Summary
עבודה זו מספקת שיטה הזיוף של פלטפורמות מבוססות-droplet microfluidic לבין היישום של microspheres לזיהוי עבור הגברה ננו-ספירה-PCR. שיטת ננו-ספירה-PCR מאפשר לקבל חד גדילי DNA amplicons מבלי המפריד בין שני גדילי ה-DNA.
Abstract
מיקרופלואידיקה מבוסס-droplet מאפשרים ייצור אמין microspheres הומוגנית בערוץ microfluidic, מתן הגודל מבוקרת של המורפולוגיה של ננו-ספירה שהושג. ננו-ספירה copolymerized עם בדיקה acrydite-DNA היה מפוברק בהצלחה. ניתן להשתמש בשיטות שונות כגון PCR אסימטרי, עיכול אקסונוקלאז, בידוד על מצופים streptavidin beads מגנטי לסנתז DNA חד-גדילי (ssDNA). עם זאת, שיטות אלה לא ניתן להשתמש ביעילות כמויות גדולות של ssDNA נקיים במיוחד. כאן, אנו מתארים ננו-ספירה-PCR פרוטוקול המפרט איך ssDNA יכול להיות ביעילות מוגבר, הופרדו dsDNA פשוט על-ידי pipetting של צינורית תגובת ה-PCR. ההגברה של ssDNA יכול להיות מיושם כמו ריאגנטים פוטנציאליים עבור DNA microarray ותהליכים (שיטתית האבולוציה של ליגנדים על ידי העשרת מעריכית) דנ א-SELEX.
Introduction
דנ א חד גדילי (ssDNA) בהרחבה נחשב כרכיב הכרה מולקולרית (MRE) בשל תכונותיו מהותי עבור ה-DNA-DNA הכלאה1,2. פיתוח מערכות סינתטי ssDNA יכול להוביל יישומים ביולוגיים כגון ה-DNA מיקרו-מערכים3, oligotherapeutics, אבחון משולב חישה מולקולרי המבוסס על אינטראקציות משלימים4,5.
עד כה, חלקיקי הפולימר בקנה מידה מיקרומטר בהצלחה הוכחו באמצעות מכשירי microfluidic. מספר טכניקות microfluidic הוכחו להיות חזק להפקת microspheres מאוד הומוגנית על זרימה רציפה ב6,הסביבה microchannel7.
במחקר של Lee. et al. 8, פלטפורמה מבוססת-droplet microfluidic לסינתזה microfluidic של הגברה oligo-ננו-ספירה, ssDNA copolymerizable, דווח. פלטפורמת microfluidic מורכב שתי שכבות PDMS (polydimethylsiloxane): חלק עליון עם רשת ערוץ microfluidic ליצירת ננו-ספירה ו תחתון חלק שטוח. הבאנדש שלושה סוגים של ערוצי fluidic PDMS: 1) זרם התמקדות ערוץ לדור droplet 2) ערוץ סרפנטין לערבוב שני פתרונות, 3) ערוץ הפילמור רציפים התמצקות ננו-ספירה. לאחר שני זורם immiscible הם הציגו לתוך ערוץ fluidic PDMS אחד, שאפשר להכריח את הזורם דרך מבנה צר דיזה. ההתנהגויות זרימה כגון ערוץ גאומטריה, קצב הזרימה צמיגות להשפיע על הגודל ועל מורפולוגיה של ננו-ספירה. לכן, ניתן לחלק לזרם המרכזי נוזלי microscale monospheres9,10.
. הנה, ננו-ספירה מפורט-PCR פרוטוקול מסופק עבור ההגברה של ssDNA. ראשית, מתואר תהליך עיצוב של התקן מבוסס-droplet microfluidic. לאחר מכן, הדרך באילו לזיהוי microspheres יכול להיות functionalized עם תבנית ה-DNA אקראית באופן משלים הוא הסביר. לבסוף, מוצג עבור הגברה ssDNA פרוטוקול ננו-ספירה-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור של פלטפורמה Microfluidic PDMS
- הכן 20 מ של נוזל PDMS prepolymer על ידי ערבוב בסיס פולימר ו זרז על יחס נפח של 10:1. יוצקים 10 מ"ל של הנוזל PDMS על גבי תבנית מוכנה SU-8 על רקיק סיליקון עבור החלק העליון של הרשת microfluidic. עבור החלק התחתון שטוח, יוצקים באותו אמצעי אחסון של PDMS נוזלי-פרוסות הסיליקון ללא מבנה עובש.
הערה: הרשת microfluidic הוא תוכנן בתוכנית CAD והוסב ואז photomask על מנת לפברק מאסטר באמצעות תהליך פוטוליתוגרפיה טיפוסי (ראה דמויות משלימה). המאסטר הזה מורכב כייר SU-8 photoresist שלילי פרוסות סיליקון11. - מניחים שתי פרוסות סיליקון מצופים prepolymer PDMS הנוזלי על פלטה ועל התרופה ב 75 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- באופן ידני לקלף את השכבה PDMS ריפא מ כייר SU-8. ישר בקוטר 1.5 מ מ סביב החור כלי חבטות אל יציאת שמן על הרשת microfluidic משוכפל עבור התממשקות בקנה מידה מיקרון ערוצי זרימה עם דגימות הנוזל מאקרו. אגרוף החוצה דרך-החור באופן ידני.
- חזור על פעולה זו ניקוב תהליך שלוש פעמים על היווצרות שני פתרונות והנמל עודפים.
- מבצע הטיפול הידרופילית המשטח העליון והן PDMS הפקדות באמצעות treater corona ידניים12 עבור מספר שניות עבור כל דגימה.
- מחסנית שני שטופלו פלזמה PDMS השכבות ומחממים ב 90 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמצעות צלחת חמה עבור תהליך האיחוי PDMS-אל-PDMS. אספקת מים בלחץ באמצעות המשאבה מזרק לתוך שלוש יציאות כניסת מליטה מבניים ולבדיקה דליפה של המכשיר מפוברק.
2. הפקת לזיהוי Oligo-Microspheres
- להכין חרוז-תערובת מפורט בטבלה1.
- מערבולת, בקצרה צנטריפוגה acrydite ssDNA תקן תוויות החללית (Ap, 100 μM) ואת acrylamide:bis (19:1) מניות פתרון.
- להכין פתרון אני על ידי ערבוב 25 μL של 40% אקרילאמיד המחייבת פתרון, 10 μL של ssDNA (acrydite העצמית), μL 10 5 מאגר x TBE (1.1 מ' טריס; מ מ 900 בוראט; 25 מ מ EDTA) ו- 5 μL של מים. להכין את הפתרון השני עם 50 μL של 20% קירור.
- להכין שני מזרקים בנפרד מלא פתרון אני והפתרון II, והר אותם לתוך למשאבה להציג פתרון זורם לתוך פלטפורמת microfluidic. להכין שמן מינרלי מעורבב עם 0.4% TEMED על משטח ייבוש של ננו-ספירה.
הערה: TEMED הינו ידוע כמייצב רדיקלים חופשיים. רדיקלים חופשיים יכולים להאיץ את קצב היווצרות פולימר עם קירור (APS) על מנת לעודד אקרילאמיד הפילמור. - למלא בקבוק זכוכית עם 4 מ של שמן מינרלי כדי ליצור זרימה רצופה.
- להוסיף שני צינורות כדי שתי יציאות הפקק של הבקבוק זכוכית כמו מאגר microfluidic: הנמל פנאומטיים להחלת ואוויר דחוס לתוך בקבוק הזכוכית את מדחס אוויר והנמל נוזלים לאספקת הנפט מווסת לרשת מיקרו ערוץ מהבקבוק זכוכית. לחבר את הצינורות בין בקבוק הזכוכית את נמל הנפט במכשיר microfluidic.
- להתחבר הצינורות פתרון שתי היציאות בהתקן microfluidic כדי לספק את הפתרונות שני ממשאבות מזרק. להכניס צינורות ליציאת ה-outlet כדי להעביר את ננו-ספירה שנוצר לתוך הספל.
- הגדר את קצב הזרימה של משאבת מזרק 0.4 - 0.7 מ ל/ה, התאם אוויר דחוס בלחץ של מדחס באמצעות הרגולטור (82-116 kPa). הגדר את מהירות הסיבוב (500 סל ד) של שורת פגים במיכל זכוכית על פלטה חמה. לנתח את משאבת מזרק והענק ואוויר דחוס שנוצר על ידי מדחס חיצוני לתוך בקבוק הזכוכית באמצעות הפקד ON/OFF של שסתומים אלקטרומגנטית13.
- להתבונן היווצרות של microspheres ב גאומטריה זרימה-התמקדות ומיצוק של microspheres שנוצר במיכל זכוכית עם מיקרוסקופ דיגיטלי.
הערה: גודל וייצור ממהירות ננו-ספירה תלויים flowrate של פתרונות, למידת הלחץ המופעל על זרימת שמן מינרלי (טבלה 2).
3. ביצוע לזיהוי Oligo-Microspheres נחשב
- על כימות hemocytometer, לקחת כמות קטנה (כ-100 μL) של תמיסה מימית לזיהוי oligo-microspheres ומקום על hemocytometer זכוכית, ומלא בעדינות ההשעיה ננו-ספירה את הבאר לשכת ספירה.
הערה: לקבלת פרטים נוספים, עיין http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer. - השתמש מונה טלי מיקרוסקופ ויד לספור microspheres במערכת אחת 16 ריבועים. לאחר מכן, להעביר hemocytometer את הסט הבא של התא, תמשיכו לספור עד כל ארבע קבוצות של 16 פינות נספרים.
- לקבוע את ספירת הממוצע ננו-ספירה, לחשב את מספר microspheres חרוז ההשעיה המקורית.
- העברת μL 100 של microspheres צינור microcentrifuge 1.5 mL. הסר את תגובת שיקוע דרך עדין צריך שתוציאו (400 x גרם) ו pipetting.
4. ביצוע את ה-DNA הכלאה על פני השטח של Oligomicrosphere לזיהוי
הערה: זהות DNA בדיקה עם 5'-NH2-הקבוצה, במקום 5'-acrytide שינוי נוסף לתוך פתרון אני ונבדק המכילות Ap microspheres במקביל. תוצאות הדנ א הכלאה מוצגים באיור2. הפתרון רגשים (cAp) התווית על-ידי Cy3 oligonucleotide משלימים יוצב בחדר חשוך.
- Resuspend Cy3-קאפ באמצעות μL 100 1xTE מאגר (TE מאגר: 10 מ מ EDTA טריס, 1μM, pH 8.0) על מנת להשיג ריכוז סופי של 100 μM. לדוגמה, resuspend pmol 1 של קאפ ב- 100 מ של מאגר TE ואת העברת צינור microcentrifuge מכוסה ברדיד אלומיניום.
הערה: רצפים סטרנד, עיין בטבלה 3. - להוסיף 100 μM של Cy3-קאפ צינור microcentrifuge mL 1.5 סטרילי המכיל microspheres Ap-copolymerized.
- הקש על הצינור כמה פעמים כדי לערבב דגירה בטמפרטורת החדר בחושך 1 h.
- למחוק את תגובת שיקוע ולהסיר מאגר שיורית דרך pipetting.
- לשטוף שלוש פעמים עם μL 500 טה המאגר.
- Resuspend microspheres על-ידי הקשה בעדינות את הצינור microcentrifuge. . אז, חזור על שלב 4.4.
- במקום microspheres על שקופיות זכוכית (75 מ"מ x 50 מ"מ) ומכסים ברדיד אלומיניום לפני הדמיה.
5. אסימטרית PCR עבור הגברה ssDNA
- להכין תערובת ריאגנט PCR אסימטרי הגברה ssDNA כדי להיות מנותח. להפשיר את ריאגנטים בטבלה 4 על קרח. אל תשמור את האנזים פולימראז Taq (U 50/µL) על קרח, אבל מעדיף לאחסן אותו ב-20 ° C עד שהוא נדרש.
- מערבולת בעדינות כל ריאגנטים, אז בקצרה צנטריפוגה צינורות ב 10,000 g x 10 s.
- שילוב כל ריאגנטים כפי שמתואר בטבלה 4.
- למקם את דגימות thermocycler ולהתחיל את ה-PCR אסימטרי בתנאים הבאים: 25 מחזורי (95 ° C ל 30 s, 52 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס ל 30 s), 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, להחזיק ב 4 º C.
6. ננו-ספירה-PCR עבור הגברה ssDNA
הערה: סעיף זה מתאר הפרוטוקול עבור הגברה ssDNA בשפופרת תגובת ה-PCR. ננו-ספירה-PCR תגובות בוצעו ב- 50 μL של התגובה האחסון. רצפי מפורט נהגה להגביר ssDNA מפורטים בטבלה 5. במקרה זה, Ap על פני השטח של microspheres יכולים anneal לתבניות DNA אקראית באופן משלים. זהו צעד חשוב מאוד לייצור גדילי DNA משלימים (צירוף ד. נ antisense, איור 3). ה-DNA מורחב משמש כתבנית עבור הגברה ננו-ספירה-PCR.
- להכין תערובת ריאגנט ננו-ספירה-PCR. להפשיר את ריאגנטים טבלה 6 על הקרח; עם זאת, אל תשמור את האנזים פולימראז Taq על הקרח. אחסן אותו ב-20 ° C עד שהוא נדרש.
- מערבולת בעדינות כל ריאגנטים, אז בקצרה צנטריפוגה צינורות ב 10,000 g x 10 s.
- להשיג כ ~ 25 microspheres דרך ספירת מיקרוסקופיים.
הערה: מספר microspheres בצינור אחד תגובה מחושבים באמצעות מיקרוסקופ אור עם 40 X הגדלה. על 25 ~ microspheres משמשים עבור הגברה ננו-ספירה-PCR. מידע מפורט יותר הוא בשלב 3. - שילוב כל ריאגנטים כפי שמתואר טבלה 6-
- למקם את דגימות thermocycler ולהתחיל את ה-PCR אסימטרי בתנאים הבאים: 25 מחזורי (95 ° C ל 30 s, 52 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס ל 30 s), 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, להחזיק ב 4 º C.
- הגברה הבאים, להוסיף 8 μL של 6 x טעינת מאגר וטען μL 15 של כל מדגם לתוך 2% agarose ג'ל. לאחר מכן, לבצע אלקטרופורזה ב- 100 וולט למשך 35 דקות ב- 1 x TAE (טריס-אצטט-EDTA, 40 מ מ טריס אצטט, 1 מ מ EDTA, pH 8.2) מאגר.
7. מיקרוסקופיה קונפוקלית רכישה
הערה: התוצאות של ננו-ספירה-DNA בדיקה הכלאה הם עם תמונה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. ניתוח תמונות מתבצעת באמצעות ImageJ.
- לתקן את microspheres hybridized לשלב של המיקרוסקופ בעל.
- בחר את הלייזר (לייזר הליום/ניאון, 543 קו ננומטר) ולהדליק בשליטה לייזר.
- בחר את העדשה המטרה בשליטה מיקרוסקופ.
- בחר את המסנן הרצוי עבור Cy3 וערוץ בבקרת תצורה.
- להתחיל את הניסוי ולבחון את הדגימה. הגדרות עבור מיקרוסקופ קונפוקלי מסוכמות בטבלה 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פלטפורמת ה-microfluidic מבוסס-droplet פולימריים מפוברק מורכב PDMS שתי שכבות (איור 1 א'). שלושה סוגים של רשתות ערוץ microfluidic משמשים ליצירת microspheres: 1) זרימה-התמקדות הגיאומטריה כפי שמוצג איור 1b, 2) ערוץ סרפנטין לערבוב פתרון אני והפתרון II ו- 3) ערוץ הפילמור ננו-ספירה התמצקות. הגובה של כל הערוצים היה 60 μm. אורך הערוץ עבור ערבוב ו הפילמור היו 74.35 מ מ, 94.45 מ מ, בהתאמה. רוחב microchannel עבור שני זורם נוזל immiscible ואחד עבור זרימת שמן מינרלי היו 100 μm 200 μm, בהתאמה. המבנה דיזה המשמש עבור ננו-ספירה היווצרות היה של 50 μm אורך ורוחב μm 25. הזווית של המבנה מפזר היה 37°. מערכת שליטה פנאומטיים במעבדה מבוסס על זרימה רציפה של שמן מינרלי, שני צנתרים זרימה פתרון (איור 1 c) שימשו ליצירת microspheres ברציף microfluidic (איור 1 d). קצב הייצור של microspheres היה microspheres בערך 30 לשניה כאשר קצב הזרימה של פתרונות ולחץ יישומית היו ב 0.6 מ"ל/h ו 108 kPa, בהתאמה (טבלה 2). הקוטר שלה בערוץ מיקרו הוא 78.7 ± 2.5 מטר. הסינתזה על זרימה של microspheres יכול להיות שהצליח לתפעל באמצעות המכשיר microfluidic. חרוז גדלים נמדדו אחרי הנפיחות. קוטר ממוצע microspheres וכתוצאה מכך היה ± 150.4 12.8 m. הווריאציות גודל היו כ- 8.5%. Microspheres עוברים נפיחות במים, וכתוצאה מכך עלייה בגודלו העצום.
המאפיין copolymerizable של ננו-ספירה יכולים להיות מגוונים. אנחנו שולבו בדיקה 5'-acrydite-DNA הפתרון ננו-ספירה (פתרון, ראה טבלה 1). בעקבות שיתוף פלמור, בדיקה DNA משלימים תווית הפלורסנט, Cy3, בטמפרטורת החדר במשך ה 1 Confocal מיקרוסקופ יכול לשמש כדי להוכיח את הסינתזה של copolymerizable oligomicrospheres הכלאה גם פונקציונלית פני השטח של microspheres. פלורסנט תמונות של ננו-ספירה מוצגים באיור2. אם microspheres הן functionalized כראוי עם החללית 5'-acrydite-DNA, הם צריכים תוצאה בסיקור של פעילות פלורסנט על פני השטח במהלך הניסוי הכלאה. אם copolymerization לא התרחשה כראוי, התמונה האופטי ננו-ספירה התערוכה פנימי-זיהום פנימה microspheres. כפי שמוצג באיור2, יש למנוע התערבות של כיוון אקראי-פנים. תוצאה זו מאפשרת לנו לבצע את המצגת בדיקה DNA תלת-ממדי (3-D) סידור, ננו-ספירה-PCR. יצוין כי בדיקה דנ א זהים עם 5'-NH2-הקבוצה, במקום שינוי 5'-acrytide לא copolymerize במהלך הסינתזה-זרימה של ננו-ספירה8.
בעת עבודה עם microspheres, מניפולציה פני השטח התלת-ממדי oligo-גשש הדנ א הוא הרבה יותר מהר תהליך14. לכן, פלטפורמה סינתזה על זרימה ננו-ספירה יכול לספק את כלי ssDNA הגברה, טיהור, כמתואר באיור3. תבנית ה-DNA תחושה אנטי (-, תבנית משלימים) ניתן להרחיב על-ידי הוספה של תבנית ה-DNA אקראי (+, תבנית). במקרה זה, copolymerized בתחילה 5'-Ap מספק קצה 3'-הו הפילמור דנ א לאחר חישול לתבנית המשלימה שלה (76 nt). ננו-ספירה-PCR יכול להתבצע ב microtube ה-PCR יחיד באמצעות functionalized microspheres, תבנית ה-DNA אקראי פריימר תג-קדימה. על מנת לבדל את amplicons ssDNA הנובעת מתבנית DNA אקראי (+ תבנית, 76 nt), פריימר לפנים יש תג נוקלאוטיד 24 נוספים. אם פריימר לפנים לא קיים רצף תג נוספים, קשה מאוד לזהות בין ssDNA amplicons את תבנית ה-DNA אקראי הראשונית.
בוצע ניסוי ה-PCR אסימטרי. היינו יכולים לצפות dsDNA מזהמים, כפי שמוצג באיור4. ברוב המקרים, זה הכרחי לבודד ssDNA באמצעות beads מגנטי מצופה streptavidin ואקסונוקלאז עיכול. עם זאת, ננו-ספירה-PCR עושה שימוש יעיל פריימר יחיד (תג-קדימה פריימר) לצבור ssDNA פאזה מימית. הוא צפוי כי dsDNA מזהמים יצרף אל פני השטח של microspheres. לכן, ניתן להשיג ssDNA amplicons דרך pipetting ללא צורך צנטריפוגה. SsDNA הנובעת הודגם על-ידי השוואתה את סמני גודל סינתטי (76 nt ssDNA ו- 100 nt ssDNA) בעזרת ג'ל אלקטרופורזה ניתוח.
איור 1: פלטפורמת microfluidic. (א) פלטפורמה מפוברק microfluidic, (ב) להגדיל תצוגה של הגיאומטריה תוך התמקדות זרימה, הגדרת הניסוי (ג), ו (ד) בשבי תמונות מציג מהדור microspheres רציף. 1: מבנה מיקרו ערוץ זרימה התמקדות גאומטריה, 2: לערבוב פתרונות, 3: עבור ננו-ספירה התמצקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: פלורסנט readout הכלאה הדנ א על פני השטח של microspheres. 5'-Acrydite-שינוי ה-DNA רגשים (Ap) היו מסוגלים hybridizing עם Cy3 משלימה הנקרא DNA רגשים (cAp). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: איור של פרוטוקול ננו-ספירה-PCR- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: השוואה בין PCR אסימטרי קונבנציונאלי ננו-ספירה-PCR- מ'; ssDNA מרקר (76mer ו- 100mer), ליין 1; PCR אסימטרי, ליין 2; גרגרי-PCR. הודפס מחדש באישור עבודה קודמת8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מגיב | נפח בתמהיל (μL) | ריכוז סופי | |
| פתרון אני | פתרון Acrylamide:bis 40% (19:1) | 25 | 10% |
| 100 μM Acrydite בדיקה (Ap, 5' - Acrydite-(TTTTTTT, מקשר רצף) אגא TTG CAC TTA CTA TCT-3') | 10 | 10 ΜM | |
| 5 X TBE מאגר (טריס-בסיס-EDTA) | 10 | 0.5 X | |
| מים | 5 | - | |
| הפתרון השני | 20% קירור | 50 | 10% |
| הפתרון השלישי | TEMED (N,N,N′ ′N-Tetramethylethylenediamine) | 8 | 0.40% |
| שמן מינרלי | 1000 | - | |
טבלה 1. ריאגנט שילוב מרכיבי על זרימה לזיהוי ננו-ספירה סינתזה.
| מצב תפעולי | ננו-ספירה קצב הייצור |
|
| פתרון flowrate | לחץ שמן | |
| (mL/h) | (kPa) | (/ סק) |
| 0.4 | 82 | 7.1 |
| 0.5 | 94 | 13.3 |
| 0.6 | 108 | 28.9 |
| 0.7 | 116 | 36.5 |
בטבלה 2. סיכום של תנאים מבצעיים, ננו-ספירה המיוצר.
| בדיקת דנ א | רצפים |
| Cy3 הנקרא oligonucleotide משלימה בדיקה (cAp) | 5'-Cy3-AGATAGTAAGTGCAATCT-3' |
| תג (24 שעות הראשונות nt)-פריימר לפנים | 5'-GGT AAT ACG מעשה CAC TAT AGG איסור פרסום אתא המרכז לאמנות עכשווית GCT TAT TCA ATT-3' |
בטבלה 3. מידע רצף ה-DNA הגששים.
| מגיב | נפח עבור התגובה 1 x (μL) | ריכוז סופי |
| תבנית ה-DNA אקראי | 1 | 1 ng/μL |
| פריימר תג-קדימה | 1 | 0.4 ΜM |
| פריימר הפוכה | 1 | ΜM 0.02 נקודות |
| 10 X Taq מאגר | 5 | 1 X |
| 10 מ מ של dNTP | 4 | 2.5 מ מ |
| לשעבר taq (1000U) | 0.2 | 1 U |
| מים | 37.8 | - |
| סה | 50 | - |
בטבלה 4. ריאגנט PCR אסימטרי לערבב מרכיבים בתגובה 20 L.
| תבנית | רצף | אורך (nt) |
| תבנית ה-DNA אקראי | 5'-ATA המרכז לאמנות עכשווית GCT תאת TCA ATT (רצף אקראי, 40 mer) אגא תג TAA חברתנו TCT סי-3' | 76 |
| תג-קדימה פריימר (תג-נ) | 5'-GGT AAT ACG מעשה CAC TAT AGG איסור פרסום אתא המרכז לאמנות עכשווית GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| פריימר הפוכה | 5'-AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3... ' | 18 |
טבלה 5. רצף מידע עבור ננו-ספירה-PCR.
| מגיב | נפח עבור התגובה 1 x (μL) | ריכוז סופי |
| Ap-Microspheres | ~ 25 microspheres | - |
| תבנית ה-DNA אקראי | 1 | 1 ng/μL |
| פריימר תג-קדימה | 1 | 0.4 ΜM |
| 10 X Taq מאגר | 5 | 1 X |
| dNTP 10 מ מ | 4 | 2.5 מ מ |
| לשעבר taq (1000U) | 0.2 | 1 U |
| מים | 37.8 | - |
| סה | 50 | - |
טבלה 6. ננו-ספירה-PCR ריאגנט לערבב מרכיבים בתגובה 50 ליטר.
| מצב הסריקה | המטוס |
| שינוי קנה מידה | X: 2.49 μm, y: 2.49 μm |
| גודל מחסנית | X: 1272.79 μm, עבודה ביום 1272.79 μm |
| סרוק זום | 0.7 |
| המטרה | EC תוכנית-Neofluar 10 x / 0.3 M27 |
| ממוצע | 1 |
| חריר | Ch2: 104. |
| מסננים | Ch3: LP 420 |
| מפצלי הקרן | MBS: HFT 488 / 543, DBS1: ראי, DBS2: NFT 515, FW1: אף אחד |
| אורך גל | 543 nm 100.0% |
טבלה מס ' 7. הגדרות עבור מיקרוסקופ קונפוקלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מזהמים של dsDNA הם נושא מרכזי ב- ssDNA הגברה. זה נשאר קשה למזער את dsDNA הגברה קונבנציונאלי אסימטרי PCR הגברה15. בנוסף, למרות שיפורים טכניים ליצירת ssDNA אפשרו לנו להגדיל את היעילות של תפוקה של הדוגמה, בידוד ssDNA הוא עדיין בעייתי בשל העלויות הגבוהות שלה טיהור לא שלם לקידומם.
PCR אסימטרי הוא אחד מהשיטות המאתגרים ביותר המשמשים לעבודה עם ssDNA. שיטה זו חלה כמויות שוויוני של פריימר (למשל, 20: 1 יחס) על מנת לייצר כמויות גדולות של ssDNA. עם זאת, קשה מאוד למטב את כל התגובה הגברה להניב ssDNA. לכן, חייבים לסלק לוואי (dsDNA) מ ה resultants4.
על מנת ליצור ssDNA ללא צעדים נוספים ההפרדה, שהפקנו לזיהוי microspheres לחשוף את הגששים DNA המבוסס על שיטת copolymerization acrydite. שיטת מצורף שלנו DNA הותאמה בקלות באמצעות פלטפורמה מבוססת-droplet microfluidic. Oligomicrospheres copolymerized שיש microscale קטרים יוצרו בהצלחה. כתוצאה מכך, ננו-ספירה-PCR שימש כדי להגביר את ssDNA בתגובה יחיד-שפופרת. כמובן, כדי להתאים את הליך זה לניסויים אחרים PCR, בדרך כלל ההתאמות הנחוצות (למשל, שינוי מחזור הגברה, חישול טמפרטורה, ורצפים תבנית) נדרשים. לסיכום, ננו-ספירה-PCR היו מפורטות כאן, הופכים אותו לזמין עבור פיתוח bioassay, רצפי DNA, וניתוח microarray DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי פרוייקט שכותרתו "קואופרטיב תכנית המחקר עבור חקלאות מדע & טכנולוגיה פיתוח (פרויקט מס ' PJ0011642) "ממומן על ידי המינהל לפיתוח כפרי, הרפובליקה של קוריאה. מחקר זה נתמכה גם בחלקו על ידי מענק (ה-NRF-2017R1A2B4012253) של התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן (ב- NRF) במימון של משרד המדע, ICT ותכנון העתיד, הרפובליקה של קוריאה. מחקר זה גם נתמך על ידי מענק (N0000717) של התוכנית לחינוך עבור מדמין והתכנסות תעשייתי ממומן על ידי משרד המסחר, התעשייה, האנרגיה, הרפובליקה של קוריאה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
References
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al.
- Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
- Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
- Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
- Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
- Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
- Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).
- Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
- Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
- Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).
- Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).
