Summary
Det här protokollet beskriver de kritiska steg och försiktighetsåtgärder som krävs för att utföra enstaka cell multiplex omvänd Transkription polymeras-kedjereaktion efter patch-clamp. Denna teknik är en enkel och effektiv metod för att analysera uttryck profilen av en förutbestämd uppsättning gener från en enda cell som kännetecknas av patch-clamp inspelningar.
Abstract
Hjärnbarken är sammansatt av många celltyper som uppvisar olika morfologiska, fysiologiska och molekylära funktioner. Denna mångfald hämmar enkel identifiering och karakterisering av dessa celltyper, förutsättningar för att studera deras specifika funktioner. Denna artikel beskriver multiplex enda cell omvänd Transkription polymeras-kedjereaktion (RT-PCR) protokollet, vilket tillåter, efter patch-clamp inspelning i skivor, att upptäcka samtidigt uttryck för tiotusentals gener i en enda cell. Den här enkla metoden kan genomföras med morfologisk karakterisering och är allmänt tillämplig att avgöra de fenotypiska drag av olika celltyper och deras cellulära miljö, såsom i närheten av blodkärl. Principen om detta protokoll är att spela in en cell med patch-clamp teknik, skörda och omvända transkribera cytoplasmiska innehållet, och för att upptäcka kvalitativt uttrycket av en fördefinierad uppsättning gener av multiplex PCR. Det kräver en noggrann utformning av PCR primers och intracellulära patch-clamp-lösning som är förenlig med RT-PCR. För att säkerställa en selektiv och tillförlitlig utskrift kräver identifiering, denna teknik också lämpliga kontroller från cytoplasman skörd förstärkning steg. Även om försiktighetsåtgärder som diskuteras här måste följas strikt, kan praktiskt taget alla elektrofysiologiska laboratoriet använda multiplex enda cellen RT-PCR-teknik.
Introduction
Hjärnbarken består av många celltyper som är inblandade i olika fysiologiska processer. Deras identifiering och karakterisering, en förutsättning för förståelsen av deras specifika funktioner, kan vara mycket utmanande med tanke på den stora morfologiska, fysiologiska och molekylära mångfald som kännetecknar kortikal cell typer1 ,2,3,4.
Encelliga multiplex RT-PCR bygger på kombinationen av patch-clamp och RT-PCR-tekniker. Det kan probe samtidigt uttryck för mer än 30 fördefinierade gener i elektrofysiologiskt identifierade celler5. Införandet av neuronala spårämne i inspelning pipetten ytterligare tillåter morfologisk karakterisering av inspelade cellerna efter histochemical Uppenbarelseboken6,7,8,9, 10. det är en mycket användbar teknik för klassificering av neuronala typer baserat på multivariat analys av deras fenotypiska drag5,9,10,11,12 ,13,14. Enskild cell multiplex RT-PCR lämpar sig också till karakterisering av icke-neuronala celler såsom astrocyter15,16,17, och kan tillämpas praktiskt taget varje hjärna struktur18, 19,20,21,22,23 och cell typ, förutsatt att de kan föras in i hela-cell konfiguration.
Denna teknik är mycket bekvämt för identifiering av cellulära källor eller mål av transmission system7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, särskilt när specifika antikroppar saknas. Det bygger på patch-clamp inspelningar från visuellt identifierade celler29, och därmed kan också inriktningen av celler i en specifik cellulär miljö8,15,16. Dessutom eftersom cytoarchitecture av hjärnvävnaden är bevarade i hjärnan skivor, möjliggör detta tillvägagångssätt också studiet av de anatomiska förhållandena kännetecknas celler med neuronala och icke-neuronala element7,8 , 18.
Eftersom denna teknik begränsas av mängden skördade cytoplasman och av effektiviteten i RT, kan detektion av mRNA uttryckt låg kopia nummer vara svårt. Även om andra metoder baserade på RNaseq teknik tillåter för att analysera det hela transkriptom av enstaka celler3,4,30,31, behöver de hög genomströmning dyra sequencers inte nödvändigtvis tillgängliga för varje laboratorium. Eftersom den enda cell multiplex RT-PCR-tekniken använder slutpunkten PCR, det enda som krävs allmänt tillgängliga thermocyclers. Det lätt kan utvecklas i laboratorier som är utrustade med elektrofysiologiska uppställningar och kräver ingen dyr utrustning. Det kan ge, inom en dag, en kvalitativ analys av uttrycket av en fördefinierad uppsättning gener. Således erbjuder denna strategi enkel tillgång till molekylär karakterisering av enstaka celler på ett snabbt sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer använder djur var utfört i strikt enlighet med franska bestämmelser (Code Rural R214/87 till R214/130) och överensstämde med de etiska riktlinjerna både av Europeiska ekonomiska gemenskapen (86/609/EEG) och den franska nationella stadgan om etiska djurförsök. Alla protokoll godkändes av den etiska kommittén som Charles Darwin och lämnats in till det franska ministeriet för utbildning och forskning (godkännande 2015 061011367540). IBPS djuranläggningen är ackrediterat av de franska myndigheterna (A75-05-24).
1. inledande överväganden
Obs: För att undvika föroreningar, uppfylla följande rekommendationer innan företaget enda cell RT-PCR efter patch-clamp.
- Använd inte plasmider som innehåller gener sevärdheter i laboratoriet som de är en potentiell källa till kontaminering.
- Reservera en lab bänk från gelelektrofores rummet att förbereda primärvården.
- Ägna en uppsättning pipetter och aerosol resistenta filter tips att manipulera DNA och RNA vid koncentrationer som är lägre än 1 ng/µL. Aldrig Använd dessa för att analysera PCR-produkter.
- Alltid använda RNase - och DNAS-fria produkter och Använd handskar.
- Använd särskilda kemikalier för att förbereda interna patch-clamp lösningar. Använd aldrig en spatel men ganska väger papper för att väga pulver.
- Använd en dedikerad pH-elektrod och pH standardlösningar, eftersom de kan vara en källa till förorening (t.ex., RNase).
- Lagra borosilikatglas kapillärer; 20 µL långa, fina och flexibla tips; en 20 µL mikropipett; en hemgjord expeller (patch-clamp pipett innehavaren bifogas en 10 mL spruta); 500 μl PCR-rör; 10 µL aerosol resistenta filter tips; och tunn permanenta märkpennor i en särskild låda (figur 1).
2. primer Design
Obs: Multiplex RT-PCR bygger på två förstärkning steg. Under den första PCR förstärks tillsammans alla gener av intresse genom att blanda ihop alla PCR primers. För att upptäcka tillförlitligt avskrifter från enstaka celler, är det viktigt att utforma effektiva och selektiv PCR primers. Användning av kapslade (intern) primers för de andra omgångarna av PCR förbättrar både specificiteten och effektiviteten i förstärkningen.
- Hämta kuraterade mRNA sekvenser av generna av intresse i NCBI Reference Sequence Database32 samt deras relaterade familjs (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
- Ange namnet på gene(s) och arter av intresse som en fråga och klicka på sekvensen Hämtad relevanta.
- För att begränsa analysen till den kodande sekvensen av gene(s), klicka på Skicka till (övre högra hörnet) och välj kodande sekvenser och FASTA nukleotid som format. Klicka sedan på Skapa fil och spara den FASTA sekvens använder en ”.nt” filändelsen.
- Använda Ara programvara33 (flera justering konstruktion & analys Workbench) eller någon annan flera justering programvara för att avgöra regionerna i homologi.
- Klicka på Arkiv | Nytt projekt... och välj DNA som vilken sekvens. Om du vill importera gensekvenser, Välj sekvens | Importera sekvens... och ladda en ”.nt” fil. Upprepa proceduren för alla relaterade sekvenser.
- Klicka och dra alla sekvenser i fönstret Schematisk att välja hela sekvenser.
- Sök homologi regionerna genom att välja justering | Sök efter block... (CTRL + S). Välj segmentet par överlappar i Sökmetod. Justera den Pairwise Poäng cutoff till ett relativt högt värde (t.ex., 1,000) och den Min. seqs. per block att det totala antalet sekvenser att anpassa och klicka på börja.
- I fönstret visas Sökresultatet väljer resultat med högsta MP-Poäng och klicka på länken. Om inget resultat hittas, minska den Pairwise Poäng cutoff eller den Min. seqs. per block.
- För att underlätta visualiseringen av homologa regioner, Välj justering | Skuggning | Menar Poäng.
- Välj olänkade delar av sekvenser och upprepa de steg 2.2.3–2.2.4 för att eventuellt fastställa andra regioner i homologi med en lägre MP-poäng.
- För att erhålla de mest specifika primers, Välj regionerna med de minst sekvenshomologi.
- Hämta sekvenserna av alla skarv varianter och upprepa steg 2.2.1–2.2.6. Välj deras gemensamma regioner för en övergripande upptäckt. Överväga alternativa kassetter för dedikerad skarv varianter analyser20,34,35,36.
- Justera de mRNA sekvenserna på djurmodell genomet använder BLAST37 genomen (Basic Local Alignment Search Tool) för att bestämma intron-exon strukturen av generna (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
- Välj den BLAST mouse arvsmassan genom att klicka på musen och ladda upp sekvensen Hämtad FASTA i avsnittet Ange fråga sekvens . I Programval, Välj optimera för mycket liknande sekvenser (megablast), klicka på knappen BLAST .
- Markera justeringen med högsta identitet i avsnittet beskrivningar (upp till 100%). Kontrollera att den motsvarar gen av intresse som anges i funktioner i avsnittet linjeföring .
- Sortera justeringen av Query startposition i samma avsnitt att erhålla exoner följden av den kodande sekvensen. Observera att start- och slutpositioner av alla hits som ungefär motsvarar positionen för intronerna på fråga sekvens (figur 2A).
- Välj två olika exonerna för förnuft och antisense primers att skilja enkelt cDNA från genomisk DNA (gDNA) förstärkning utifrån en storlekskriteriet (figur 2).
Obs: Förstärkning av gDNA kan inträffa på en låg frekvens när kärnan är avverkad med cytoplasman. Därför är det viktigt att utforma intron overspanning primer par (figur 2A). Vid intron-mindre gener är insamling av kärnan problematiskt eftersom det kan leda till potentiellt confounding resultat. För att lösa problemet, innehåller en uppsättning primers som syftar till att förstärka en intronic sekvens sond för förekomst av gDNA25. Om genomisk kontrollen är positiva, måste resultaten för alla intron-mindre gener kasseras. - För att uppnå en effektiv förstärkning, Välj primers generera amplikoner med en längd som helst består mellan 200 och 400 baspar (figur 2).
- För att förstärka samtidigt olika cDNAs under multiplex PCR steg, designa grundfärger med en längd mellan 18 och 24 nukleotider och en smälttemperatur (Tm) mellan 55 och 60 ° C.
- För att minimera bildandet av sekundära strukturer, vilket minska förstärkning avkastningen, Välj känsla och anti känsla grundfärger med minimal hårnål och duplex längder (figur 2B).
- Utforma interna grundfärger med samma kriterier (steg 2,5-2,8).
- Verifiera PCR primers specificitet genom att justera primers på databasen referens RNA-sekvens av organismen av intresse med hjälp av en nukleotid BLAST.
- BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), klicka på nucleotide BLAST. Klistra in sekvensen av en primer i Ange fråga sekvens.
- I avsnittet Välj Sök Set , klicka på andra (nr etc.) referens RNA sekvenser (refseq_rna) i databasen alternativet och välj Ange organismen (t.ex., Mus musculus (taxid:10090) ) att begränsa analysen till de önska arterna.
- Välj optimera för något liknande sekvenser (blastn)i Programval . I avsnittet algoritmparametrar minska ordet storlek ner till 7 för att öka chansen att få träffar.
- För att designa selektiv primers, håll bara de vars sekvens har minst 3 missmatchningar med oönskade cDNAs när det är möjligt.
- Beställa desalted grundfärger på en relativt hög koncentration (t.ex., 200 µM) att se till att alla externa grundfärger kan blandas ihop med en slutlig koncentration på 1 µM.
3. beredning av RT reagenser
- 5 x RT-mix: förbereda i RNase-fritt vatten 400 µL arbetar RT mix lösning (5 x) innehållande slumpmässiga primers på 25 µM och dNTP på 2,5 mM vardera. Lagra denna arbetande mix 20 µL portioner i 500 µL rör.
- 20 x Ditiotreitol (DTT): förbereda 1 mL 0,2 M DTT i RNase-fritt vatten och lagra det som 50 µL portioner.
- Lagra 2500 U av RNase inhibitor (40 U/µL) och 10.000 U av omvänt transkriptas (RTase, 200 U/µL) 5 µL portioner.
- För att säkerställa en optimal kvalitet RT reagenser, lagra alikvoter vid-80 ° C. Använda dem för upp till 10 celler och bara för en dag.
4. PCR validering
- Förbered cDNAs genom att göra en omvänd Transkription på en relativt stor mängd totalt RNA (vanligtvis 1 µg) utvinns38 från strukturera av intresse.
- Använd inte pipetterna dedikerad till enstaka cell RT-PCR för dessa förberedelser men använda pipetterna RNase-fri. Späd ut total-RNA ner till 1 µg/µL.
- Lägg till 1 µL utspädda total-RNA och 8 µL RNase-fritt vatten i en 500 µL PCR-röret. Denaturera vid 95 ° C i 1 min och kyla ner röret på is.
- Lägga till 4 µL av RT 5 x buffert tillhandahålls av tillverkaren, 4 µL RT mix lösning, 1 µL av RTase, 1 µL RNase inhibitor och 1 µL 200 mM DTT (se avsnitt 3).
- Svep röret, spinna och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Lagra cDNAs vid-80 ° C i upp till flera år. Förbereda en alikvot av cDNAs spädd till 1 ng/µL av totala RNAs motsvarigheter.
- Mixa och späd varje primer par på 1 µM med pipetterna tillägnad enstaka cell RT-PCR. Använda 20 µL av varje primer mix för 100 µL primärvården.
- På isen, förbereda för varje primer par en premix som innehåller: vatten (QS, 80 µL), 10 µL 10 X buffert, 1 µL 100 x dNTPs (50 µM varje), 500 – 1000 pg av cDNA utspätt till 1 ng/µL och 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) av Taq polymeras.
- Använda PCR-rören som tätt passa brunnarna av PCR-maskinen för en optimal temperaturkontroll. Tillsätt 2 droppar (~ 100 µL) av mineralolja till premix utan att röra väggen eller locket av PCR-röret.
- För att minimera bildandet av primer-dimerer, utföra en het start genom att placera PCR-rören i den termocyklern förvärmd till 95 ° C. Efter 30 s, snabbt utvisa 20 µL av primer blandningen ovanpå oljan.
- Efter 3 min vid 95 ° C, kör 40 cykler (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) följt av en sista töjning steg vid 72 ° C i 5 min.
- Analysera 10 µL av varje PCR-produkter av agaros gelelektrofores (2%, vikt/volym)39. Om vissa PCR-produkter inte har den förväntade storleken, re-design andra primers (se avsnitt 2).
Varning: Etidiumbromid är ett intercalating kemikalie som kan inducera DNA-mutationer. Konsultera den lokala säkerhet office innan du använder den. Använd alltid handskar när manipulera den. Använd en kommersiellt tillgänglig lösning av etidiumbromid metylbromid (10 mg/mL) lösning istället för pulver för att minimera risken för inandning. Likaså, UV-ljus kan vara skadligt, så se till att bära skyddsglasögon UV skydd eller en mask. Återkalla smutsiga geler, tips, handskar och buffert i behållare tillägnad etidiumbromid avfall. - När alla primer par har validerats individuellt, testa multiplex protokollet (figur 3).
- Mixa och späd alla externa grundfärger tillsammans på 1 µM. butik multiplex primers blanda vid-20 ° C i upp till flera veckor.
- På isen, förbereda en premix som innehåller: vatten (QS, 80 µL), 10 µL 10 X buffert, 1 µL 100 x dNTPs (50 µM av varje), 500 – 1000 pg av cDNAs utspätt till 1 ng/µL och 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) av Taq polymeras.
- Svep PCR-röret, spinna och tillsätt två droppar (~ 100 µL) mineralolja.
- Utför en het start som beskrivs i 4,5 steg med 20 µL av multiplex primer mix. Efter 3 min vid 95 ° C, kör 20 PCR cykler identiska med steg 4,6.
- Förbered ett antal PCR-rör identiskt med antalet gener att analysera. Förbereda en premix som i steg 4.8.2, men med 1 µL första PCR-produkten per gen som mall. Justera alla volymer beroende på antalet gener att analysera och överväga att använda 10% av extra volym för att kompensera för pipettering fel.
- Skaka försiktigt, snurra röret, avsända 80 µL av premix i varje PCR-röret och tillsätt två droppar (~ 100 µL) mineralolja per rör utan att röra väggen eller locket på rören.
- Utföra en het start (se steg 4,5) av utvisa 20 µL av interna primer mix bereddes i steg 4,2. Kör 35 PCR cykler identiska till steg 4,6.
- Analysera de andra PCR-produkterna av agaros gelelektrofores. Kontrollera att varje andra PCR genererar en kopian av den förväntade storleken. Vid ineffektiv eller ospecifik kompletteringar, re-design nya primers (steg 2,5 – 2.12) och validera dem. (steg 4,2 – 4.8).
5. beredning och validering av intracellulära Patch-clamp lösning
Obs: Följande protokoll beskriver preparatet och validering av en K+/gluconate baserat intern lösning, men nästan alla typer av patch-clamp lösning kan användas så länge det inte hindrar effektiviteten av RT-PCR. Handskar är obligatoriskt att erhålla en RNase-fri intern lösning.
- För 60 mL intern patch-clamp inspelning lösning, förbereda tillfället 10 mL 0,1 M KOH.
- Lös EGTA (0.5 mM slutlig) 11,4 mg i 0,9 mL 0,1 M KOH.
- Tillsätt 40 mL RNase-gratis vatten och lös 2,02 g K-glukonat (144 mM slutlig), 143 mg HEPES (10 mM slutlig) och 180 µL av 1 M MgCl2 (3 mM slutlig).
- Justera pH-värdet till 7,2 genom att tillsätta ~ 6 mL 0,1 M KOH.
- Justera osmolaritet till 295 mOsm med ~ 13 mL RNase-gratis vatten.
- Eftersom den interna lösningen används också som en buffert för omvänd Transkription, noggrant kontrollera Mg2 + koncentration. Kompensera för en lägre Mg2 + koncentration i interna lösningen genom att lägga till MgCl2 efteråt för att nå en slutlig koncentration på 2 mM i RT reaktionen.
- Etikettera skördade cellen efter patch-clamp inspelning, lägga till 2-5 mg/mL RNase-fri biocytin den inre lösning som beskrivs ovan (steg 5.1-5.5).
- Filtrera (0,22 µm porstorlek) interna lösningen och förvara den vid-80 ° C som 100 – 250 µL portioner.
- För att validera användningen av interna lösningen för encelliga RT-PCR, tillsätt 0,5 µL av totala RNAs utspätt till 1 ng/µL till 6 µL patch-clamp lösning och lämna den på bänken i ca 30 min.
- Med en 2 µL mikropipett, tillsätt 2 µL 5 x RT-mix, 0,5 µL 20 x DDT, 0,5 µL RNase inhibitor och 0,5 µL RTase, och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Snurra röret. Tillsätt vatten (QS, 80 µL), 10 µL 10 X buffert och 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) av Taq polymeras på is.
- Utföra 40 cykler av PCR med en uppsättning validerade primers (steg 4,4-4,6).
- Analysera de PCR-produkterna av agaros gel-elektrofores (se steg 4.7) och kontrollera att de har den förväntade storleken.
Obs: Utelämna den 0,5 µL av total-RNA och ersätta det med 0,5 µL RNase-fritt vatten kommer att säkerställa att den interna lösningen är gratis av RNA eller DNA föroreningar.
6. akut Slice förberedelse
Obs: Det här protokollet beskriver skivning förfarandet för ungdomsbrottslighet (dvs.mindre än 28 postnatal dagar) manliga och kvinnliga möss. Andra skärande lösningar, såsom sackaros-baserade konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF) är också användbara40.
- Förbered 2 L av aCSF som innehåller (i mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 glukos och 15 sackaros. Bered en styckning för att minska glutamatergic aktivitet under slice beredning, genom att lägga till 1 mM av kynurensyra.
- Innan skivning, förbereda en dissektion kit innehåller fina iris sax, pincett, två spatlar, kirurgisk sax, en skiva av pappersfiltret och cyanoakrylat lim.
- Använda iskall skärande lösningen mättad med O2tillpass2 (95% / 5%) och svalna skärkammaren vid-20 ° C.
- Söva musen med en liten pappershandduk indränkt med isofluran. Efter ~ 2 min, se till att musen är under djup anestesi genom att verifiera avsaknad av svar till tass nypa.
- Snabbt halshugga musen. Ta bort hårbotten och öppna skallen. Extrahera hjärnan försiktigt och placera den i en liten bägare fylld med iskall (~ 4 ° C) skärande lösningen syresatt med O2tillpass2.
- Ta bort skärkammaren från-20 ° C förhållanden och fukt med en pappershandduk.
- Noggrant dissekera hjärnan att isolera regionen av intresse, limma den på skärkammaren och lägga till iskall skärande lösningen syresatt med O2tillpass2.
- Skär 300 µm tjocka skivor med hjälp av en vibratome. Överföra dem i rumstemperatur i en vilande kammare fylld med syresatt skärande lösningen och tillåta dem att återhämta sig för minst 0.5 h.
7. enda Cell RT-PCR efter Patch-clamp inspelning
- Rengöra perfusion systemet regelbundet med ~ 100 mL 30% H2O2 lösning och skölj med ~ 500 mL destillerat vatten för att undvika bakterietillväxt, eftersom det är en förbisedd källa RNase kontaminering.
- KLORERA glödtråden med patch pipett fylld med koncentrerad lut varje skörd dag. Använd inte en mikropipett för att fylla patch pipetten men snarare en 20 µL långa, fina, flexibel spets bifogas en 1 mL spruta. Sedan skölj det i stor utsträckning med RNase gratis vatten och torka den med en gas duster.
- Förbereda en liten låda av is som innehåller 5 x RT-mix och 20 x DTT alikvoter. Lagra de RTase och RNase inhibitor alikvoter vid-20 ° C i en bänkmonterade svalare.
- Överföra en bit in i inspelningen kammaren perfusion vid 1 – 2 mL/min med syresatt aCSF.
- Dra patch pipetter (1 – 2 µm öppna spets diameter, 3 – 5 MΩ) från borosilikatglas med handskar och fyll en av dem med 8 μL av intern lösning. Tänk på att knopparna av de pipett avdragare är en källa till RNase kontaminering.
- Placera pipetten i pipett hållaren samtidigt nya handskar och inte röra glödtråden med fingrar.
- Närma patch pipetten med ett positivt tryck och utföra hela-cell inspelning att karakterisera riktade cellen (figur 4).
- För att bevara mRNA, begränsa tiden i hela-cell konfiguration till 20 min41.
- I slutet av inspelningen, förbereda ett 500 µL PCR-rör fyllda med 2 µL 5 x RT Mix och 0,5 µL 20 x DTT, spinna, och lagra den på isen.
- Skörda cellens cytoplasma genom att tillämpa en skonsam undertryck (figur 4). Visuellt kontroll som cellens innehåll levereras inuti pipetten samtidigt som en tät förslutning.
- Undvik så mycket som möjligt samla kärnan om några intron-mindre gener anses. I ett sådant fall alltid innehålla en uppsättning primers som syftar till att förstärka gDNA sond för genomisk kontaminering.
- Om kärnan kommer nära spetsen på pipetten, släppa det negativa trycket och flyttar pipetten från kärnan. Se till att tätt bevaras och starta om för att samla in cytoplasman på den nya platsen i pipetten.
- Stoppa skörd när något mer material kommer eller innan han förlorade den tät förslutning.
- Dra tillbaka pipetten försiktigt för att bilda en utsidan ut plåstret att begränsa kontaminering av extracellulära skräp (figur 4) och att gynna stängningen av cellmembranet för efterföljande histochemical analys.
- Tänk på att knopparna, micromanipulators, datorns tangentbord eller datormus är potentiella föroreningskällor RNase. Om de har berörts under inspelningen, ändra handskar.
- Tillmäter expeller pipetten och utvisa dess innehåll i PCR-röret genom att tillämpa ett positivt tryck (figur 1).
- Bryta spetsen på pipetten i PCR-röret för att insamling av dess innehåll.
- Kort Centrifugera röret, tillsätt 0,5 µL av RNase inhibitor och 0,5 µL av RTase, blanda försiktigt, Centrifugera igen och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Snurra röret och förvara den vid-80 ° C i upp till flera månader tills PCR-analys.
- Utföra första förstärkning steget direkt i röret som innehåller den ~ 10 µL av RT produkter genom att lägga till vatten (QS, 80 µL), 10 µL 10 x buffert, och 0,5 µL (2,5 U) av Taq polymeras. Följ sedan instruktionerna i steg 4.8.2–4.8.8.
8. histochemical färgning av inspelade cellen (tillval)
- Efter de elektrofysiologiska inspelningarna, behålla segmentet för 20 min syresatt aCSF tillåta spridningen av biocytin i trädet axonal och dendritiska.
- Placera segmentet i en brunn av en 24-well platta och fixa det över natten vid 4 ° C med 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD i 0,1 M fosfatbuffert.
- Tvätta skivor 4 gånger, 5 min varje, med 1 mL fosfat fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- I samma brunn, permeabilize och mätta segmentet under 1 h i rumstemperatur med 1 mL PBS kompletteras med 0,25% Triton x-100 och 0,2% gelatin från kallt vatten fisk hud (PBS-GT).
- Inkubera över natten med en fluorescently märkt avidinen utspätt till 1/400 i 250 – 500 µL av PBS-GT.
- Tvätta 5 gånger, 5 min varje, med 1 mL PBS och montera skivor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En representativ validering av multiplex RT-PCR visas i figur 3. Protokollet var avsedd att probe samtidigt uttrycket av 12 olika gener. Det vesikulära glutamat transportör vGluT1 togs som en positiv kontroll för glutamatergic nervceller42. GABA syntetisera enzymer (GAD65 och GAD 67), neuropeptid Y (NPY) och Somatostatin (SOM) användes som markörer för GABAergic interneuroner3,5,11. Enzymet cyklooxygenas-2 (COX-2) användes som markör för den pyramidala cell delpopulation3,16.
ATP1α1-3 subunitsna av Na+k+ ATPas och Kir6.2 och SUR1 subunitsna av ATP-känsliga K+ kanaler valdes att utvärdera förhållandet mellan neuronal aktivitet och metabola staterna43. Eftersom Kir6.2 är en intron-mindre gen, ingick den SOM intron som en genomisk kontroll. Protokollet har testats på 1 ng av omvänd transkriberas total-RNA extraherade från mus hela hjärnan, vilket ungefär motsvarar avskrifter av 20 celler44. Multiplex PCR producerade 12 amplikoner av den förväntade storleken (diagram 3 och tabell 1) demonstrerar känsligheten och effektivitet i protokollet. Den negativa kontrollen utförs utan RNA produceras ingen amplikon (inga data anges).
Ett lager V pyramidal neuron identifierades visuellt av dess stora soma och en framstående apikala dendrite (figur 5A, infälld). Hela cellen inspelning avslöjade typiska elektrofysiologiska egenskaper av lager V regelbundna tillsatta nervceller5,45,46 med, framför allt, en låg Ingångsmotstånd, långvarig handlingspänningar och uttalad spike frekvens anpassning (figur 5A). Molekylära analysen av detta neuron visade uttrycket av vGluT1 (figur 5B), bekräftar dess glutamatergic fenotyp42,46. Detta neuron uttryckte också SOM, ATP1α1 och 3 subenheter av Na+k+ ATPas. Biocytin märkning av inspelade nervceller bekräftade en pyramidal morfologi (figur 5 d).
Som förväntat från glutamatergic nervceller, visade molekylära analysen av 26 lager V pyramidala celler uttryck för VGluT1, men ingen av de två GADs (figur 5 c),. Markörer för interneuroner observerades sällan5,42,46. COX-2, främst uttryckt av layer II-III pyramidala celler3,16, påvisades inte i lager V pyramidala celler. ATP1α1 och 3 subenheter var mer frekvent observerade än de ATP1α2 subenhet3. Kir6.2 och SUR1 subunitsna upptäcktes sällan i lager V pyramidal nervceller, vilket är förenligt med deras förmånliga uttryck i övre lager3,43. Var försiktig att inte skörda atomkärnor, vilket resulterar i en sällsynt detektion av SOM intronerna (3 av 26 celler, dvs12%).
Figur 1: dedikerad box för enstaka cell RT-PCR. Lista över material som reserverade för RT-PCR efter patch-clamp. (1) borosilikatglas kapillärer, (2) 20 µL långa, fina, flexibla tips, (3) 20 µL mikropipett, (4) hemgjorda expeller, (5) 500 µL PCR-rör, (6) 10 µL aerosol resistenta filter tips och (7) permanenta märkpennor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: PCR primer designstrategi. (A) Schematisk bild av den kodande sekvensen av COX 2 cDNA anpassas till sekvensen mus kromosom 2 innehållande COX 2-genen. Exonerna representeras av svarta lådor och introner på gDNA vita rutorna. Observera luckorna i det cDNA som motsvarar den intronic sekvenser på gDNA. Representativa exempel på dåliga och bra oligonukleotider representerade som röda och gröna pilar, respektive. Höger och vänster pilarna beteckna framåt och bakåt primers. (B) sekvenser och sekundära strukturer av de oligonukleotider som visas i (A). Vänster och höger paneler anger hårnål self-komplementaritet och self-dimer bildas, respektive. Den B1 oligonukleotiden visar både en stark hårnål self-komplementaritet och dimer bildas medan den B2 oligonukleotiden visar bara dimer bildas. Både B3 och B4 oligonukleotider har ingen hårnål self-komplementaritet och ingen dimer bildning; de är intron overspanning (A) och har valts ut som potentiell PCR primers (se tabell 1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: validering av multiplex PCR. 1 ng av total-RNA från mus hela hjärnan utsattes för en omvänd Transkription följt av två rundor av PCR-amplifiering. De 12 PCR-produkterna löstes i separata körfält av agaros gel-elektrofores parallellt med Φx174 rötas av HaeIII. De andra PCR-produkterna hade storlekar (i bp) förutsägs av sekvenser: 153 (vGluT1), 248 (GAD65), 255 (GAD67), 181 (COX 2), 220 (NPY), 146 (SOM), 183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2), 128 (ATP1a3), 342 (Kir6.2), 211 (SUR1) och 182 (SOMint). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Patch-clamp skörd i hjärnan skivor. När en cell identifieras visuellt, inspelning pipetten att närma sig med ett positivt tryck för att undvika cellulära skräp på toppen av pipetten. Observera grop på membranet i detta neuron. Övertryck avbryts sedan för att bilda en cell-anslutna konfiguration med en Gigaohm tät förslutning. Kort insug används för att växla till hela-cell configuration. I slutet av inspelningen skördas cytoplasman genom att tillämpa en skonsam undertryck i pipetten samtidigt bibehålla den tät förslutning. Observera krympning av cellkroppen under förfarandet för skörd. Inspelning pipetten dras sedan försiktigt för att bilda en utsidan ut plåstret, vilket gynnar cellmembranet stängning för efterföljande biocytin uppenbarelse, och bevarandet av skördematerial i patch pipetten. Reproducerad från blomkål och Lambolez47 med tillstånd från den Royal Society of Chemistry. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: karakterisering av lager V hjärnbarkens pyramidala celler. (A) membran potentiella svar av en pyramidal lagret V-cell induceras av strömimpulser -100, -40, -10, + 60, 120 och + 500 pA (botten spår). Neuron visar en svag potentiella nedböjning efter den första hyperpolarizing svaren (övre spår). Svar på en supraliminal depolarisation urladdat neuron långvarig handlingspänningar med långsam utveckling efter-hyperpolarisering (övre trace). Nära mättnad, neuron urladdat på en låg frekvens och uppvisade en uttalad anpassning (övre grå trace). Infälld: infraröda bilder av den inspelade lager V pyramidal neuronen. Pial ytan är uppåt. Skalstapeln: 20 µm. (B) Multiplex RT-PCR analys avslöjar uttryck för vGluT1, SOM, ATP1α1 och ATP1α3. (C) gen uttryck profil i ett prov av 26 lager V pyramidala celler. vGluT1 uttrycktes i alla neuroner medan GAD65, GAD67 och COX2 upptäcktes aldrig. NPY, SOM, Kir6.2, SUR1 och SOMint observerades sällan. Pyramidala celler uttryckt ATP1α3, 1 subuniten av Na+k+ ATPas och ATP1α2 i mindre utsträckning. (D) maximal intensitet projicering av confocal bilder visar biocytin märkning av neuron registreras i (A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Gen / GenBank nummer | Yttre grundfärger | Storlek (bp) | Interna grundfärger | Storlek (bp) | ||
| vGlut1 NM_182993 |
Känsla, -113 | 259 | Känsla, -54 | 153 | ||
| GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC | ATTCGCAGCCAACAGGGTCT | |||||
| Anti känsla, 126 | Anti känsla, 79 | |||||
| CCAGCCGACTCCGTTCTAAG | TGGCAAGCAGGGTATGTGAC | |||||
| GAD65 NM_008078 |
Känsla, 99 | 375 | Känsla, 219 | 248 | ||
| CCAAAAGTTCACGGGCGG | CACCTGCGACCAAAAACCCT | |||||
| Anti känsla, 454 | Anti känsla, 447 | |||||
| TCCTCCAGATTTTGCGGTTG | GATTTTGCGGTTGGTCTGCC | |||||
| GAD67 NM_008077 |
Känsla, 529 | 598 | Känsla, 801 | 255 | ||
| TACGGGGTTCGCACAGGTC | CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC | |||||
| Anti känsla, 1109 | Anti känsla, 1034 | |||||
| CCCAGGCAGCATCCACAT | AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC | |||||
| COX 2 NM_011198 |
Känsla, 199 | 268 | Känsla, 265 | 181 | ||
| CTGAAGCCCACCCCAAACAC | AACAACATCCCCTTCCTGCG | |||||
| Anti känsla, 445 | Anti känsla, 426 | |||||
| CCTTATTTCCCTTCACACCCAT | TGGGAGTTGGGCAGTCATCT | |||||
| NPY NM_023456 |
Känsla, 16 | 294 | Känsla, 38 | 220 | ||
| CGAATGGGGCTGTGTGGA | CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT | |||||
| Anti känsla, 286 | Anti känsla, 236 | |||||
| AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT | GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA | |||||
| SOM NM_009215 |
Känsla, 43 | 208 | Känsla, 75 | 146 | ||
| ATCGTCCTGGCTTTGGGC | GCCCTCGGACCCCAGACT | |||||
| Anti känsla, 231 | Anti känsla, 203 | |||||
| GCCTCATCTCGTCCTGCTCA | GCAAATCCTCGGGCTCCA | |||||
|
ATP1Α1 NM_144900 |
Känsla, 1287 | 288 | Känsla, 1329 | 183 | ||
| CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA | TAAGCGGGCAGTAGCGGG | |||||
| Anti känsla, 1556 | Anti känsla, 1492 | |||||
| CCGTGGAGAAGGATGGAGC | AGGTGTTTGGGCTCAGATGC | |||||
| ATP1Α2 NM_178405 |
Känsla, 1392 | 268 | Känsla, 1430 | 213 | ||
| AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG | AAATCCCCTTCAACTCCACCA | |||||
| Anti känsla, 1640 | Anti känsla, 1623 | |||||
| ACAGAAGCCCAGCACTCGTT | GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC | |||||
| ATP1Α3 NM_144921 |
Känsla, 127 | 216 | Känsla, 158 | 128 | ||
| CGGAAATACAATACTGACTGCGTG | TGACACACAGTAAAGCCCAGGA | |||||
| Anti känsla, 324 | Anti känsla, 264 | |||||
| GTCATCCTCCGTCCCTGCC | CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA | |||||
| Kir6.2 NM_010602 |
Känsla, 306 | 431 | Känsla, 339 | 342 | ||
| CGGAGAGGGCACCAATGT | CATCCACTCCTTTTCATCTGCC | |||||
| Anti känsla, 719 | Anti känsla, 663 | |||||
| CACCCACGCCATTCTCCA | TCGGGGCTGGTGGTCTTG | |||||
| SUR1 NM_011510 |
Känsla, 1867 | 385 | Känsla, 2041 | 211 | ||
| CAGTGTGCCCCCCGAGAG | ATCATCGGAGGCTTCTTCACC | |||||
| Anti känsla, 2231 | Anti känsla, 2231 | |||||
| GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG | GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG | |||||
| SOMint X51468 |
Känsla, 8 | 240 | Känsla, 16 | 182 | ||
| CTGTCCCCCTTACGAATCCC | CTTACGAATCCCCCAGCCTT | |||||
| Anti känsla, 228 | Anti känsla, 178 | |||||
| CCAGCACCAGGGATAGAGCC | TTGAAAGCCAGGGAGGAACT | |||||
Tabell 1. Sekvenser av första och andra PCR primers. Placeringen av varje PCR-primer och deras sekvenser ges från 5' till 3'. Förutom den somatostatin intron motsvarar position 1 första basen av den start-kodon av varje gen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Single cell multiplex RT-PCR efter patch-clamp kan samtidigt och tillförlitligt sond uttrycket av mer än 30 gener i elektrofysiologiskt identifierade celler5. Analysera genuttryck på enstaka cellnivå kräver högeffektiva PCR primers. En av de mest begränsande steg är samling av cellens innehåll. Dess effektivitet beror på diametern på patch pipettspetsen, som måste vara så stor som möjligt medan matchande Cellstorlek. Pipetter med en 1-2 µm öppen spets diameter var visat sig vara lämplig för mest neuronala typer. Det är också viktigt att se till att endast cellulära innehållet samlas, och inte den omgivande vävnaden. Detta uppnås genom att kontrollera elektrofysiologiskt bevarandet av en tät förslutning under skörden. Bildandet av en utsidan ut plåstret konfiguration under pipetten uttag ytterligare skyddar skördade cytoplasman från cellulära skräp. Framgången av den enda cell multiplex RT-PCR beror också på mRNA överflöd av de undersökta celltypen. Exempelvis den avkastning som erhålls med astrocyter, som express mRNA i relativt låga mängder3, är i allmänhet lägre än den som erhålls med nervceller och kräver således öka prov storlek15,16. Omvänd Transkription, som har en låg effektivitet i rör48, är begränsande reaktionen av single cell multiplex RT-PCR. Det är därför viktigt att använda högkvalitativa reagenser, lagra dem som alikvoter vid-80 ° C, och att använda dem bara för en dag. Slutligen, DNA-polymeras aktiviteten hos RTase är ofta en förbisedd källa av primer-dimer bildas. För att lösa problemet, är utför en het start med primers kritiska att effektivisera förstärkning. Utöver minskar detta RTase hämmande effekt på Taq-DNA polymeras verksamhet49.
Den enda cell multiplex RT-PCR-tekniken är mycket mångsidig. Den har använts flitigt i gnagare10,11,13,19,20,34,50,51,52 ,53,54 men kan anpassas till praktiskt taget alla djurmodeller och gener antar att vävnad och gen sekvenser finns tillgängliga. Olika patch-clamp lösningar kan användas så länge de inte stör den RT-PCR om cell gratis analyser. Till exempel varit interna lösningar baserade på K+ eller Cs+ kationer, Cl– eller glukonat framgångsrikt används6,36,41,55.
Klassiskt falska negativa resultat härrör från RNase kontaminering patch pipett glödtråden och/eller intern patch-clamp lösning. Noggrant chlorinating glödtråden och validera interna lösningen generellt lösa detta problem. Falska negativa resultat kan också uppstå när en genen uttrycks på en låg enda cell-nivå, eftersom endast en del av cytoplasman skördas. Skörda kvaliteten kan ökas med hjälp av större pipetter och/eller genom att minska tiden för hela-cell inspelningen. Skörda kvalitet kan bedömas genom att inkludera en gen som känt att uttryckas på en låg nivå i enstaka celler20. Falskt positiva resultat kan uppstå med dålig vävnad kvalitet, där mängden kontaminerande cellulära skräp är hög. Testning av förekomsten av skräp görs genom att sätta en lapp pipett i segmentet utan utför någon tätning och släppa det positiva trycket före pipett avlägsnande. Förekomsten av amplifiable material är sedan utforskad av multiplex RT-PCR-42. Silanisering patch pipetten har också använts för att minska insamling av extracellulära föroreningar56. Enstaka cell PCR är en mycket känslig teknik som kan upptäcka så lite som en enda kopia av dubbel stranded DNA57. När det gäller intron-mindre gener, kan den gDNA i kärnan också producera falska positiva. Att undvika insamling av gDNA genom att placera pipetten från kärnan under de skörd hjälper till att lösa problemet. Förekomsten av gDNA kan vara tillförlitligt probed genom att förstärka en intronic sekvens25.
Påvisande av mRNA-molekyler av RT-PCR blir otillförlitliga på 10 exemplar44, förmodligen på grund av den låga effektiviteten i RTase48, och kan leda till ett under identifiering av låg-överflöd avskrifter26,42. Detta kan vara problematiskt när det gäller intron-mindre gener. Faktiskt, att undvika skörd av kärnan minskar mängden cytoplasman som kan samlas och därför upptäckt känslighet. Kombinationen av encelliga RT-PCR efter patch-clamp med biocytin märkning kräver att formen på cellen upprätthålls så mycket som möjligt (figur 3). Oundvikligen, minskar detta mängden material som kan samlas, därigenom minska framgång. En kompromiss mellan cytoplasman insamling och bevarande av cellmorfologi är obligatoriskt.
Multiplex encelliga RT-PCR-data är inte kvantitativ som de bara ger information om huruvida cDNAs är närvarande eller frånvarande i det insamlade materialet. Dock på grund av de detektionsgränser som beskrivs ovan, kan förekomsten av detektering på populationsnivå återspegla överflödet av gener på enstaka cellnivå. Alternativa metoder Tillåt generering av mer kvantitativa data, men de tekniska begränsningar som deras specifika förstärkning-strategier (dvs.relativ kvantifiering av homologa gener eller RT-qPCR) i hög grad begränsa antalet gener som kan vara samtidigt analyseras41,53,55,58,59,60,61,62,63 ,64,65,66. Den senaste kombinationen av patch-clamp inspelningar och enda cell RNaseq, kallad Patch-seq30,31, tillåter kvantitativ transcriptomic analys av elektrofysiologiskt kännetecknas celler. Det är en ny och lovande strategi, men det kräver tillgång till hög genomströmning sequencers och de data som genereras kräver tidskrävande analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Alexandre Mourot för hans synpunkter på manuskriptet. Detta arbete stöds av bidrag från Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 och ANR-17-CE37-0010-03), BLG stöds av stipendium från den Fondation pour la Recherche sur Alzheimers. Vi tackar djuranläggningen av IBPS (Paris, Frankrike).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MACAW v.2.0.5 | NCBI | Multiple alignement for primer design | |
| Dithiothreitol | VWR | 443852A | RT |
| Random primers | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
| dNTPs | GE Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | RT and PCR |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2511 | RT |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | RT |
| Taq DNA Polymerase | Qiagen | 201205 | PCR |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich (Merck) | M5904-5ML | PCR |
| PCR primers | Sigma-Aldrich (Merck) | PCR / desalted and diluted at 200 µM | |
| Tubes, 0.5 mL, flat cap | ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT and PCR |
| BT10 Series - 10 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT10 | RT and PCR |
| BT20 Series - 20 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT20 | RT and PCR |
| BT200 Series - 200 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT200 | RT and PCR |
| BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT1000.96 | RT and PCR |
| DNA Thermal Cylcer | Perkin Elmer Cetus | PCR | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich (Merck) | E1510-10ML | Agarose gel electrophoresis |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich (Merck) | T4415-1L | Agarose gel electrophoresis |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | Agarose gel electrophoresis |
| ΦX174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | Agarose gel electrophoresis |
| EDA 290 | Kodak | Agarose gel electrophoresis | |
| Electrophoresis Power supply EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Agarose gel electrophoresis | |
| Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 | Sigma-Aldrich (Merck) | Agarose gel electrophoresis | |
| Smooth paper with satin appearance | Fisherbrand | 1748B | Patch clamp internal solution |
| Potassium Hydroxyde | Sigma-Aldrich (Merck) | 60377 | Patch clamp internal solution |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | E3889 | Patch clamp internal solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | Patch clamp internal solution |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich (Merck) | G4500 | Patch clamp internal solution |
| Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | M1028 | Patch clamp internal solution |
| 5500 Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Patch clamp internal solution | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich (Merck) | B4261 | Patch clamp internal solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (Merck) | S5016 | Slice preparation |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | 49159 | Slice preparation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | S6191 | Slice preparation |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 60128 | Slice preparation |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich (Merck) | 31437-M | Slice preparation |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S5011 | Slice preparation |
| Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 63069 | Slice preparation |
| Calcium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | Slice preparation |
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | K3375 | Slice preparation |
| Isoflurane | Piramal Healthcare UK | Slice preparation | |
| VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | Slice preparation |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich (Merck) | H1009 | Patch Clamp set-up cleaning |
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW150F-4 | Patch Clamp |
| PP-83 | Narishige | Patch Clamp | |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956003 | Patch Clamp |
| BX51WI Upright microscope | Olympus | Patch Clamp | |
| XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA | Sony | Patch Clamp | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| Digidata 1440 | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| pCLAMP 10 software suite | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| 10 mL syringe | Terumo | SS-10ES | Expelling |
| E Series with Straight Body (Holder) | Phymep | 64-0997 | Expelling |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S7907 | Histochemical revelation |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S8282 | Histochemical revelation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich (Merck) | P6148 | Histochemical revelation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | X100 | Histochemical revelation |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich (Merck) | G7041 | Histochemical revelation |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | S11223 | Histochemical revelation |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | Histochemical revelation |
References
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
- Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
- Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
- Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
- Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
- Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Karagiannis, A., et al.
- Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B.
- Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
- Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
- Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
- Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
- Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
- Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
- Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
- Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
- Gallopin, T., et al.
- Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
- Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
- Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
- Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
- Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
- Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
- Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
- Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
- Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
- Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
- O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
- Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
- Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
- Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
- Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
- Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
- Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
- Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
- Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
- Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
- McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
- Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
- Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
- Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
- Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
- Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
- Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
- Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
- Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
- Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
- Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
- Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
- Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
- Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
- Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
- Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
- Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
- Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
- Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
- Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
- Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
- Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).
