 spheroids를 찾을. 위쪽 및 아래쪽 넓은 포인트 영역을 잡으려고 집중 한다. 주석을 다시 영상 후 식별을 매트릭스 드롭의 지도에 각 회전 타원 체의 위치.
- 소프트웨어에서 "이미지 캡처"를 클릭 합니다. 노출, "수동"을 선택 하 고 입력 50 양 다른 설정이 적절 한지 확인 (빈 요소: 1 x 1, w: 512, h: 512, X 및 Y 오프셋: 0). (예를 들어, 회전 타원 체 1 기준) "이름" 상자에 입력 하는 각 이미지에 대 한 적절 한 이름을. "시작" 라이브 이미지 "" 초기 이미지 저장을 클릭 합니다.
- 9.5.1-9.5.4 단계를 반복 하 여 목표 수에 도달 하거나 전체 매트릭스 드롭 이미지.
그러나 참고: 그룹 차이와 같은 몇 가지 조건 당 3-5 spheroids로 검출 될 수 있다,, 그것은 조건 증가 당 10 이상의 spheroids 이미지를 우리의 실천 되고있다. 분석 결과의 변화는 예를 들어 과목 당 8-10 spheroids의 샘플 "대표 결과" 섹션의 그림 2 에서 보여 줍니다.
-
Spheroids를 자극.
- 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 행렬을 방해 하지 않도록 주의 복용 잘 내 미디어에 적절 한 자극 약물의 50 µ L를 추가 합니다.
참고:이 사진 희석 (미디어의 500 µ L로 50 µ L), 최종 약물 농도 됩니다: 산림 10 µ M, IBMX 100 µ M, VX770 1 µ M, Inh172 10 µ M. - 캠프만, 유일한 산림/IBMX을 추가 합니다.
- 캠프 + VX770, 2 분 후 산림/IBMX 처음, 다음 VX770을 추가 합니다.
- Inh172 추가 금된 조건에 대 한 첫 번째, 다음 2 분 후 산림/IBMX.
- 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 행렬을 방해 하지 않도록 주의 복용 잘 내 미디어에 적절 한 자극 약물의 50 µ L를 추가 합니다.
- 자극, 직후 회전 타원 체 1 h timelapse 이미징 하 여 붓기를 모니터링 합니다. 소프트웨어에서 "이미지 캡처"를 클릭 합니다. "Timelapse"를 클릭 하 고 시작 timelapse 간격 30 s 기간 60 분 적절 한 이름 입력 하 고 "저장"을 클릭 합니다를 설정.
참고: 표준 timelapse 이미지를 캡처하는 단일 회전 타원 체의 모든 30는 높은-품질의 비디오를 보장 하는 s. 또는, 전체 음 (예: 4 X), 그리고 원하는 경우 캡처한 적은 이미지의 낮은 확대 캡처를 수행 합니다. 자동화 된 단계를 사용 하는 경우 미리 정의 된 좌표;를 사용 하 여 모든 spheroids의 timelapse 수행 그렇지 않으면, 붓기의 질적 검토를 제공 하 고 (예를 들어, 매트릭스는 우물에서 분리) 이미지 중에 아무 체계적인 문제가 발생 되도록 timelapse spheroids의 하위 집합을 사용 합니다. -
즉시 완료 되 면 1 시간 timelapse 이미지, (당 9.5 단계) 모든 spheroids의 포스트 자극 이미지 캡처 단계 9.5.3에서에서 만든 지도 사용 하 여.
- 초점의 동일한 비행기 (셀, spheroids, 또는 파편을 크게 포위의 초점 품질이이 과정을 촉진) 후속 이미지 사용은 되도록 사전 자극 이미지를 참조 하십시오.
- 단계 (예를 들어, 회전 타원 체 1 후 자극) 9.5.4에서에서 쌍된 주석으로 파일을 저장 합니다.
참고: spheroids를 계속 수 있습니다 즉시 timelapse, 후이 단계를 완료.
- 신선한 차별화 미디어와 잘 미디어는 이미지를 교체 합니다.
- 각 잘/조건, 실험 조건에 대 한 표시 자극 약물을 조정에 대 한 9.5 9.9 통해 단계를 반복 합니다.
- 모든 영상 완료 되 면, 37 ° C, 5% CO2배양 기에 spheroids를 반환 합니다.
참고: incubated 현미경 챔버의 불 임에 따라 spheroids의 포스트 자극 오염 수 매우 일반적. 교차 오염 위험을 최소화 하기 위해 별도 인큐베이터에서 이미지 spheroids를 유지 하거나 이미징 후 즉시 spheroids를 삭제 합니다.
10. HNE 회전 타원 체의 이미지 분석
- 이미지 분석 소프트웨어와 호환 되는 형식에 모든 캡처된 이미지를 내보냅니다. 소프트웨어에서 "보기", "수출", 위에 오도록 하 고 "기본 플레이의 모든 이미지로 TIFF..."를 선택 합니다. 하드 드라이브 또는 분석에 대 한 플래시 드라이브에 저장 합니다.
참고: A 상업 분석 소프트웨어 (자료 테이블) 및.tiff 파일 잘 수행 하 고 여기, 비록 분석 또한 수행할 수 있습니다 다른 플랫폼을 사용 하 여 설명 되어 있습니다. 파일 이름을 지정할 때 직원 이미지 분석 실험 조건에 눈을 멀게 하지만 어떤 이미지는 해당 분석 되도록 (사전 및 사후 자극) 쌍의 인식 해야 합니다. -
분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 회전 타원 체 이미지의 luminal 지역 윤곽을 그리 다 및 데이터 분석 소프트웨어 내보내기 합니다.
- 오픈 분석 소프트웨어입니다. 클릭 "파일", 다음 "열기" 및 회전 타원 체 이미지가 포함 된 파일 폴더로 이동 합니다. 분석에 대 한 모든 이미지를 선택 하 고 "열기"를 클릭 합니다.
- "측정"을 클릭 하 고 "지역 측정"을 선택 합니다. 지역 측정 대화 상자 내에서 droptab "구성"을 선택 하 고 "이미지 이름" 및 "영역" 상자 검사 됩니다 확인 합니다.
- "로그"를 클릭 하 고 "데이터 로그 열기"를 선택 합니다. 클릭 "확인" 대화 상자와 이름 데이터 로그 파일에 따라 (예를 들어, 조건이 X, 날짜). 이 스프레드시트에 모든 측정을 옮길 것 이다.
- "추적 영역" 도구 단추를 선택 하 고 신중 하 게 추적 하는 분석에 대 한 첫 번째 이미지에서 회전 타원 체의 루멘. 지역 측정 대화 상자에서 Excel로 측정 기록에 "로그 데이터"를 클릭 합니다.
- 10.2.2-10.2.4 단계를 반복 하 여 모든 spheroids 분석.
- 백분율 변경 계산 (100 * [게시물-stim-기준선] ÷ 기준) 각 개별 회전 타원 체에 대 한 기준선에서 luminal 지역에서 쌍 이미지 및 분석에 대 한 데이터를 컴파일합니다.
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Representative Results
HNEs 문화 접시를 연결 하 고 시드;의 72 h 내의 셀의 작은 섬 형성 한다 1 주일에 좋은 고 가난한 섬 형성의 예는 각각 그림 1A 및 1B에 표시 됩니다. 이 섬 15-30 일의 과정을 통해 요리를 확장 해야 합니다. 작은 또는 차선 샘플 더 오래 걸릴 수 있습니다 및 종종 유용한 spheroids를 생성 하지 것입니다. 전염 성 요원으로 오염 깊은 노란색/흐린 미디어, 문화 접시를 연결할 셀의 실패 및 곰 팡 이/세균의 직접 시각화로 입증 됩니다. 모든 오염 된 문화 교차 오염을 피하기 위해 즉시 폐기 해야한다.
지하실 막 매트릭스에 문화의 첫 번째 3-4 일 이내 작은 낭 성 구조 행렬에서 양식 하기 시작 한다. 이 얇은 벽과 luminal 표면 보여주는 그대로 spheroids로 약 10 일 동안 성숙 합니다. 설명된 밀도에서 도금, 성공적인 문화 매트릭스 드롭 당 50-100 spheroids 포함 됩니다. 루멘 (그림 1C) 상대적으로 취소 될 수 있습니다 또는 세포질 파편과 점액 (그림 1D);으로 가득 전 야생-타입 CFTR (wtCFTR)와 함께 spheroids 및 CF spheroids에서 후자에 더 일반적입니다. 그림 1C 및 1d spheroids의 luminal 지역 윤곽을 그리 다 마스크 각각 그림 1E 에 1 층, 시연입니다. 제대로 형성/실패 회전 타원 체 문화의 예는 그림 1G 에 1 시간제공 됩니다.
야생 유형 및 F508del CFTR homozygous HNE spheroids에 대 한 대표적인 기능 데이터는 에서처럼 그림 2A 및 2B, 각각; 이 데이터는 대표 > 야생 유형 및 F508del CFTR homozygous 과목30에서 10 독특한 HNE 샘플. 즉, 기능적인 CFTR와 spheroids 역 기능적인 CFTR 팽창 훨씬 적은 반면, 팽창 또는 축소 될 수 있습니다. 특히, spheroids wtCFTR 과목에서 한 시간 이상 팽창 한다 자극, 그리고 해야 덜 팽창 또는 수축 자극 CFTR 억제제 Inh172 존재 하는 경우. 반대로, homozygous F508del CFTR에 대 한 주제에서 spheroids 해야 하거나 축소 또는 팽창 아주 약간 증가 붓기 (또는 덜 축소) 약리학 CFTR 변조기 VX809와 VX770로 수정 하는 경우. 내와 동일한 유전자 형의 주제 사이 회전 타원 체의 이전 분석 CFTR genotypes 및 반복된 측정30에 겸손 한 다양성의 기능 분리를 보여 줍니다.
| 미디어 구성 요소 | 재고 솔루션 | 금액 | 스토리지 |
| 확장 미디어 | |||
| DMEM F-12 영양소 혼합 "기본 미디어" / | 사용으로 | 2 x 500 mL 용기 | 제조 업체 만료 날짜까지 4 º C에 저장 |
| 소 태아 혈 청 | 사용으로 | 50 mL | 제조 업체 만료 날짜까지-20 º C에 저장 |
| 콜레라 독 소 | 살 균 물의 1 mL에서 10 mg | 1 Μ L | 6 개월까지-20 º C에서 재고를 저장하시오 |
| 표 피 성장 인자 | 살 균 물의 1 mL에서 500 µ g | 20 Μ L | 6 개월까지-20 º C에서 재고를 저장하시오 |
| 날린 | 메 마른 물 400 µ L에서 0.4 mg | 전체 400 µ L 약 수 | 각 배치와 함께 신선한 확인 합니다. 분말 제조 업체 만료 날짜까지 실내 온도에 저장 |
| 아데닌 | 살 균 물의 1 ml 24 mg | 전체 1 mL aliquot | 각 배치와 함께 신선한 확인 합니다. 분말 제조 업체 만료 날짜까지 실내 온도에 저장 |
| Y-27632 | 살 균 물의 1 mL에서 3.2 밀리 그램 | 전체 1 mL aliquot | 각 배치와 함께 신선한 확인 합니다. 분말 제조 업체 만료 날짜까지-20 º C에 저장 |
| 항생제 미디어 | |||
| 암포 B | 사용으로 | 1.2 mL | 제조 업체 만료 날짜까지 4 º C에 저장 |
| Ceftazidime | 살 균 물의 1 mL에서 15 mg | 전체 1 mL aliquot | 각 배치와 함께 신선한 확인 합니다. 분말 제조 업체 만료 날짜까지-20 º C에 저장 |
| Tobramycin | 살 균 물의 1 mL에서 15 mg | 전체 1 mL aliquot | 각 배치와 함께 신선한 확인 합니다. 분말 제조 업체 만료 날짜까지-20 º C에 저장 |
| Vancomycin | 살 균 물의 1 mL에서 15 mg | 전체 1 mL aliquot | 각 배치와 함께 신선한 확인 합니다. 분말 제조 업체 만료 날짜까지-20 º C에 저장 |
표 1: 확장 및 항생제 미디어의 구성 요소.
| 미디어 구성 요소 | 재고 솔루션 | 금액 | 스토리지 |
| DMEM F-12 영양소 혼합 "기본 미디어" / | 사용으로 | 2 x 500 mL 용기 | 제조 업체 만료 날짜까지 4 º C에 저장 |
| Ultroser-G | 동결 건조 된 Ultroser-G의 단일, 20 mL 병에 살 균 물 20 mL | 전체 20 mL aliquot | 각 배치와 함께 신선한 확인 합니다. 분말 제조 업체 만료 날짜까지 4 º C에 저장 |
| 태아 클론 II | 사용으로 | 20 mL | 제조 업체 만료 날짜까지-20 º C에 저장 |
| 펜 Strep | 사용으로 | 10 mL | 제조 업체 만료 날짜까지-20 º C에 저장 |
| 소 뇌 추출 | 사용으로 | 2.48 mL | 제조 업체 만료 날짜까지-20 º C에 저장 |
| 처리가 | 사용으로 | 250 Μ L | 제조 업체 만료 날짜까지-20 º C에 저장 |
| 인슐린 | 사용으로 | 250 Μ L | 제조 업체 만료 날짜까지-20 º C에 저장 |
| 방법 | 사용으로 | 15 Μ L | 제조 업체 만료 날짜까지 실내 온도에 저장 |
| 피 네 프 린 | 살 균 물의 1 ml에서 2.75 밀리 그램 | 전체 1 mL aliquot | 각 배치와 함께 신선한 확인 합니다. 분말 제조 업체 만료 날짜까지 4 º C에 저장 |
| Triiodothyronine | DMSO의 50 µ L에서 8.4 mg | 전체 50 µ L 약 수 | 각 배치와 함께 신선한 확인 합니다. 분말 제조 업체 만료 날짜까지-20 º C에 저장 |
| 날린 | 에탄올의 1 mL에 7.24 mg | 1 Μ L | 6 개월까지-20 º C에서 재고를 저장하시오 |
| Phsophoryletheanolamine | 살 균 물의 1 mL에서 35.25 mg | 1 Μ L | 6 개월까지-20 º C에서 재고를 저장하시오 |
| Retinoic 산 | DMSO의 1 mL에 3 mg | 1 Μ L | 6 개월까지-20 º C에서 재고를 저장하시오 |
표 2: 차별화 매체의 구성 요소입니다.
그림 1 : HNE 확장과 HNE Spheroids의 구조상 특성. 도금 후 7 일 촬영 HNE 확장 문화의 명시 이미지 설명 성공 (흰색 화살표, 패널 A)와 실패 (패널 B) 급지대 구와 배경에 HNE 식민지 형성. 성공적인 wtCFTR 및 F508del homozygous spheroids 각각 C 와 D, 패널에 표시 됩니다. C/D에서 spheroids의 luminal 지역 윤곽을 그리 다 마스크 각각 E 와 F, 패널에 제공 됩니다. 실패 한 회전 타원 체 문화 작은, 분열 세포 파편 (패널 G)에 의해 특징 및 셀 (패널 H)의 덩어리로 무질서. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : HNE Spheroids의 기능 특성. 산림/IBMX와 함께/없이 CFTR 억제제 Inh172 패널 (A)에 표시 됩니다 각 포인트의 존재와 함께 자극 하는 경우 단일 기증자 로부터 wtCFTR spheroids의 대표 기능 응답을 단일 회전 타원 체에 대 한 응답을 나타냅니다. 산림/IBMX와 함께/없이 VX809와 VX770의 존재와 함께 자극 하는 경우 단일 기증자 로부터 F508del homozygous spheroids의 대표 기능 응답 패널 (B)에 표시 됩니다. 오차 막대 = SEM. * * p < 0.01; p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜 환자 파생 코 셀 회전 타원 체 문화 CFTR 함수의 개별, 구체적인 모델을 생산할 수의 생성을 설명 합니다. 밀접 하 게 어려움을 피하기 위해 참석 해야 하는 과정에서 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 먼저 환자의 코에서 좋은 샘플 인수가입니다. 좋은 샘플 있어야 > 50000 세포, 점액/파편, 제한 하 고 (비록 성공 또한 쉽게 달성로 얼음에 배송) 4 h 이내 처리에 대 한 준비. 연습 연구 직원을 퀴 렛 또는 브러시 샘플 획득은 필요는 그들의 편안 함을 극대화 하기 위해 하나 또는 두 개의 공급자의 손에 초기 샘플 수집을 초점에 의해 촉진 된다. 둘째, 좋은 청소/살 균 기술 모든 조직 문화 단계에 필수적 이다. 모든 HNE 문화에 대 한 우리의 경험, 실패의 기본 모드는 기본 예제와 다른 성장 문화 인큐베이터에서 복잡 하 게 수 세균 이나 곰 팡이 오염. 문화 만성 감염 (예를 들어, CF) 과목의 증가이 위험, 따라서 성공 깨끗 하 고 별도 문화를 유지 하는 기능에 경첩. 우리의 연습 유지 하는 한 인큐베이터만 감염 경향이 문화에 대 한 별도 처음 5-7 일 이내에 실수로 오염에서 보호 하는 더 오래 된, 성공적인 문화. 셋째, 그것을 밀접 하 게 보고 셀 확장 단계 동안 overconfluence을 피하기 위해 중요 하다. 셀 전체 합류에 도달 수 있습니다, 경우 문화 노화 될 또는 셀 죽 게 하 고 분리 하기 시작 합니다 것입니다 위험이 있다. 마지막으로, spheroids로 셀 도금 때 철저 하 게 매트릭스를 통해 세포를 분산 하 고 균등 하 게 분산된 샘플 접시에 중요 하다. 어느 이상-또는 아래-population 매트릭스 방울의 이어질 것입니다 문화 실패, 그리고 세포의 큰 덩어리는 성공적인 spheroids를 생성 하지 않습니다.
이 프로토콜을 구현 하는 동안 조사는 몇 가지 일반적인 문제가 발생할 수 있습니다. 오염, 점액과 깨끗 한 문화 기술 없이 좋은 초기 샘플을 조달 하 여, 위에서 언급 한 대로 피할 가장 이다. 문화 확장을 통해 성공 하는 경우 몇 가지 문제가 발생 했을 수 없는 차별화 된 구체 형성 된다. 매트릭스 빈 주로 나타나면 그것은 가장 가능성이 셀에서 시드 했다 너무 낮은 밀도; 후속 시도의 시드 밀도 약 20% 증가. 반대로, 매트릭스 "더러운" 풍부한 세포 파편 나타납니다, 그것은 가능성이 높습니다 셀에서 너무 시드 했다 높은 밀도, 그리고 후속 시도의 약 20% 감소 하는 시드 밀도 사용 해야 합니다. 이후 시드 먹이, 및 유지 보수의 일반적인 합병증은 문화 선박에서 매트릭스의 분리 이다. 이 지나치게 매체 교환에 의해 발생 하 고 신중 하 게 하 고 수동으로 1 mL 피 펫, 벽 흡입 하지와 함께 미디어를 변경 하 여 피할 수 있습니다. 발생 하는 경우 구체 여전히 자극 하 고 이미지로, 매트릭스 "수레" 우물에서 이미징, 우물 내에서 spheroids의 신중한 매핑이 필요로 하는 동안이 어려울 수 있습니다 하지만 수 있습니다.
수 사관 수 있습니다 그들의 실험실의 요구에 따라 프로토콜을 몇 가지 수정을 추구 하 고 있다. Spheroids의 높은-해상도 이미징, 우리 이전 광학 유리 옵션, 35 m m 유리 하단 요리 또는 챔버 슬라이드를 포함 하 여 4-잘 접시 대체 했습니다. 이 spheroids의 고해상도, 라이브 영상에 대 한 수 있지만 처리량을 줄일 수 있습니다. 또는 처리량을 증가, 다른 혈관 (예를 들어, 24-잘 문화 접시)으로 매트릭스에 셀의 작은 aliquots는 시드할 수 있습니다. 우리의 경험에서는, spheroids; 우물의 바닥에 시트를 형성 하는 반대 "물방울" 형태로 매트릭스와 함께 가장 성장 따라서, 우리는 최고 했다 적어도 25 µ L. 수 사관 들의 방울이 성공 미디어 diluting 하 여 매트릭스의 밀도 변경 하실 수 있습니다. 이 매트릭스 분석 결과의 비용을 개선 하는 데 필요한 총 금액을 줄일 수 있습니다. 그러나이 또한,, 회전 타원 체 구성을 변경할 수 있습니다. 우리의 이전 경험에서 지하실 멤브레인 매트릭스 이어질의 낮은 농도 "셀 꼭대기 아웃" 형태에서 spheroids의 대형에 부분적 또는 완전 한 회전 타원 체 구조 변경. 따라서, 어떤 프로토콜 변경 매트릭스 농도 통해 생성 하는 spheroids 평가 되어야 한다 신중 하 게 형태에 대 한 기능 테스트를 시도 하기 전에. 마지막으로, 다른 자극 또는 억제 약 또는이 약의 다른 농도 고용 수 있습니다. 산림, IBMX, 및 Inh172 알리 문화31에 이전 경험을 바탕이 농도에서 우리의 연구에 대 한 선정 됐다. 다른 약물 (예를 들어, isoproterenol 자극, 억제에 대 한 GlyH101에 대 한)를 사용 하 여 더 나은 수 사관의 연구에 적용할 수 있습니다. 그러나 마찬가지로, 산림, IBMX, 또는 Inh172의 다른 농도 사용 하 여 분석 결과의 동적 범위를 변경할 수 있습니다, 그리고, 우리는 체계적으로 테스트 되지 이러한 옵션.
기존 비보 전 환자 파생 CFTR 분석 실험의 수를 감안할 때, 설명된 모델은 몇 가지 주요 이유로 주목할 만한입니다. 첫째, 호흡기 조직의 쉽게 얻은 소스로 코 셀에 대문자로 바꿉니다. HNE 조달 거의 모든 설정에서 최소한의 교육으로 안전 하 게 수행할 수 있습니다 (클리닉, OR, 연구 방문) 모든 연령 그룹25에. 이 강력한 샘플 조달을 용이 하 게 하 고 성장 어려움 또는 오염 필요한 경우 샘플링을 반복 합니다. 그러나 장 organoids에 비해 HNE spheroids 특징 덜 잘 나타나고 기 조직 대신 호흡기의 사용, 현재 형태로 작은 동적 범위를가지고 있을 수 있습니다 주요 장점은 여러 CF 질병 드라이버 (예: mucociliary 정리, 상피 나트륨 채널 식)에 해당 되지 않습니다. HNE 셀의 평면, 알리 문화에 반대 하는, spheroids 빠르게 성장 하 고 생리 과정 (유체 항상성) 전기 생리학 혼자32보다 더 관련성이 있을 수 있습니다 측정 조건의 vivo에서 , 더 많은 대표를 있을 수 있습니다. 테스트 샘플 조달에서 시간을 개선 하 여 잠재적인 오염 감소, 따라서 문화 성공의 가능성을 증가. 마지막으로, 모델의 3 차원 자연 소설 / 알리 문화 (예를 들어, luminal 점액 추적, 차별화의 급속 한 연구에서에서 가능 하지 않은 기도 개발 형태에 있는 연구의 보완 줄 의무가 있을 수 있습니다. 등)입니다.
CFTR 함수의 분석으로 HNE spheroids 몇 가지 키 제한 있다. 첫째,이 분석 결과 상대적으로 낮은 처리량을 남아 있다. 현재 메서드를 사용 하 여 이미지 수집 각 문화 조건에 대해 한 시간 이상 걸립니다 그리고 분석 조건 마다 추가 20-30 분 걸립니다. 이 측정 (자체에이 중복이 분석이 결과의 감도의 한계를 나타낼 수도 있습니다)을 더 많이 필요로 하는 특정 조건 (같은 그림 2A에서 설명), 사이 오버랩의 정도 의해 복합입니다. 따라서, 4-6 조건으로 단일 실험 완료 거의 2 일 필요합니다. 자동화 된 이미지 캡쳐 및 분석;의 방법을 채용 하 여 처리량을 향상 시킬 수 있습니다. 이러한 적응 현재 진행 중에 있습니다. 둘째,이 모델에는 매트릭스, 비싼 될 수 있는 많은 양의 필요 합니다. 위에서 설명 했 듯이, 매트릭스의 희석이이 장애물을 극복 도움이 될 수 있지만 회전 타원 체 형태 변경에서 성장 매트릭스 것입니다 가능성이 결과에서 변경으로 주의 촬영 해야 합니다. 셋째,이 모델, XY 평면에서 회전 타원 체 측정 및 바이어스 소개 Z 평면에 붓기가 무시에 의존 합니다. 동안 이전 재현성 분석 안심, Z-비행기 볼륨30을 계산 하기 위해 스캔 자동된 이미징 사용 하 여이 단점을 극복 될 수 있습니다. 마지막으로, 그리고 가장 중요 한 것은, 개별 주체의 vivo에서 약물 반응에 대 한 회전 타원 체 응답 넥타이 광범위 한 작업은 아직 완료. 이 상관 관계의 부재, 약속-동안-모델의 예측 값 명확 하지 않습니다.
생성 및 HNE spheroids의 분석 비보 전 분석 개별 CFTR 활동 및 변조, 궁극적으로 약물 반응의 전 임상 모델으로 도움이 될 수 있습니다. 또한, CF 질병 심각도 광범위 한 다양성을 감안할 때, 이러한 개별적인된 모델 피사체의 독특한 기도 microenvironment에 제공할 수 있습니다. 이 방법에서는, 같은 모델은 광범위 한 CFTR 생물학 및 질병이 이해에 원조의 연구에 대 한 유용할 수 있습니다. 개별 CFTR 함수의 다른 유사한 모델 및이 모델의 미래 사용 약속 CFTR 생물학 실험실, 그리고 개인 드라이브를 더 잘 이해 하 고 정밀 의학 병원에서 보유 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 낭 성 섬유 증 재단 치료제에 의해 지원 되었다, CLANCY14XX0, 번호를 부여 하 고 낭 성 섬유 증 재단을 통해 CLANCY15R0 번호를 부여. 저자는 크리스티나 레이 환자 모집 및 규제 감독 그녀의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 저자 또한 HNE 문화 능력의 세대에 지원 낭 성 섬유 증 재단에서 지 원하는 HNE 작업 그룹을 감사 하 고 싶다: 프레스 톤 Bratcher, 캘빈 면, 마르티나 Gentzsch, 엘리자베스 Joseloff, 마이클 Myerburg, 데이브 니콜스, 스콧 Randell, 스티브 로우, G. 마티 솔로몬, 그리고 캐서린 Tuggle
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
| 150 mL Filter Flask | Midsci | TP99150 | To filter Media |
| 15 mL Conical Tube | Midsci | TP91015 | |
| 1 L Filter Flask | Midsci | TP99950 | To filter Media |
| 35 mm Glass-Bottom Dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Optional |
| 3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO |
| 50 mL Conical Tube | Midsci | TP91050 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Cell detachment solution |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | See Table 1 |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | See Table 1 |
| Bovine Brain Extract (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | See Table 2 |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | See Table 1 |
| Cell Scrapers 20 cm | Midsci | TP99010 | |
| CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO |
| Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | See Table 1 |
| CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cytology brush |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | Life Technologies | 11330-057 | Base Medium; See Tables 1 and 2 |
| Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | See Table 1 |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | See Table 2 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16.6 mM solution; See Table 2 |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | TCI America | E0084 | |
| Fetal Bovine Serum (high performance FBS) | Invitrogen | 10082147 | See Table 1 |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO |
| Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL. |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Collagen solution |
| HyClone (aka FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | See Table 2 |
| Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | See Tables 1 and 2 |
| Insulin, human recombinant, zinc solution | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL solution; see Table 2 |
| IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate |
| MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Irradiated murine embryonic fibroblasts |
| Metamorph 7.7 | Molecular Devices | Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote | |
| Olympus IX51 Inverted Microscope | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ for a quote |
| Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | See Table 2 |
| Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | See Table 2 |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | See Table 2 |
| Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Nasal curette |
| Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Discontinued | Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
| Tissue Culture Dish 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Tissue culture dish for expansion |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | See Table 1 |
| Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | See Table 2 |
| Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; See Table 2 |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
| Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL lypophilized powder; See Table 2 |
| Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | See Table 1 |
| VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO |
| VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO |
| Y-27632 Dihydrochloride ROCK inhibitor | Enzo LifeSciences | ALX-270-333-M025 | See Table 1 |
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