Summary
Burada tarif biz Candida albicans intradermal enjeksiyon sonra deri örnekleri histolojik ve moleküler analizi sağlayan bir protokol. Bu iletişim kuralı cilt yapısal bütünlüğünü korur ve doku-ikamet veya yeni alınan bağışıklık hücreleri gibi patojen dağıtım yerelleştirme için sağlar.
Abstract
Deri vücudun son derece genişletilmiş bir organdır ve bu geniş yüzeyi nedeniyle sürekli mikroorganizmalar için maruz kalmaktadır. Deri Hasari kolayca da buna karşılık, patojenler yayılması kan dolaşımına yol açabilir dermiste enfeksiyonlara yol açabilir. Anlama nasıl bağışıklık sistemi enfeksiyonları çok erken aşamada savaşır ve nasıl ev sahibi Patojenler ortadan kaldırabilir gelecekteki tedavi müdahaleler temelini ayarlamak için önemli bir adımdır. Burada biz bir model sırasında erken enfeksiyon patojen epitel bariyer yanı sıra bağışıklık yanıtı C. albicans tarafından elde edildi geçti zaman da dahil olmak üzere, meydana süreçleri görselleştirebilirsiniz Candida albicans enfeksiyon tarif işgali. Bu enfeksiyon model deri yanı sıra varlığı ve yerelleştirme patojenin sızmak bağışıklık hücreleri gösteren histolojik analizleri gerçekleştirmek için kullanılır. Enfeksiyon RNA çıkarma için işlenen sonra örnekleri topladı.
Introduction
İnsan vücudu mikroorganizmaların son derece yüksek bir numarası ile kaplıdır. Cilt yüzeyi neredeyse bir milyon bakteri başına santimetre kare1yaşam alanıdır. Bu sayı, ancak, cilt colonizes tam mikroorganizmaların çeşitli yansıtmak zorunda değildir. Bakteri ek olarak, insan vücudu hem mukozal ve cilt düzey2hayatta yapabiliyor C. albicans, dahil olmak üzere birçok mantar türü tarafından kolonize.
Son yıllarda, mantar enfeksiyonları ile tanısı insanların yüzdesi çok artmıştır. Bu çok immün kişi, yani, HIV-pozitif hasta ve kemoterapi ya da immünsupresif ilaçlar ile nakli3sonra gitti hasta sayısı yükseldikçe kaynaklanmaktadır. Amerika Birleşik Devletleri'nde yapılan bir gözetim çalışmada, Wisplinghoff ve ark. %9,5 nozokomiyal kan dolaşımına enfeksiyonların Candida türleri4tarafından kaynaklandığını gösterdi. Artan mantar enfeksiyonları ve kan dolaşımına enfeksiyonlar sırasında bulunan Candida türlerinin yükseltilmiş yüzde nedeniyle özellikle nedeniyle, nasıl bu patojen bağışıklık sisteminin kontrolü kaçar anlamak son derece olaydır önemli.
C. albicans Maya, blastospores, pseudohyphae ve5çevre koşullarına bağlı olarak hif gibi farklı morfolojik biçimlerde büyür şekilli bir mantar var. Hyphal haliyle C. albicans en yüksek invasiveness kapasitesini gösterir ve epitel6nüfuz yeteneği vardır.
C. albicans enfeksiyonlar birkaç deneysel yaklaşımlar kullanarak incelenmiştir. En yaygın enfeksiyon C. albicans Maya7İntravenöz enjeksiyon modelidir. Kan dolaşımına yaymak mantar yönetir önce ancak, bu model tüm işlemler bu olmasına göz önünde değil. Başka bir model C. albicans epiteli istila yeteneği yararlanır. Bu yöntem, olarak da bilinir zımpara kağıdı modeli8, Gaspari ve ark. 19989tarafından geliştirilmiş ve böylece stratum korneum C. albicansuygulamadan önce ortadan kaldırarak cildi aşındırmak için zımpara kağıdı kullanmayı oluşur. Bu yordam, böylece bu patojen invaziv yeteneklerini analizini etkinleştirme epitel, nüfuz mantar verir. Son olarak, diğer modelleri enfeksiyonlar gastrointestinal10 ve solunum yolları11 farklı çalışmalarda kullanılmaya başlandı.
(Olduğu gibi zımpara kağıdı modeli) bir yara oluşumu bağışıklık hücre işe alım ve harekete geçirmek, iyileşme süreci12teşvik etmek de dahil olmak üzere çeşitli yollar aktivasyonu neden olur. Bu alter veya maske bağışıklık yanıtı özellikle böylece sonuçları semptomlarıdır için önde gelen patojen karşı elde edildi.
Burada bir yöntemin ilk yara oluşumunu önler deri enfeksiyonu ve indüksiyon bazal inflamatuar ortamı açıklanmaktadır. Sağlam epitel yapısını korumak için biz doğrudan C. albicans hyphal haliyle derin derma enjekte et. Tek bir enjeksiyon hafif inflamasyon temin rağmen iltihap miktarı sınırlı ve sınırlı olduğu gibi kum kağıt modeli açık bir yara oluşumu ile karşılaştırıldığında. Biz burada tarif yaklaşım mantar enfeksiyonu ve mekanik zarar tarafından aşırı ve önceden varolan inflamatuar çevre kaçınırken yaymak için bağışıklık yanıtının çalışma sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) altında onaylanmış ve çocuklara hayvan kaynakları bölümü gözetimi altında işletilen hastane (kemer) Boston Çocuk Hastanesi'nde ya da İtalyan tarafından kabul edildi Sağlık Bakanlığı ve kurumsal hayvan bakımı Komitesi Üniversitesi Milano-Bicocca adlı altında gerçekleştirilen.
1. C. albicans hazırlık
- Kültür C. albicans, zorlanma CAF3-113, uridine (50 mg/L) 25 ° C'de ile takıma zengin Orta (Maya özü pepton Dekstroz (YEPD), %1 (w/v) Maya özü, % 2'si (w/v) Bacto pepton, %2 (w/v) glikoz) içeren tüpler Bu koşullar altında C. albicans bir Maya yetişir.
Not: klinik C. albicans zorlanma SC531413yalıtmak gibi diğer C. albicans suşları, kullanılabilir. Son zamanlarda ülseratif işlem doğuştan gelen bağışıklık sistemi14, teorik olarak, hücre duvarı bileşenleri ve yapısı, tutar her C. albicans zorlanma etkinleştirme tarafından indüklenen göstermiştir bu yana yanı sıra yetenek hyphal projeksiyonlar, köken için kullanılabilir. - Kültür bir hücre sayaç Çözümleyicisi'ni kullanarak hücresel konsantrasyon sayarak izlemek.
- Yaklaşık 8 x 106 hücre/mL bir konsantrasyon ulaştığında kültür hasat. Alternatif olarak, bir spektrofotometre OD600ölçmek için kullanın.
Not: Genellikle, OD600 değeri = 1 karşılık gelen 3 x 107 hücre/mL bir Maya konsantrasyon ama titrasyon tavsiye edilir. - Kültür YEPD-uridine orta, HEPES (50 mM, pH 7.5) bir arabellek Aracısı olarak kullanarak resuspend ve kültür 37 ° C'de hif oluşumu ikna etmek için kuluçkaya. 100 X büyütme, mikroskop altında hyphal oluşumu denetleyin. Hyphal görünür 5 h 37 ° C'de kültür sonra oluşumdur; Ancak, hyphal yüzde toplam kültür neredeyse % 95'i ulaştığında hücreleri 16 h 37 ° C'de kuluçka sonra kullanın.
- Hyphal konsantrasyonu hazırlanmasında daha da zenginleştirmek için santrifüj aliquots 3300 x g 5 dakika süreyle de kültürünün süpernatant atın ve 1 x 108 hif/mL bir konsantrasyon, steril PBS Pelet resuspend.
2. derin Dermal enjeksiyon
- 24 saat önceden enfeksiyon yordamı ketamin (80-100 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) mayi enjeksiyonu ile fareler anestezi ve bir elektrik kesme makinesi kullanarak fare kanadını traş et.
Not: etkin bir şekilde ele geçirdiler kadar fareler bir Isıtma lambası altında anestezi içeren herhangi bir işlemden sonra koyun. - Fareler için tıraş süreci nedeniyle herhangi bir inflamasyon önlemek 24 saat bekletin.
- 24 saat sonra tıraş yordam anestezi ketamin (80-100 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) mayi enjeksiyonu ile fareler.
- Pençe refleks fareler derin anestezi emin olmak için denetleyin. Pençe refleks sıkıca pençe pinching tarafından değerlendirmek. Anestezi sağlanır, hayvan acı hissetmez ve hareket etmez.
- C. albicans hif içinde son hacmi 50 µL/enjeksiyon, 5 x 106 hif/enjeksiyon için karşılık gelen bir 30 G x 8 mm iğne ile 0.3 mL insülin Ģırınga kullanarak derin derma enjekte.
- Traş kanadının cilt gergin derin derma doğrudan hacmindeki enjekte için iki parmak kullanarak çekin. Yukarı dönük olacak şekilde iğne eğimi ile 10-15 ° lik bir açı ile iğne yerleştirin.
- Bu açı ile patojen yaklaşık 300-500 µm derinliğe ile enjekte edilir. Enjeksiyon iyi performans sağlamak için kontrol enjekte birimi olduğunu bir yumru oluşturur bir kaç dk sonra enjeksiyon emilir.
Not: enjeksiyon yaklaşık 1 cm2/ olacak sonra çarpmak kurdu. Bu moleküler ya da histolojik analizler için belirlenen zaman noktada kaldırılacak alandır. - Birkaç dakika sonra emilir, enjeksiyon ile oluşan şişlik devam ederse bu yana daha az 24 h (önerilen) zaman puan için bir işaretleyici kalem ile enfeksiyon alanını işaretlemek. Ya ülser ya da bir kist açıkça görülebilir zaman puan için 24 saat veya daha fazla, bu adım gerekir, çünkü değil.
3. örnek toplama ve histolojik boyama için hazırlanması
- Kurumsal yordamlara göre fareler ötenazi.
- Cerrahi forseps kullanarak, eklenen sitenin daha önce marker kalemle işaretlenmiş sınırında cilt çek. Cerrahi makas kullanırken, virüslü sitesi işaretli çizgi takip deri kesim tarafından tüketim.
Not: deri yuvarlak uç makas kullanarak periton ayırmak dikkatli olun. - En iyi kesim ısı ile (OCT) bileşik, iç tarafı yukarı bakacak şekilde deri ile dolu bir tek kullanımlık temel kalıp ciltte bırakın. Bileşik beyaz hale gelinceye kadar örnek sıvı azot dondur. Yapmak değil Bu örnek zarar tamamen donmuş önce örnek kapak sıvı azot izin vermek.
Not: dikkat! 3.3 adım sırasında sıvı nitrojen korunmak için bir yüz kalkan giymek. - Hızla bunları saklamak-80 ° C'de örnekleri slayt hazırlama için hemen kullanılmayacaksa,
Not: Örnekleri-80 ° C'de süresiz olarak saklanır.
4. slaytların hazırlanması
- Örnek örnek ortasından başlayarak Histoloji dilimleri hazırlamak için ikiye böldüm.
- 5-µm ile bir cryostat kalın dilimler kesin.
Not: deri örnekleri için cryostat sıcaklığı-25 ° C'nin daha yüksek olmamalı Daha yüksek bir sıcaklık H-Ekim kısmi erime neden olur ve bu nedenle örnekleri doğru pozisyonda kesme işlemi sırasında saklanması değil. - Pozitif yüklü mikroskop slayt dilimleri toplamak için kullanın.
- Toplanan dilimleri yakında hazırlık sonra kullanılmazsa, bunları-20 ° C'de saklamak Bu noktada, dilimleri-20 ° C'de süresiz olarak depolanabilir.
5. Hematoksilen ve eozin boyama
- Slaytları Gill'in hematoksilen 4 dk. Yıkama için daldırma tarafından musluk suyu 5 min için çalışan slaytlar leke.
- Musluk suyu 5 dk. durulama için çalışan kullanarak slaytları slaytlar slayt 1 min. eozin Y çözüm daldırma tarafından yıkama leke distile su protokol devam etmeden önce.
- Seri olarak etanol çözümleri (% 50, % 70, %80, % 95, % 100) konsantrasyonları artan daldırma tarafından kurutmak. 15 slaytlarını sokmak her etanol çözüm s.
- Histolojik Temizleme Aracısı daldırma tarafından en az 2 dk slaytlarını temizleyin.
- Montaj orta ve kapak paket fişi kullanarak slaytları bağlayın.
- 40 X büyütme, mikroskop slayt tarayıcı ile slaytlar görüntülerini elde.
6. periyodik asit-Schiff (PAS) boyama
- Slaytları slaytlar musluk suyu 1 dk. için çalışan ≥99.5% aseton, oda sıcaklığında 1 dk. yıkama ile tamir et.
- Slaytları periyodik asit çözüm (1 g/dL) daldırma tarafından distile su 3 değişiklikler slayt 5 dk. yıkama leke.
- Slaytları Schiff'ın reaktif 15 dk. Yıkama için daldırma tarafından musluk suyu 5 min için çalışan slaytlar leke.
- 5 dk. yıkamak için musluk suyu 30 için çalışan slaytları slaytlar Gill'in hematoksilen daldırma tarafından leke s.
- % 100 etanol 3 değişiklikler daldırma tarafından slaytları kurutmak. 15 slaytlarını bırakın s her zaman.
- Histolojik Temizleme Aracısı daldırma tarafından en az 2 dk slaytlarını temizleyin.
- Montaj orta ve kapak paket fişi kullanarak slaytları bağlayın.
- Slaytları görüntülerini elde etmek mikroskop slayt tarayıcı ile.
7. örnek toplama ve RNA çıkarılması için hazırlık
- Kurumsal yordamlara göre fareler ötenazi. Deri örnekleri olduğu gibi adım 3.2 kaldırın.
- Reaktif asit guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform çıkarılması için 1 mL ile 2 mL ek-kapiler tüp örneklerinde bırakın.
Not: Burada protokol duraklatılmış ve örnekleri-80 ° C'de depolanan - Örnek yaklaşık 0.2 cm2 cerrahi forseps kullanarak parçalar halinde kesin.
Not: dikkat! Reaktifler RNA izolasyonu için çoğu toksik ve mutajenik. Adım 7,3 ve 7.4 gerekir duman başlık altında yapılması. - Alternatif olarak örnek 20 dakika süreyle 20 salınımlarını/s hızında bir boncuk fabrikası ile şut, mekanik bir çömlekçi kullanılabilir.
- Örneklerin etkili homojenizasyon bozulmamış deri parçalarının varlığı için bakarak kontrol edin. Örnekleri değil tamamen homojen Eğer bu adımı yineleyin.
- Örnekleri 16.000 x g 1 dk. tutun, supernatants RNA çıkarılması için santrifüj kapasitesi ve Pelet atın. Bu adımı kıl ve enkaz çıkarma sütunlar engelleyebiliriz ortadan kaldırmak için gerçekleştirilir.
- RNA arıtma sütunları14kullanarak RNA çıkarma ile devam edin.
- Bir spektrofotometre RNA arıtma ve toplama değerlendirmek için kullanın. RNA özleri cDNA hazırlık için hemen kullanılmazsa, örnekleri-80 ° C'de depolayın
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doğrudan içinde derin derma patojen sızdırma yoluyla yapısal morfolojisi doku sağlam (Şekil 1A) kalır.
Cilt yapısal bütünlük bakımından bağışıklık hücreleri tespiti ve enfeksiyon yerinde onların yerelleştirme sağlar. Şekil 1B adımında gösterilen yüksek büyütme ortaya koymaktadır apse esas olarak enfeksiyon sitesine onun doğumdan tarafından patojen yayılmasını içeren polimorfonükleer lökosit (PMCs) oluşmaktadır. PMCs, alımı gibi nötrofil, böylece mantar doku14içinde yayılmasını önleme apse oluşumu sağlar. Yüksek büyütme (Şekil 1 c, D) nasıl çevresinde infektif da PMCs içinde zenginleştirilmiş göster.
Yapısal bütünlük tutarak, patojen yerelleştirme enfeksiyon sırasında belirlenebilir. C. albicans, patojen tanımlaması hücre duvarına polisakkaritler yükseltilmiş içeriğini yararlanarak PAS boyama, kullanarak hangi mantar için mor-kırmızı renk verir gerçekleştirildi. Şekil 2Agösterildiği gibi PAS boyama açıkça patojen granülosit14işe alma tarafından kurulan apse içinde sınırlı olduğunu gösterir. C. albicans daha yüksek büyütme oranında (Şekil 2B) açıkça görülmeye başlıyor ve nekrotik ve bağışıklık hücreleri tarafından çevrili olmak görünür.
Yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak, enfeksiyon süreci ve bunun sonucunda inflamasyon zaman içinde izlenebilir. Çok Başlangıçta, bağışıklık hücre, işe alım (Şekil 1A ve Şekil 3A) bir abse oluşumuna yol açar. Deri dokusu Analizi kadar uzun zaman görselleştirildiği 48-72 h, cilt yapıları bozulma ve bir yara oluşumu (Şekil 3B, C). Bu yapı oluşumu patojen14sınırdışı izleyen iyileşme nedeniyle aşamasıdır.
Ülser oluşumuna yol açan süreç birkaç gün sonra enfeksiyon için takip edilebilir. Şekil 4Agörüldüğü gibi C57BL/6 vahşi tipi fareler zaman içinde artar ülseratif bir işlemi görüntüler. Yaklaşık 70-%80 farelerin ülser 72 h oluşumu enfeksiyon sonra göster. Deneysel değişkenlik nedeniyle en az 8 fareler her deneyde kullanılmalıdır. İstatistiksel analiz için en az 8-10 fareler her ülserasyon puanı için farklı genotip veya tedavi karşılaştırma kullanmak için tavsiye edilir. Bu durumda, hatta küçük farklılıklar görünür olmalıdır. Ülseratif sürecinin açıklayıcı resimler resim 4B' gösterilir. Spesifik tedaviler veya genetik eksiklikleri, ülser oluşumu azaltılabilir ve/veya14kaldırıldı. Bazı durumlarda, ülser yerine bir kist, Şekil 4 ciçinde gösterildiği gibi oluşur.
Hematoksilen ve eozin ve boyama PAS dışında slaytlar için ya belirli hücresel işaretleri veya daha iyi görmek için diğer immunohistokimyasal stainings ile boyanabilen: kollajen lifleri; sitokin/kemokinler konumu doku içinde; ve bağışıklık hücre kimliğini ve kayma dağıtım.
Histolojik hazırlık yanı sıra örnekleri de moleküler analizi için kullanılabilir. Tüm enjeksiyon yeri, histolojik hazırlıklar gelince, güvenliğe ve RNA çıkarma için işlenir. RNA çekme--dan doku çalışma ve bu genlerin upregulated tanımlaması virüsü ile enfeksiyon sırasında sağlar. Daha iyi histolojik analizi ile birlikte önemli bir araç karakterize bağışıklık yanıtının patojen ve onun yönetmelik erken ve geç aşamalarında karşı elde edildi türünü örnekleri moleküler analizleri için işlemek için olasılık var meydan okuma sonrası14.
Şekil 1: bakım cilt Morfoloji ve hücresel yerelleştirme. (A)tüm katmanlar korunur. Epitel, adipositler ve kas hücreleri kolayca tanınabilir. (B) polimorfonükleer lökosit (okla işaretli)-ebilmek var olmak identified içinde apse. (C, D) Yüksek büyütme apse çevresi polimorfonükleer lökosit (oklar) varlığı göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: C. albicanstanımlaması. (A) C. albicans PAS boyama ile doku içinde algılandı. (B) daha yüksek büyütme mor, lekeli mantar, daha iyi görmek için apse sınırlı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: inflamatuar süreci takip. (A) C. albicans enjeksiyonu ile elde edildi enflamatuar süreç çok başında granülosit patojen sınırlamak için bir apse oluşturmak üzere işe. (B, C) Ülser oluşumu mantar sınırdışı için gereklidir. Şifa doku ve cilt yapısal bütünlük içinde bir değişiklik tarafından karakterize bir yara oluşumuna yol açabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: kinetik ülserasyon. Enfeksiyon sonra ilk gün boyunca artış eğilimini bir (A) ülseratif süreci izler. 72 saat sonra enfeksiyon enfeksiyon yerinde bir ülser fareler % 70-80'i gösterir. 16 C57BL/6 vahşi türü hayvanlar kullanılmıştır. (B) 48 saat sonra enfeksiyon gelişmiş ülser açıklayıcı resimleri. (C) açıklayıcı resimler enfeksiyon sonra kist oluşumu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada biz bir yöntem C. albicans enfeksiyon mantar derin derma girişte üzerine başlatılan enflamatuar süreç çalışmaya nitelendirdi.
Cilt apse oluşumu üzerine C. albicans enfeksiyon15nispeten nadir bir olay olsa bile, enjeksiyon doğrudan içinde derin derma mantar mantar tahrik apse oluşumu çalışma, hem de belirli bağışıklık analizini sağlar mantar içerecek şekilde katılmak hücreleri yayıldı. Burada açıklanan yöntemle, bağışıklık hücrelerinin yanı sıra mekanik hasar veya yara herhangi bir enflamatuar yanıt kaçınırken mantar, denetlenmesine için önemli olan bağışıklık hücreleri alımı arasındaki etkileşimi incelemek mümkündür oluşumu. Nitekim, epitel yapısı sağlam tutmak için olasılığı bir aşınma gibi mekanik bir uyarıcı kaynaklanan inflamatuar bir ortam gelişimi önlemek önemlidir. Teorisini ilk kez Polly Matzinger tarafından 199416, hasar sinyalleri, hatta bir bağışıklık yanıtı etkinleştirmek ve, sonuç olarak, kuvvetli etkisi immün yanıt patojen tarafından elde edildi.
Hasar ilişkili moleküler modelleri (DAMPs) ölü hücreleri gerçekleşebilir ancak bunlar aynı zamanda stres koşullarında serbest. Bu sinyaller doku hasarı durumlarda üretilmektedir beri bir yara oluşumu bir hiper-inflamatuar ortamının içerik önce bile bir enfeksiyon neden olur. Biz anlatmıştık yöntemi DAMPs sürümü sınırlar ve böylece öğeleri semptomlarıdır varlığını azaltır.
Ayrıca, bir patojen derin derma içinde doğrudan enjeksiyon sadece mantar enfeksiyonları için aynı zamanda bakteriyel sorunlar için kullanılan bir yöntem olduğunu. Başka bir patojen kutanöz her iki olgunun yükseltilmiş bir numarası için sorumlu ve kan dolaşımına enfeksiyonlar Staphylococcus aureus4. Biz son zamanlarda nasıl bu protokolü de S. aureus enfeksiyon14eğitim için önemli bir araç olduğunu göstermiştir. Özellikle, S. aureus klinik form apse vücut17birkaç ilçede kabiliyetini için bilinmektedir. Derin derma S. aureus yerleştirmeye apse, böylece çalışma S. aureus tarafından tahrik çok erken olayların karşılaşma şifa için kurşun bağışıklık yanıtları katılımı yanı sıra aynı zamanda etkinleştirme oluşumu yol açar aşama.
Son olarak, burada açıklanan metodolojisi başka bir önemli özelliği sağlam bir epitel yapısı bakımından histolojik olarak bağışıklık hücreleri lokalizasyonu ve belgili tanımlık harekete geçirmek-ebilmek var olmak farklı yollar analiz etme olanağını sağlar. dağınık şekilde bölümlere. Bu deneysel koşullarda aslında, derinin farklı anatomik yapılar değil değişmiş ve bağışıklık hücreleri ve inflamatuar aracılar kesin bir konumda görüntülenmeyecektir.
Bağışıklık hücreleri kayma dağılımını korur bu yöntemin kullanılması bu nedenle hücresel her tür roller mantar ve bakteriyel deri enfeksiyonları sırasında daha iyi anlamak idealdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
FG la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842) başına Associazione Italiana, Cariplo Vakfı (Grant 2014-0655) ve Fondazione Regionale la Ricerca Biomedica (Ferroburak) başına tarafından desteklenmektedir.
Iz NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Tıp Okulu Milton bulduğunu, CCFA üst düzey Araştırma Ödülü (412708), Eleanor ve mil Shore tarafından desteklenmektedir 50 yıldönümü Bursları ve Cariplo Vakfı ( 2014-0859).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
- Belkaid, Y., Segre, J. A. Dialogue between skin microbiota and immunity. Science. 346 (6212), 954-959 (2014).
- Kashem, S. W., Kaplan, D. H. Skin Immunity to Candida albicans. Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).
- Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M.
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).
- Odds, F. C.
- MacCallum, D. M., Odds, F. C. Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice. Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).
- Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).
- Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections. Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Mear, J. B., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).
- Leoni, G., Neumann, P. -A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. Wound repair: role of immune-epithelial interactions. Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).
- Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans. Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).
- Santus, W., et al. Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems. Sci Immunol. 2 (15), (2017).
- Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient. Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).
- Pradeu, T., Cooper, E. L. The danger theory: 20 years later. Front Immunol. 3, 287 (2012).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).
