Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

השאיפה הלוע התחתון מאתר מודל של הנשמה-הקשורים ו רכשה החולים בדלקת ריאות חיידקית

Published: June 28, 2018 doi: 10.3791/57672
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Southern California, 2Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, LAC+USC Medical Center

Summary

דלקת ריאות זיהומית היא בין הזיהומים הנפוצים ביותר של האדם. מודל המתאים ויוו חיוני להבנת הפתוגנזה של המחלה, בדיקת יעילותם של הריפוי. עם מודל דלקת ריאות השאיפה הלוע התחתון מאתר זה, ניתן לבחון הפתוגנזה של טיפולים חדשים נגד זיהומים קטלניים אלה.

Abstract

זיהום מאתר הדוגמניות קריטית להבנת הפתוגנזה של המחלה, בדיקת יעילותם של הריפוי אמור להלחם פתוגנים סיבתי. דלקת ריאות זיהומית היא בין הזיהומים הנפוצים ביותר שהוצגו על ידי מטופלים במרפאה ומאשר ובכך מודל המתאים ויוו . דלקת ריאות טיפוסי מודלים להשתמש חיסון תוך-אפי, אשר פיקדונות מופרז אורגניזמים מחוץ הריאות, גורם לסיבוכים את המטרה ואת הסימפטומים, כגון סינוסיטיס, דלקת רפידת הקיבה, דלקת מעיים, טראומה פיזית או microparticle יש ערפל לחקות אירוסול מורחים אופיינית של דלקת ריאות נגיפית, tuberculous או פטרייתי. מודלים אלה אינן משקפות במדויק בפתוגנזה של טיפוסי הקהילה או בריאות-רכשה בדלקת ריאות חיידקית. לעומת זאת, מודל זה מאתר של הלוע התחתון שאיפה דלקת ריאות מחקה את התוואי droplet רכשה בריאות דלקת ריאות. ההשעיה לתוך oropharynx של עכברים ומורדמת מזריקים µL 50 של החיידקים גורמת השאיפה רפלקסיבי, כשהתוצאה היא דלקת ריאות. במודל זה, ניתן לבחון בפתוגנזה של פתוגנים הגורמים לדלקת ריאות וטיפולים חדשים כדי להילחם במחלות אלה.

Introduction

זיהום בדרכי הנשימה התחתונה היא מחלה מדבקת הקטלני ביותר בעולם הגורם השכיח ביותר למוות במדינות מתפתחות1. ברחבי העולם, זיהומים אלה מהווים יותר מ- 3.2 מיליון מקרי מוות1. בנוסף, דלקת ריאות nosocomial הוא בין הצורות קטלני ביותר של שירותי בריאות רכשה זיהומים, והיא נגרמת על ידי הכי עמידים לאנטיביוטיקה פתוגנים2,3. התוואי טיפוסי של רכישה של דלקת ריאות חיידקית לשניהם רכשה הקהילה ואף דלקת ריאות nosocomial היא השאיפה של תוכן הלוע התחתון אל alveoli. מודלים מאתר חקר מחלות אלה לעתים קרובות להשתמש חיסון תוך-אפי4, הפקדת הרבה של החיידקים מחוץ הריאות, גורם לסיבוכים את המטרה ואת סימפטומים כמו סינוסיטיס, טראומה פיזית, אשר incongruent עם המחלה התקדמות האדם שהיו הדגמים שנועדו לחקות. דגמים אחרים עשויים להשתמש באינהלציה צ'יימברס והתקנים micromisting, אשר באופן מדויק יותר לחקות ריאות נגיפית, tuberculous ופטרייתי, אבל לא מדויק מסכם את הדברים בדרך הרגילה של רכישה עבור טיפוסי ריאות חיידקית.

המודל דלקת ריאות השאיפה הלוע התחתון מאתר עשוי להיות מנוצל כדי לדמות את המסלול הטבעי ואת בפתוגנזה של דלקת ריאות חיידקית. על ידי µL 50 לחסן של ההשעיה חיידקיים לתוך oropharynx של עכברים ומורדמת באמצעות פיפטה של, השאיפה רפלקסיבי מתפתח, שתוצאתה דלקת ריאות זיהומית. בעזרת המודל ניתן לבחון בפתוגנזה של פתוגנים הגורמים לדלקת ריאות וטיפולים חדשים כדי להילחם מחלות אלו עם דגם נאמנות גבוהה יותר, יותר לאופרטור דלקות ריאות השאיפה שנצפתה האדם. בנוסף, בניגוד דגמים דומים להדביק דרך חלל הפה5,6, מודל זה מבטיח inoculum מלא מגיע לריאות במקום הבטן, איפה זה יכול לגרום מחוץ לאתר דלקות וזיהומים, כגון דלקת רפידת הקיבה דלקת מעיים. לבסוף, בניגוד אחר מודל שפורסמו אשר דורש laryngoscope, inoculates דרך קנה הנשימה7, מודל זה לא לחסום את דרכי הנשימה עם מחט gavage, לא מצריכה הזרקת למסירה inoculum. במקום זאת, חיסון מסתמך על רפלקס השאיפה הטבעית של העכבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בכל ההליכים הכרוכים חיות תאושר ע י של החוקר אכפת לי חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC).

1. הכנת Inoculum חיידקי

  1. לבודד מושבות חיידקים.
    1. פס זן חיידקי (למשל, א baumannii "HUMC1") באמצעי אגר סטרילי המתאים (למשל, סויה Tryptic אגר), נזהר ליצירת מושבות המבודד.
    2. דגירה על תנאים מתאימים (למשל, בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס).
  2. לגדול תרבות בין לילה.
    1. בחר נציג, המושבה מבודד מהצלחת אגר עם לולאה לחסן סטרילי והשתמש בו לחסן 10 מ ל ציר סטרילי המתאים בינוני (למשל, סויה Tryptic מרק).
    2. לאפשר את הדגימה להגיע שלב נייח תנאים נאותים (למשל, 37 ° C ברעידות-200 סל ד לילה בבקבוקון חרוט פרקו-כובע, 50-mL).
  3. לגדל את תת-תרבות.
    1. העברת 100 μL של תרבות לילה 10 מ ל מרק סטרילי טריים באמצעות פיפטה.
    2. אפשר להגיע שלב מעריכית/יומן תנאים נאותים (למשל, 37 ° C ברעידות ב rpm 200 עבור 3 h בבקבוקון חרוט פרקו-כובע, 50-mL).
  4. לשטוף את תת-תרבות.
    1. הסר את תת-תרבות סביבתו ומוכנסות.
    2. צנטריפוגה ב g × 4,000 עבור 5 דקות כדי הצניפה החיידקים.
    3. האחות וזורקים את תגובת שיקוע.
    4. להוסיף 10 מ ל תמיסת סטרילית באגירה פוספט (PBS) צניפה, מערבולת נמרצות עד resuspended לגמרי.
    5. חזור על שלבים 1.4.2 - 1.4.4 פעמיים, עבור סכום כולל של 3 שוטף.
  5. התאם את ריכוז חיידקי ההשעיה.
    1. באמצעות ספקטרופוטומטרים המודד צפיפות אופטית על 600 nm (OD600), למדוד את הצפיפות האופטית של המתלה חיידקי.
    2. להוסיף PBS סטרילי ההשעיה חיידקי עד הצפיפות האופטית של inoculum טיפות יתר600 של 0.5, באמצעות את משוואת Cאני× Vאני = Cf× Vנ, איפה ריכוז "C", "V" הוא אחסון, "אני" היא ראשונית, ו- "f" היא סופית. * Cf תמיד צריך להיות 0.5; Vf הוא המשתנה לפתור.
    3. אם ההשעיה חיידקי יורד יתר600 של 0.5, centrifuge זה ב g × 4,000 עבור 5 דקות כדי הצניפה החיידקים ולהסיר את הכמות המתאימה של תגובת שיקוע להגיע עם יתר600 של 0.5.
    4. ביצוע דילולים סדרתי ב- PBS סטרילי (למשל, שלושה דילולים בטחונות כדי להשיג × 10 1-6) וצלחת על אגר סטרילי כדי לקבוע מקדם המתאם החושפת את ריכוז חיידקי המושבה יוצרי יחידות מ"ל (CFUs/mL) בבית יתר600 של 0.5.
      הערה: ערך מקדם המתאם תשתנה עבור כל זן של כל מין, צריכה להיקבע לפני inoculum לקראת זיהום.
    5. לאחר קביעת מקדם המתאם, להשתמש בו כדי ליצור inoculum של הריכוז הרצוי (למשל, 2 × 108- 1 × 109 CFUs/mL); אם inoculum הרצוי גדול מ ה OD600 של 0.5, centrifuge את המתלים חיידקי ב g × 4,000 עבור 5 דקות כדי הצניפה החיידקים ולהסיר את הכמות המתאימה של תגובת שיקוע כדי להגיע אל הריכוז הרצוי.
    6. לבצע ויוו מחקרים פיילוט כדי לקבוע את התקפה אלימה של כל בידוד החיידק ב כל זן של העכבר כמו ערכים אלה משתנים בין מבודד חיידקי מאותו המין ועכברים מרקע גנטי. למינים שונים גראם שליליים, ה LD100 בעכברים אמנם בדרך כלל 1-5 × 108 CFUs/עכבר, זנים מסוימים הם קטלני-inocula התחתון.
  6. להקפיא aliquots זהה לשימוש עתידי כמו inocula על פי דרישה, מדויק, כפי שפורסמו בעבר8 (אופציונלי).
    1. להכנת 1 ליטר של חיידקי inoculum כפי שתואר לעיל, העברת שני בקבוקונים חרוט 500-mL, וצנטריפוגה ב 4,000 × g במשך 5 דקות.
    2. למחוק 450 מ של תגובת שיקוע של כל בקבוקון חרוט, resuspend את החבילות של חיידקים תגובת שיקוע הנותרים.
    3. להעביר את inoculum חיידקי מרוכז גביע 250 מ ל המכיל פס מגנטי מערבבים ומערבבים ברציפות על גבי צלחת מערבבים במהירות של 300 סל ד.
    4. להעביר בזהירות בדיוק 600 μL של inoculum חיידקי מרוכז (למשל, 1 × 1010 CFUs/mL) בעזרת פיפטה בקבוקון קריוגני 1.6-mL המכיל 300 בדיוק μL של סטרילי H2O ו- 300 μL של גליצרול סטרילית; לערבב ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
      הערה: גליצרול הדרושים לאחסון ניתן לבלבל את תוצאות הניסוי, לגרום לתמותה עודף ולכן יש צורך לשטוף אותו.
    5. כאשר מוכן לשימוש, להפשיר את הדגימה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. להעביר 1 מ"ל בקבוקון חרוט 50-mL, להוסיף 9 מ של PBS סטרילי, צנטריפוגה ב g × 4,000 עבור 5 דקות כדי הצניפה החיידקים. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend שנקבע מראש כמות CFUs (קפוא ריכוז מניות ב- CFUs/mL × 1 מ"ל) באמצעי אחסון המתאים ל- PBS להגיע הריכוז הרצויה עבור inoculum זיהומית.

2. מאלחש עכברים

  1. קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים
    הערה: הרדמה עם קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים יש משך זמן רב, אשר מציעה מספיק זמן עבור החוקר מי חדש ב- בטכניקה זו כדי להשלים את ההליך חיסון לפני העכבר מתעורר.
    1. הכינו 10 מ"ל של פתרון להזרקה על ידי שילוב של 8.5 מ של pharmaceutifcal כיתה PBS, 1 מ"ל של 100 מ"ג/מ"ל קטמין פתרון מניות (הריכוז הסופי 10 מ"ג/מ"ל), ו- 0.5 מ ל 20 מ"ג/מ"ל פתרון מניות חריגות השירותים הווטרינריים (הריכוז הסופי 10 מ"ג/מ"ל).
    2. לנהל μL 10/g בזריקה (IP) בקרום הבטן (למשל, μL 250 בשביל עכבר 25-g).
    3. משחה אופטלמולוגיות חלות על העיניים של העכברים מרדימים עם קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים כי העיניים שלהם הם נוטים לגרום נזק במהלך תקופות הרדמה.
    4. הנח את העכבר בתוך כלוב ונטר עד שהוא מתעורר מן ההרדמה.
      הערה: החיה לא אמורים להישאר ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
  2. איזופלוריין
    הערה: עכברים במהירות להתעורר מהרדמה איזופלוריין-induced לאחר הוסר מן החדר אינדוקציה, אז שיטת ההרדמה אמורה לשמש רק לאחר להיות בקיאים בכל ההליך חיסון.
    1. מקום העכברים תמים חדר בגודל מתאים אינדוקציה עם חמצן זורם.
    2. לאחר התא נאטם, עזים ומתנגד העכברים באמצעות מכשיר אידוי של דיוק להוסיף איזופלוריין ב 4% (v/v) למשך 5 דקות לפחות; לאשר את ההרדמה על ידי הסרת עכבר מן החדר אינדוקציה ומדידת כמה זמן לוקח להתעורר מהרדמה (~ 60 s).
      הערה: להיות מודעים לכך הרדמה פעמים עשויות להשתנות בהתבסס על המוסדיים הנחיות כמה חיות. עשויים לדרוש יותר מ 5 דקות כדי להיות מורדם לחלוטין.
    3. לשמור על ההרדמה עד 10 דקות על ידי התאמת את הריכוז איזופלוריין ל- 2-3%; אם משך הזמן הכולל של הרדמה > 15 דקות, להחיל משחה אופטלמולוגיות על העיניים של עכברים מורדם.
    4. הנח את העכבר בתוך כלוב ונטר עד שהוא מתעורר מן ההרדמה, כמו שלב 2.1.

3. מזריקים/מדביקים עכברים

  1. להשעות את העכבר anesthetized, לתלות אותה על ידי שלה החותכות העליון על חוט חזק, רזה (למשל, חוט דנטלי) מאובטחת על אובייקט קבוע בגובה כ פעמיים העכבר אורך הגוף (למשל, 20 ס מ) מעל פני השטח ההפעלה (למשל ספסל מעבדה).
  2. משוך בעדינות את הלשון של העכבר מהפה שלו באמצעות מלקחיים סטרילי, הסתיימה בלאנט. להעביר את הלשון אצבע סטרילי, בכפפות כדי למנוע מקרי ריסוק של הלשון של העכבר. החזק את הלשון מחוץ הפה, המאפשר גישה oropharynx ולמנוע בליעה של inoculum לצד.
  3. בעוד אתה מחזיק את הלשון של העכבר, למקם את inoculum 50-μL (חיידקי השעיה) oropharynx באמצעות micropipette; oropharynx ממוקם בצומת של חלל הפה, הלוע לכיוון החלק האחורי של הפה.
    הערה: חשוב מאוד להעביר רק נוזל על-ידי pipetting לעצור את הראשון ב- micropipette. העכבר יפסיק לנשום לכמה שניות כאשר inoculum ממוקם ב oropharynx; בסופו של דבר, השאיפה רפלקסיבי יגרום בעכבר כדי לשאוף את המתלים חיידקי, המצוין על-ידי רעש פצפוץ הייחודי של נוזל נכנס אל הריאות, כשהתוצאה היא דלקת ריאות.
  4. אם inoculum ממוקם לא רחוק בחזרה מספיק כדי לחסום את הנשימה נורמלית, קמצוץ של נארס עם מלקחיים כדי לאלץ את השאיפה רפלקסיבי דרך הפה שאיפת עוקבות inoculum.
  5. לאחר חיסון, לשחרר את הלשון, להסיר את העכבר מן המחרוזת ההשעיה, למקם אותו בתוך כלוב, ונטר עד שהוא מתעורר מן ההרדמה, כמו שלב 2.1.

4. פיקוח על התקדמות המחלה

הערה: בשל סבלם של בעלי החיים, אינדיקטורים שונים יש להשתמש כדי לציין כאשר עכברים הופכים אדעך; המתת חסד צריכה להתבצע בעקבות קביעה זו, על פי פרוטוקול IACUC שאושרו בעבר; סמנים שונים של moribundity כוללים את טמפרטורת הגוף, ירידה במשקל, מראה, הילוך סמנים ביולוגיים אחרים שניתן להשיג דם (למשל, באמצעות iSTAT)9,10,11,12, 13,14,15,16.

  1. המתת חסד העכברים על פי פרוטוקול IACUC שאושרו בעבר (למשל, CO2 ואחריו נקע בצוואר הרחם).
  2. הסר את הריאות העכבר לאללה על ידי חיתוך קנה הנשימה, עורק הריאה, וריד ריאתי קרוב הריאות.
    1. מיקרוסקופ
      1. מקם את הריאות (או חלק) תבנית הדגימה.
      2. למלא את התבנית הדגימה המתחם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (O.C.T.), לגמרי השוקע הרקמה.
      3. להקפיא את הדגימה ב-80 מעלות צלזיוס.
      4. לשלוח את דגימת מעבדה פתולוגיה. סעיף והר על שקופיות מיקרוסקופ.
    2. נטל חיידקי
      1. שוקלים רקמת הריאה על איזון האנליטי.
      2. העברה רקמת הריאה 50-mL חרוט בקבוקון המכיל 2-5 מ של PBS סטרילי (בהתאם לגודל של הרקמה).
      3. Homogenize רקמת הריאה עם מהמגן רקמות.
      4. ביצוע דילולים טורי של homogenate PBS סטרילי כדי להשיג כ 1,000 CFUs/mL, בהתבסס על הצפוי נטל חיידקית בריאות.
        1. לדוגמה, אם צפוי 1 × 109 CFUs/mg, לבצע שלושה דילולים בטחונות: העברת 100 μL של homogenate 9.9 מ של PBS ו מערבולת; זה דילול מטריים הראשון. העברת μL 100 של דילול מטריים הראשונה 9.9 מ של PBS ו מערבולת; זה דילול מטריים השני. העברת μL 100 של דילול מטריים השני 9.9 מ של PBS ו מערבולת; זה דילול מטריים השלישי והאחרון.
        2. אם נטל חיידקית בריאות אינו ידוע, לבצע מגוון של דילולים ללכוד לטווח הצפוי.
      5. Dilution(s) צלחת על אגר סטרילי.
        1. להכין סטרילי Tryptic סויה מרק (TSB) עם פלטות אגר (TSA): לשלב 30 גר' TSB 15 גרם של אגר, 1 ליטר של מים, לערבב עם פגים, מחממים עד רתיחה ב ~ 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דק אפשר מגניב ולאחר מכן אוטוקלב במחזור נוזלי במשך 15 דקות אפשר להצטנן עד ~ 55 ° צלזיוס, העברת טרי בלוק 10 מ"ל TSA כדי עקר פטרי, ולאפשר להתקרר לטמפרטורת החדר. תן יבש על benchtop במשך 2-5 d או חשפו תחת אבטחה הקבינט למשך 10 דקות.
        2. להעביר μL 100 של הדילול צלחת פטרי המכילות TSA סטרילי, המפוזרים על פני TSA באמצעות חרוזים מפזר או זכוכית.
        3. לאחסן הפטרי בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified (קרי, חממה 37 ° C המכיל של גביע 1-L חשפו מלא במים)
      6. לקבוע CFUs/mL ריאות homogenate מבוסס על ציפוי אגר (למשל, 100 CFUs בצלחת TSA עם 100 μL של דילול השלישי והאחרון שתוארו לעיל יהיה 100 CFUs/100 μL × 100דיל #1 × 100דיל #2 × 100דיל #3 = 1 × 109 CFUs/mL).
      7. לחשב את רקמת הריאה CFUs/mg מבוסס על-ידי חלוקת CFUs/mL homogenate הריאה על ידי mg ריאות רקמות/mL homogenate (למשל, אם לדוגמה המתוארים לעיל נעשה שימוש 100 מ ג של רקמת הריאה הומוגני ב 5 מ של PBS, אז 1 × 109 CFUs/mL ÷ 100 מ"ג / 5 מ"ל = 5 × 107 CFUs/mg).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לפי בקפידה את הפרוטוקול, נתונים חזקים הדירים ניתן להשיג בקלות. . זה קריטי לדבוק בקפדנות inoculum מותאם אישית הכנה פרוטוקול של אחת עבור ניסויים כדי להשוות אחד אחד את השני חשוב גם להתמודד כראוי עם עכברים במהלך ההליך זיהום. הקפד למקם עכברים תא הרדמה ללא איזופלוריין. עכברים יכנסו לפאניקה אם הם ממוקמים לתא זה מראש התמלא איזופלוריין, עלולים לחוות מתח עודף, אשר יכול להתפשר תוצאות ניסויית. לאחר הבטחת את מכסה מיכל, לאט להציג איזופלוריין על-ידי מצטבר הגברת הריכוז שלו בין 0% ל- 4% (v/v); בחופזה ניהול איזופלוריין יכול גם לגרום עכברים להיכנס לפאניקה. ברגע והעכברים הופכים ללא הכרה, להפחית את ריכוז איזופלוריין ל 2-3% (v/v) ולאפשר להם להישאר בבית הבליעה במשך כמה דקות נוספות. בשלב זה, עכברים. הם מוכנים להיות נגוע (איור 1).

הסר עכבר מן החדר הרדמה, לתלות אותו. על-ידי שלה החותכות העליון כדי לאפשר גישה הלשון (איור 2). שימוש הסתיימה בלאנט מלקחיים להוציא בעדינות את הלשון (איור 3) ואז להעביר ללשון שנערך מלקחיים סטרילי, העטויה בכפפה אצבעות (איור 4) כדי למנוע טראומה הלשון של העכבר. עם הלשון עדיין מחוץ לפה, להעביר את inoculum 50-µL oropharynx (איור 5). כאן, חשוב מאוד להעביר רק נוזל על-ידי pipetting לעצור את הראשון ב- micropipette. המשך אל התחנה השנייה ניתן להציג בועה גדולה לתוך inoculum המפריע הזיהום.

לאחר הזיהום הושלמה, יש מספר עצום של אפשרויות לבדיקת עכברים. ללימודים פתוגנזה, ניתן להשוות uninfected לרקמות הנגוע (איור 6). אם ניתוח היעילות של הריפוי, אחד יכול להסיר את הריאות ולגרום לו למחלקה, צבעונית. ניתן לבצע זאת בנקודת זמן אחת או בנקודות זמן מרובים כדי להציג התקדמות המחלה (איור 7).

אפשרות נוספת היא להעריך את הנטל חיידקי של הריאות של עכברים נגועים. פעולה זו מתבצעת על-ידי הסרת הריאות, העברת בקבוקון המכיל נפח ידוע של PBS סטרילי, ואז homogenizing עם מהמגן רקמות (שטיפה בין כל דגימה כדי למנוע זיהום לחצות). ציפוי דילולים טורי של homogenate ריאות על אגר עשירות מאפשר חישוב של CFUs/mL עבור כל ריאה homogenate ולאחר מכן CFUs/mg רקמת הריאה (איור 8). זה גם יכול להיעשות בנקודת זמן אחת או בנקודות זמן מרובים כדי להציג את התקדמות המחלה.

ישנם אין ספור מבחני אחרים שניתן לבצע, כולל ניתוחים ציטוקין (איור 9), אלח דם סמנים ביולוגיים על-ידי iSTAT (איור 10), cytometry זרימה לחקור סמני פני שטח התא, סלולרי, פרופיל, RNAseq, וכו '.

Figure 1
איור 1 : קביעת LD100. זה הכרחי להדביק עכברים עם ריכוזים שונים inocula לקביעת ה LD100. כאן, inoculum 2 × 108 CFUs/עכבר הוא גבוה מדי, × 10 57 ו- 2 × 107 נמוכים מדי, × 10 18 . בדיוק כפי שצריך.

Figure 2
איור 2 : לתלות עכברים מאת החותכות העליון. לאחר העכברים הם מרדימים, להסיר עכבר אחד מן החדר אינדוקציה, (A) להשתמש מלקחיים כדי למשוך לולאה של מחרוזת מאובטחת 20-30 ס מ מעל משטח העבודה, (B) להזיז את המחרוזת מאחורי החותכות העליון של העכבר, (ג) להבטיח את המחרוזת מאובטח מאחורי החותכות העליון, ו (D) לתת את העכבר לתלות על ידי החותכות העליון שלה על הלולאה של מחרוזת.

Figure 3
איור 3 : למשוך את הלשון מהפה עם אחיזה מלקחיים והעברת אצבעות העוטות כפפות. לאחר התלייה העכבר על ידי החותכות העליון שלה, (A) להשתמש מלקחיים לאחוז בעדינות את הלשון של העכבר, (B) משוך בעדינות את הלשון, (ג) בקפידה להעביר את הלשון מלקחיים אצבעות העוטות כפפות כדי למנוע טראומה של העכבר לשון, ו (D) להחזיק את הלשון במקום עם האצבעות בכפפה. הקפד להחיל מספיק לחץ. כדי למנוע את הלשון של גולשות בחזרה לתוך הפה. אבל לא כל כך הרבה לחץ הטראומה מתפתח. הלשון יוחזקו מחוץ העש, לצד כדי לאפשר גישה micropipette בשלב הבא. בשלב זה, העכבר מוכן זיהום.

Figure 4
איור 4 : להדביק את העכבר. שמירה על הלשון מחוץ לפה, להשתמש micropipette כדי להעביר את inoculum 50-µL oropharynx. למקם את הטיפ pipet בתוך הפה בחלק האחורי הלשון, לוותר על ההשעיה חיידקי, הולך רק העליון הראשון-micropipette; לא ללכת העצירה השנייה כמו זה יכול להציג בועה גדולה לתוך inoculum יכול להפריע שאיפה מלאה.

Figure 5
איור 5 : Micrograph של בריא לעומת (נגוע) נגוע רקמת הריאה. Hematoxylin ואאוזין (H & E) צביעת סעיפים ריאה לפני ואחרי השאיפה הלוע התחתון של א baumannii, אשר recapitulates את המסלול של הנשמה-הקשורים לדלקת ריאות (ידינו), וכתוצאה מכך מוות בדרך כלל תוך 1-3 ימים, מכתשי ניכר דלקת כפי שניתן לראות כאן.

Figure 6
איור 6 : להעריך את הנטל חיידקי; הודפס מחדש, לשנות עם הרשאה14 . לאחר הדבקה עכברים, להסיר את הריאות על ידי ניתוח בעקבות המתת חסד מוצלחת בהתאם לפרוטוקול IACUC ישים. לאסוף את המסה של רקמת הריאה, להעביר בקבוקון המכיל אמצעי ידוע (2-5 מ ל) ל- PBS סטרילי, ואז homogenize עם מהמגן רקמות. הקפידו לשטוף את מהמגן עם אתנול וביו -PBS סטרילי בין כל מדגם למניעת זיהום צולב. ביצוע דילולים טורי של homogenate ריאות צלחת דילולים שונים על אגר עשירות, תקופת דגירה כראוי של המחלה שבחרת. לחשב את CFUs/mL עבור כל homogenate ריאות בהתבסס על דילול × CFUs/צלחת, ולאחר מכן לחלק מאת homogenate ריאות רקמות/mL mg ריאות. ניתן לבצע זאת בנקודת זמן אחת או בנקודות זמן מרובים כדי להציג את התקדמות המחלה. Medians מוצגות עם קווי שגיאה המייצגים טווח בין רבעוני. p < אלייך 0.05 לעומת קבוצה שלא טופלו.

Figure 7
איור 7 : Micrograph של רקמת הריאה הנגוע, מטופל לעומת מטופלים; הודפס מחדש, לשנות עם הרשאה14 . לאחר הדבקה עכברים, להסיר את הריאות על ידי ניתוח בעקבות המתת חסד מוצלחת בהתאם לפרוטוקול IACUC ישים. לשמר כראוי את הרקמות (למשל, שקוע בתוך ג'ל טמפרטורה אופטימלית חיתוך, קפוא ב-80 מעלות צלזיוס) ואז שולחים לפתולוגיה מעבדה או אדם מיומן אחר חלוקתה, צביעת. ניתן לבצע זאת בנקודת זמן אחת או בנקודות זמן מרובים כדי להציג את התקדמות המחלה.

Figure 8
איור 8 : ניתוח ציטוקין; הודפס מחדש, לשנות עם הרשאה14 . כדי לנתח ציטוקינים במחזור, להשיג מספיק דם (למשל, µL 50 דרך הזנב חותך), לאפשר מצב של קרישת חסר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה-1000 g × 10 דקות ב 4 ° C, ולאסוף סרום supernatant. הסרום ניתן לנתח אז מאת Luminex מולטיפלקס עבור ציטוקינים. ניתן לבצע זאת בנקודת זמן אחת או בנקודות זמן מרובים כדי להציג את התקדמות המחלה. Medians מוצגות עם קווי שגיאה המייצגים טווח בין רבעוני. p < 0.05 שטופלו לעומת לא מטופל קבוצה בשלב-באותו זמן.

Figure 9
איור 9 : אלח דם סמנים ביולוגיים; הודפס מחדש, ששונה עם הרשאה14 . כדי לנתח אלח דם סמנים ביולוגיים, להשיג דם µL 75 (למשל, דרך הזנב חותך) ולהעביר במהירות מחסנית iSTAT שבודקת analytes הרצוי. ניתן לבצע זאת בנקודת זמן אחת או בנקודות זמן מרובים כדי להציג את התקדמות המחלה. Medians מוצגות עם קווי שגיאה המייצגים טווח בין רבעוני. p < 0.05 שטופלו לעומת לא מטופל קבוצה בשלב-באותו זמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי להיות בטוח, עכברים אינם בני אדם מיניאטורי. התוצאות המתקבלות מן העכבר מודלים חייב להיות נחשב בהקשר, ולאחר מכן לפרש עבור הישימות לבני אדם, המבוסס על השונה והדומה בין שני מינים6. חשוב גם לבחור המתח העכבר המתאים כמו מסוימים רגישים יותר לזיהומים מסוימים יותר מאחרים; אותו הדבר חל על המתח הפתוגן של הבחירה16.

זה חיוני כדי לבצע זיהומים בצורה מדויקת, מאוד לשחזור. Inocula יכול להיות קטלני לעכברים-ערך אחד אך לא מזיק אפילו 90% של הערך. לכן, זה הכרחי כי כל התנאים המפורטים ב פרוטוקול זה מועתקים במהדורת באותה הדרך בדיוק, במיוחד בעת הכנת את inoculum, בעת הדבקה. בנוסף, כל פתוגן יגרום במחלה inoculum ייחודי. לכן, יש צורך לבצע ניסויים פיילוט כדי לקבוע את inoculum המתאים עבור כל זן של הפתוגן, כל זן של העכבר.

עם חיידקים גראם שליליים, inoculum של ≤5 × 108 CFUs/עכבר מספיקה לגרום למוות של זנים מידבק. מומלץ לא להשתמש זנים כי הם קטלניים ≤1 × 109 CFUs/עכבר כי הם מציעים רלוונטיות מפוקפק פתוגנזה בהתבסס על הכמות העצומה של החומר שיוצבו לתוך הריאות ה-16.

. בהשוואה לאחרים, ישנם סיבוכים מעטים מאוד טכני עבור דגם דלקת ריאות השאיפה הלוע התחתון, הפארמצבטית הוא גדול בהרבה. סיבוך קטין אחד בלבד של תוצאות המודל כאשר המתח השטח מסביב inoculum 50-µL oropharynx מאפשר נשימה באף, מסלק את השאיפה סיבת הזיהום. במקרה זה, פשוט צובט את נארס עם מלקחיים מאלץ השאיפה רפלקסיבי דרך הפה שאיפת הבאים inoculum כדי לגרום לדלקת ריאות זיהומית. עם זאת, זה תקלה טכנית על ידי הטכנאי, אשר הוא נמנע בקלות עם אימון מינימלי.

מבחינת להתאמתו לצורכי מחלות אנושיות, המגבלה אחד של מודל זה, כמו דגמים אחרים של זיהומים חיידקים גראם שליליים, הוא מהירות התקדמות המחלה. בני אדם נגועים לעיתים רחוקות עם סיילין גדול השעיה חיידקי, ולכן עכברים התקדמות מחלת כל כך מהר. עם זאת, כל הטיפולים שאושרו על-ידי ה-FDA עוברים כאלה הקרנות המחקר translational במודלים של בעלי חיים כדי להעריך את הפוטנציאל הטיפולי שלהם לפני שהמשכנו ניסויים קליניים בבני אדם. באופן אירוני, מהירות של המודל הוא גם תכונה מושכת, שכן זה יכול לספק בהירות על יעילות טיפולית בתוך תקופה קצרה של זמן.

המודל מאתר לא מושלם, אבל זה דגם עם היכולת לחקות בנאמנות את התוואי של זיהום, פתוגנזה של מחלות האדם להעריך את היעילות של הרפוי פוטנציאליים, ובכך לאפשר לתרגום מהיר של טיפולים חדשניים זה נדרשים נואשות במרפאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות בבית מכוני הבריאות הלאומיים [גרנט מספרים R01 AI117211 R01 AI130060, R21 AI127954, R42 AI106375 כדי BS], מינהל המזון והתרופות האמריקאי [חוזה HHSF223201710199C כדי BML].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BD 214530 Combine with TSB to make TSA
Beads, Borosilicate Glass Kimble 135003 Sterilize by baking or autoclaving before each use
Beaker, 250 mL Pyrex 1003 Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula
Centrifuge Sorvall ST 40R Capable of 4,000×g at 4°C
Chamber for Anesthesia Kent Scientific Corporation VetFlo-0720 Accommodates up to 5 mice
Cryomold, Intermediate Size Sakura Tissue-Tek 4566 Disposable vinyl specimen molds, 15×15×5 mm
Dental Floss Oral-B 37000469537 Tie to stable post approx. 6" above table height
Forceps VWR 82027-440 Used to gently pull tongue out of mouse's mouth
Homogenizer for Lung Tissue Omni International TM125-115 Autoclave before first use; rinse between samples
Isoflurane for Anesthesia Abbott 10015516 Alternative drug can be used; modify procedure accordingly
iSTAT Cartridge Abbott 03P79-25 Various cartridges are available to suit your needs
Ketamine, 100 mg/mL Western Medical Supply 4165 Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL
Ointment for Eyes Akorn Tears Renewed Avoid touching eye with tip of dispenser
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound Fisher Scientific 23-730-571 Used to freeze lung samples at -80 °C to prepare for pathology sectioning
Petri Dish VWR 25384-302 Polystyrene, disposable, sterilized, 100×15 mm
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CM Dulbecco's PBS without calcium and magnesium
Pipette Tips, 200-μL VWR 10017-044 Autoclave before use
Pipetter, 200-μL Gilson Pipetman P200 Autoclave and calibrate before use
Spreader, Bacterial Cell Bel-Art F377360006 Sterilize by baking or autoclaving before each use
Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter × 38.1 mm Length VWR 58948-150 Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting
Stir Plate, Magnetic Corning PC-620D Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting
Tryptic Soy Broth (TSB) BD 211822 Combine with Agar to make TSA
Vial, Conical, Sterile, 50 mL Corning 431720 Used for preparing bacterial inocula
Vial, Conical, Sterile, 500 mL Corning 431123 Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula
Vial, Cryogenic, 2.0 mL Corning 430659 Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula
Xylazine, 20 mg/mL Akorn AnaSed Injection Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Media Centre, W. H. O. World Health Organization. Fact Sheet - Top 10 Causes of Death. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
  2. Spellberg, B., Talbot, G. H. Recommended Design Features of Future Clinical Trials of Antibacterial Agents for Hospital-Acquired Bacterial Pneumonia and Ventilator-Associated Bacterial Pneumonia. Clinical Infectious Diseases. 51 (S1), S150-S170 (2010).
  3. Kalil, A. C., et al. Management of Adults With Hospital-acquired and Ventilator-associated Pneumonia: 2016 Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society. Clinical Infectious Diseases. 63 (5), e61-e111 (2016).
  4. Medina, E. Murine model of pneumococcal pneumonia. Methods in Molecular Biology. , 405-410 (2010).
  5. Azoulay-Dupuis, E., et al. In vivo efficacy of a new fluoroquinolone, sparfloxacin, against penicillin-susceptible and -resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (12), 2698-2703 (1992).
  6. Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (3), L387-L398 (2008).
  7. Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
  8. Nielsen, T. B., Bruhn, K. W., Pantapalangkoor, P., Junus, J. L., Spellberg, B. Cryopreservation of virulent Acinetobacter baumannii to reduce variability of in vivo studies. BMC Microbiology. 15, 252 (2015).
  9. Trammell, R. A., Toth, L. A. Markers for predicting death as an outcome for mice used in infectious disease research. Comparative Medicine. 61 (6), 492-498 (2011).
  10. Bast, D. J., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  11. Hankenson, F. C., et al. Weight loss and reduced body temperature determine humane endpoints in a mouse model of ocular herpesvirus infection. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (3), 277-285 (2013).
  12. Adamson, T. W., Diaz-Arevalo, D., Gonzalez, T. M., Liu, X., Kalkum, M. Hypothermic endpoint for an intranasal invasive pulmonary aspergillosis mouse model. Comparative Medicine. 63 (6), 477-481 (2013).
  13. Nielsen, T. B., et al. Diabetes Exacerbates Infection via Hyperinflammation by Signaling through TLR4 and RAGE. mBio. 8 (4), (2017).
  14. Nielsen, T. B., et al. Monoclonal Antibody Protects Against Acinetobacter baumannii Infection by Enhancing Bacterial Clearance and Evading Sepsis. Journal of Infectious Diseases. 216 (4), 489-501 (2017).
  15. Cheng, B. L., et al. Evaluation of serotypes 5 and 8 capsular polysaccharides in protection against Staphylococcus aureus in murine models of infection. Human Vaccine Immunotherapy. 13 (7), 1609-1614 (2017).
  16. Wong, D., et al. Clinical and Pathophysiological Overview of Acinetobacter Infections: a Century of Challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).

Tags

רפואה גיליון 136 מחלות זיהומיות המודל מאתר דלקת ריאות השאיפה הלוע התחתון ההנשמה-הקשורים לדלקת ריאות דלקת ריאות רכשה החולים
השאיפה הלוע התחתון מאתר מודל של הנשמה-הקשורים ו רכשה החולים בדלקת ריאות חיידקית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nielsen, T. B., Yan, J., Luna, B.,… More

Nielsen, T. B., Yan, J., Luna, B., Spellberg, B. Murine Oropharyngeal Aspiration Model of Ventilator-associated and Hospital-acquired Bacterial Pneumonia. J. Vis. Exp. (136), e57672, doi:10.3791/57672 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter