Summary
Este trabalho fornece um método para a fabricação de plataformas baseadas em gotículas microfluidic e a aplicação de microesferas de poliacrilamida para amplificação por PCR-microesfera. O método de PCR-microesfera torna possível obter single-stranded DNA amplicons sem separar o DNA de cadeia dupla.
Abstract
Baseado em gotículas microfluídica permite a produção confiável de microesferas homogêneas no canal microfluídicos, fornecendo controlado tamanho e morfologia da microesfera obtida. Uma microesfera copolymerized com uma sonda de acrydite-DNA foi fabricada com sucesso. Diferentes métodos como PCR, digestão do exonuclease e isolamento em grânulos magnéticos streptavidin-revestido assimétrica podem ser usados para sintetizar o DNA de cadeia simples (ssDNA). No entanto, estes métodos eficientemente não utilizam grandes quantidades de ssDNA altamente purificado. Aqui, descrevemos um protocolo de microesfera-PCR detalhando como ssDNA pode ser eficientemente amplificado e separado do dsDNA simplesmente por pipetagem de um tubo de reação de PCR. A amplificação do ssDNA pode ser aplicada como reagentes potenciais para a DNA microarray e processos de DNA-SELEX (evolução sistemática dos ligantes por enriquecimento exponencial).
Introduction
Single-stranded DNA (ssDNA) tem sido amplamente considerado como um elemento de reconhecimento molecular (ERM) devido a suas propriedades intrínsecas para hibridação de DNA-DNA1,2. O desenvolvimento de sistemas sintéticos ssDNA pode levar a aplicações biológicas, tais como o DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnóstico e detecção molecular integrada com base em interações complementares4,5.
Até à data, as partículas de polímero do micrômetro-escala tem sido com sucesso demonstradas usando dispositivos microfluídicos. Várias técnicas de microfluidic tem sido provadas para ser poderoso para produzir altamente homogêneas microesferas em fluxo contínuo no ambiente microchannel6,7.
No estudo de Lee et al . 8, uma plataforma baseada em gotículas microfluidic para a síntese de microfluidic de amplificação oligo-microesfera e ssDNA copolymerizable foi relatado. A plataforma microfluidic consiste de duas camadas PDMS (polidimetilsiloxano): uma parte superior com uma rede de canais microfluídicos para gerar microesfera e um parte plana de fundo. Estes consistem de três tipos de canais fluídico PDMS: 1) um fluxo de focagem canal para geração de gotículas, 2) é um canal de serpentino para misturar as duas soluções e 3) um canal de polimerização sequencial para solidificação de microesfera. Uma vez que dois fluxos imiscíveis são introduzidos em um único canal PDMS fluídico, os fluxos podem ser forçados através da estrutura de orifício estreito. Os comportamentos de fluxo como geometria do canal, taxa de fluxo e viscosidade afetam o tamanho e morfologia da microesfera. Portanto, o principal fluxo de líquido pode ser dividido em microescala monospheres9,10.
Aqui, um protocolo detalhado microesfera-PCR é fornecido para a amplificação do ssDNA. Em primeiro lugar, um processo de design do dispositivo baseado em gotículas microfluidic é descrito. Então, a maneira na qual poliacrilamida microesferas podem ser acrescidas com modelo de DNA aleatório de modo complementar, é explicada. Finalmente, um protocolo de microesfera-PCR para amplificação ssDNA é mostrado.
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Protocol
1. fabricação de uma plataforma de Microfluidic PDMS
- Prepare-se 20 mL de líquido pré-polímero PDMS pela mistura de polímero base e catalisador em uma relação de volume de 10:1. Despeje 10 mL do líquido PDMS em um molde de SU-8 preparado em uma bolacha de silício para a parte superior da rede microfluidic. Para a parte inferior plana, despeje o mesmo volume de líquido PDMS na bolacha de silicone sem uma estrutura de molde.
Nota: A rede microfluídicos é projetada em um programa de CAD e então convertida em uma Fotomáscara para fabricar um mestre usando o processo de fotolitografia típico (veja as Figuras suplementar). Este mestre é composto do molde negativo fotorresiste SU-8 sobre a bolacha de silício11. - Coloque dois wafers de silício revestidos com líquido pré-polímero PDMS na chapa quente e cura a 75 ° C por 30 min.
- Manualmente, retire a camada PDMS curada do molde SU-8. Alinhe um 1,5 mm de diâmetro redondo buraco ferramenta de perfuração para o porto de óleo na rede microfluidic replicada para interfaceamento canais de fluxo mícron-escala com as amostras de fluido de macro. Um soco do através de-furo manualmente.
- Repeti este processo três vezes para a formação de duas soluções e a abertura de saída de perfuração.
- Realizar o tratamento de superfície hidrofílico no superior e camadas PDMS de fundo usando um Hand-Held corona tratador12 durante vários segundos por exemplo.
- Pilha de dois tratados com plasma camadas PDMS e calor a 90 ° C por 30 minutos usando uma chapa quente para o processo de ligação de PDMS-para-PDMS. Fornecer a água pressurizada usando a bomba de seringa nas três portas de entrada para a colagem estrutural e teste de vazamento do dispositivo fabricado.
2. produção de poliacrilamida Oligo-microesferas
- Prepare o grânulo-mistura detalhada na tabela 1.
- Vórtice e brevemente centrifugar o acrydite ssDNA padrão rotulado sonda (Ap, 100 μM) e acrylamide:bis (19:1) solução.
- Preparar a solução eu misturando 25 μL de 40% do acrilamido bis solução, 10 μL de ssDNA (sonda de acrydite), 10 μL de tampão de x TBE 5 (1,1 M Tris borato de 900 mM; 25 mM EDTA) e 5 μL de água. Prepare a solução II com 50 μL de persulfato de amónio de 20%.
- Preparar duas seringas individualmente preenchido com solução eu e a solução II e montá-los para a bomba de introduzir a plataforma microfluidic fluxos de solução. Preparar o óleo mineral misturado com 0,4% TEMED para solidificação da superfície da microesfera.
Nota: TEMED é conhecido como um estabilizador de radicais livres. Os radicais livres pode acelerar a taxa de formação do polímero com persulfato de amónio (APS) a fim de catalisar a polimerização da acrilamida. - Encha a garrafa de vidro com 4 mL de óleo mineral para gerar um fluxo contínuo.
- Inserir dois tubos para duas portas na tampa da garrafa de vidro como um reservatório de microfluidic: porta pneumática para aplicação de ar comprimido para o frasco de vidro para o compressor de ar e o porto de fluido para o fornecimento de óleo pressurizado para a rede de micro canal a garrafa de vidro. Conecte os tubos entre o frasco de vidro e o porto de óleo no dispositivo microfluidic.
- Conecte os tubos para as portas de duas solução no dispositivo microfluidic para suprir as duas soluções de bombas de seringa. Inserir os tubos à porta de saída a fim de transferir a microesfera gerada para o copo.
- Defina a taxa de fluxo da bomba de seringa para 0,4 - pressão de ar comprimido de ajuste de 0,7 mL/h. o compressor usando um regulador (82-116 kPa). Defina a velocidade de rotação (500 rpm) da barra de agitador magnético no copo de vidro em uma chapa quente. Acione a bomba de seringa e fornecer o ar comprimido gerado por um compressor externo para o frasco de vidro usando o controle ON/OFF de uma válvula eletromagnética13.
- Observe a formação de microesferas na geometria de fluxo-foco e solidificação de microesferas geradas no copo de vidro com um microscópio digital.
Nota: A velocidade de produção e tamanho da microesfera dependem do caudal de soluções e a pressão aplicada para o fluxo de óleo mineral (tabela 2).
3. realização de poliacrilamida Oligo-microesferas conta
- Para quantificação de hemocytometer, tomar uma pequena quantidade (aproximadamente 100 μL) de solução aquosa de poliacrilamida oligo-microesferas e coloque sobre o vidro hemocytometer e preencher suavemente a microesfera suspensão até o poço da câmara de contagem.
Nota: Para obter mais detalhes, consulte http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer. - Use um microscópio e mão contador de contagem para contar microesferas em um conjunto de 16 quadrados. Em seguida, mover a hemocytometer para o próximo conjunto de câmara e continue contando até que todos os quatro conjuntos de 16 cantos são contados.
- Determinar a contagem média microesfera e calcular o número de microesferas a suspensão original do grânulo.
- Transferi 100 μL de microesferas para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Remova o sobrenadante com centrifugação (400 x g) suave e pipetagem.
4. realização de hibridização de DNA na superfície do Polyacrylamide Oligomicrosphere
Nota: Uma idêntico DNA sonda com uma 5'-NH2-grupo em vez de 5'-acrytide modificação é adicionado na solução e testado para Ap-contendo microesferas em paralelo. Hibridização de DNA é mostradas na Figura 2. A solução de sondas (cAp) de Cy3-rotulado complementares do oligonucleotide deve ser colocada em um quarto escuro.
- Resuspenda Cy3-cAp usando 100 μL de tampão de 1xTE (tampão TE: 10 mM Tris e 1μM EDTA, pH 8.0) para atingir uma concentração final de 100 μM. Por exemplo, resuspenda 1 pmol de cAp em 100 mL de tampão TE e transferir para um tubo de microcentrifugadora coberto com papel alumínio.
Nota: Para sequências de vertente, consulte a tabela 3. - Adicione 100 μM de Cy3-cAp para um tubo de microcentrifugadora estéril de 1,5 mL contendo microesferas de Ap-copolymerized.
- Bater os tubos algumas vezes para misturar e incubar a temperatura ambiente no escuro durante 1 h.
- Desprezar o sobrenadante e remover o buffer residual através de pipetagem.
- Lavar três vezes com 500 μL de tampão TE.
- Resuspenda microesferas tocando suavemente o tubo de microcentrifugadora. Em seguida, repita a etapa 4.4.
- Coloque microesferas sobre a lâmina de vidro (75 x 50 mm) e cubra com folha de alumínio antes da imagem latente.
5. assimétrica PCR para amplificação ssDNA
- Prepare uma mistura de reagente PCR assimétrica para amplificar ssDNA para ser analisado. Descongele os reagentes no quadro 4 no gelo. Não mantenha a enzima de Taq polimerase (50 U / µ l) no gelo, mas prefiro guardá-la a-20 ° C até ser necessário.
- Vórtice delicadamente todos os reagentes e brevemente centrifugar tubos a 10.000 x g por 10 s.
- Combine todos os reagentes como descrito no tabela 4.
- Colocar as amostras em um thermocycler e começar o PCR assimétrico nas seguintes condições: 25 ciclos (95 ° C por 30 s, 52 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s), 85 ° C por 5 min, segure a 4 ° C.
6. micro-PCR para a amplificação ssDNA
Nota: Esta seção descreve o protocolo para amplificar ssDNA em um tubo de reação de PCR. Reações de microesfera-PCR foram realizadas em 50 μL de volume de reação. As sequências detalhadas usadas para amplificar ssDNA estão listadas na tabela 5. Neste caso, Ap na superfície das microesferas pode anneal para modelos aleatórios de DNA de forma complementar. Este é um passo muito importante para a produção de DNA complementar (cadeia de DNA antisentida, Figura 3). O DNA estendido é usado como um modelo para amplificação por PCR-microesfera.
- Prepare a mistura de reagente microesfera-PCR. Descongele os reagentes na tabela 6 no gelo; no entanto, não mantenha a enzima de Taq polimerase no gelo. Armazená-lo a-20 ° C até ser necessário.
- Vórtice delicadamente todos os reagentes e brevemente centrifugar tubos a 10.000 x g por 10 s.
- Obter cerca de 25 ~ microesferas através de contagem microscópica.
Nota: O número de microesferas no tubo de uma reação é calculado utilizando um microscópio com ampliação de 40 X. Cerca de 25 ~ microesferas são utilizadas para amplificação por PCR-microesfera. Informações mais detalhadas é na etapa 3. - Combine todos os reagentes como descrito no tabela 6.
- Colocar as amostras em um thermocycler e começar o PCR assimétrico nas seguintes condições: 25 ciclos (95 ° C por 30 s, 52 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s), 85 ° C por 5 min, segure a 4 ° C.
- Amplificação de seguir, adicionar 8 μL de 6 x tampão de carregamento e carregar 15 μL de cada amostra em gel de agarose 2%. Em seguida, executar eletroforese a 100 V por 35 min em 1 x TAE (Tris-Acetato-EDTA, 40 mM Tris Acetato, EDTA 1 mM, pH 8,2) reserva.
7. confocal microscopia aquisição
Nota: Os resultados da hibridização da sonda de microesfera-DNA são imagens de um microscópio confocal. Análise de imagem é executada usando o ImageJ.
- Corrigi hibridizadas microesferas para o palco do microscópio em um suporte.
- Selecione o laser (laser de hélio/Neon, linha de 543 nm) e ligá-lo no controle do laser.
- Selecione a lente objetiva no controle do microscópio.
- Selecione o filtro desejado para Cy3 e canal de controle de configuração.
- Começar o experimento e observar a amostra. Configurações para o microscópio confocal estão resumidas na tabela 7.
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Representative Results
A plataforma fabricada poliméricos baseados em gotículas microfluidic consiste de duas camadas PDMS (Figura 1a). Três tipos de redes de canais microfluídicos são usados para a geração de microesferas: geometria 1) fluxo de focagem como mostrado na Figura 1b, 2) é um canal de serpentino para misturar a solução, eu e a solução II e 3) um canal de polimerização para microesfera solidificação. A altura de todos os canais era 60 μm. O comprimento de canal para mistura e polimerização foram 74,35 e 94,45 mm, respectivamente. As larguras do microchannel para dois fluxos fluidos imiscíveis e o outro para fluxo de óleo mineral foram 100 μm e 200 μm, respectivamente. A estrutura de orifício usada para formação de microesfera era de 50 μm de comprimento e 25 μm de largura. O ângulo da estrutura difusor foi de 37°. Um sistema de controle pneumático em laboratório para fluxo contínuo de óleo mineral e duas bombas de seringa para o fluxo de solução (Figura 1C) foram usados para a geração de microesferas na plataforma microfluidic (Figura 1D). A velocidade de produção de microesferas foi microesferas cerca de 30 por segundo quando a taxa de fluxo da pressão aplicada e soluções foram a 0,6 mL/h e 108 kPa, respectivamente (tabela 2). Seu diâmetro no micro canal é 78.7 ± 2,5 m. A síntese de no fluxo de microesferas pode ser manipulada com êxito usando o dispositivo microfluidic. Tamanhos do grânulo foram medidos após o inchaço. O diâmetro médio das microesferas resultantes foi 150.4 ± 12,8 m. As variações de tamanho foram cerca de 8,5%. As microesferas passam por inchaço na água, resultando em um aumento de tamanho enorme.
A propriedade copolymerizable de microesfera pode ser variada. Incorporamos uma sonda de 5'-acrydite-DNA em solução a microesfera (solução, ver tabela 1). Após polimerização co, uma sonda de DNA complementar é rotulada com corante fluorescente, Cy3, à temperatura ambiente por 1 h. Confocal microscopia pode ser usada para provar a síntese de oligomicrospheres copolymerizable hibridização como funcional, bem como sobre a superfície de microesferas. Imagens fluorescentes da microesfera são mostradas na Figura 2. Se microesferas são corretamente acrescidas com a sonda de 5'-acrydite-DNA, eles devem resultar na cobertura da actividade fluorescente na superfície durante o experimento de hibridização. Se copolimerização não ocorrer corretamente, a imagem óptica microesfera iria expor contaminação interna dentro as microesferas. Como mostrado na Figura 2, não há nenhuma interferência da orientação aleatória-interior. Este resultado permitiu-nos realizar a apresentação de sonda de DNA em um 3-dimensional (3D) arranjo e microesfera-PCR. Note-se que um DNA idêntico sonda com uma 5'-NH2-grupo em vez de uma modificação de 5'-acrytide não copolymerize durante a síntese de no fluxo de microesfera8.
Ao trabalhar com microesferas, manipulando a superfície 3-d com oligo-sonda de DNA é a muito mais rápido processo.14. Portanto, uma plataforma de síntese no fluxo de microesfera pode fornecer uma ferramenta para amplificação ssDNA e purificação, conforme descrito na Figura 3. O modelo de DNA antisenso (-, modelo complementar) pode ser estendida pela adição de um modelo de DNA aleatório (+, modelo). Neste caso, o inicialmente copolymerized 5'-Ap fornece uma extremidade 3'-OH para polimerização de DNA após recozimento para seu modelo complementar (76 nt). Microesfera-PCR pode ser realizada em um único microtubo PCR utilizando microesferas funcionalizadas, um modelo de DNA aleatório e uma cartilha de Tag para a frente. A fim de distinguir os amplicons ssDNA resultante do modelo aleatório de DNA (modelo, 76 + nt), o primer para a frente tem uma marca de 24 nucleotídeos adicionais. Se o primer para a frente não tem uma sequência de marca adicional, é muito difícil reconhecer entre ssDNA amplicons e o modelo inicial de DNA aleatório.
Foi realizado um experimento PCR assimétrico. Fomos capazes de observar dsDNA contaminantes, como mostrado na Figura 4. Na maioria dos casos, é necessário isolar ssDNA usando grânulos magnéticos streptavidin-revestido e digestão do exonuclease. No entanto, microesfera-PCR faz uso eficiente de um único primer (cartilha de Tag-frente) para acumular ssDNA em fase aquosa. Espera-se que os contaminantes dsDNA irão anexar à superfície de microesferas. Portanto, ssDNA amplicons pode ser obtido através de pipetagem sem a necessidade de centrifugação. O ssDNA resultante foi demonstrada por comparando-a com os marcadores de tamanho sintético (76 nt ssDNA e 100 nt ssDNA) através de análise de eletroforese de gel.
Figura 1: A plataforma microfluidic. (a) fabricados microfluidic plataforma, (b) ampliado vista da geometria do fluxo de focagem, montagem experimental (c) e (d) capturou imagens mostrando a geração contínua de microesferas. 1: estrutura de micro canal para o fluxo de focagem geometria, 2: para a mistura de soluções, 3: para a solidificação de microesfera. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: leitura fluorescente de hibridização de DNA na superfície de microesferas. Sondas de DNA 5'-Acrydite-modificado (Ap) foram capazes de cruzamento com Cy3 complementares rotulado de sondas de DNA (PAC). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: ilustração do protocolo microesfera-PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: comparação entre PCR assimétrico convencional e microesfera-PCR. M; ssDNA marcador (76mer e 100mer), Lane 1; PCR assimétrico, Lane 2; Microbeads-PCR. Reproduzido com permissão da anterior trabalho8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Volume de mistura (μL) | Concentração final | |
| Solução | Solução de Acrylamide:bis de 40% (19:1) | 25 | 10% |
| Sonda de Acrydite 100 μM (Ap, 5' - Acrydite-(TTTTTTT, sequência de vinculador) AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3') | 10 | 10 ΜM | |
| 5 x tampão TBE (Tris-base-EDTA) | 10 | 0,5 X | |
| Água | 5 | - | |
| Solução II | Persulfato de amónio 20% | 50 | 10% |
| Solução III | TEMED (N,N, ′ deN, ′ deN-tempted) | 8 | 0,40% |
| Óleo mineral | 1000 | - | |
Tabela 1. Componentes de mistura reagente para síntese de microesfera de poliacrilamida em fluxo.
| Condição operacional | Microesfera velocidade de produção |
|
| Caudal de solução | Pressão de óleo | |
| (mL/h) | (kPa) | (/ seg) |
| 0.4 | 82 | 7.1 |
| 0,5 | 94 | 13.3 |
| 0.6 | 108 | 28,9 |
| 0.7 | 116 | 36,5 |
Tabela 2. Resumo das condições operacionais e microesfera produzida.
| Sonda de DNA | Sequências de |
| Cy3 rotulado sonda complementar do oligonucleotide (cAp) | 5'-Cy3-AGATAGTAAGTGCAATCT-3' |
| Marca (primeiras 24 nt)-encaminhar a cartilha | 5'-GGT AAT ACG ATO CAC TAT AGG MORDAÇA ATA CCA GCT TCA TAT ATT-3' |
Tabela 3. Informações de sequência de sondas de DNA.
| Reagente | Volume para reação de 1 x (μL) | Concentração final |
| Modelo de DNA aleatório | 1 | 1 ng/μL |
| Cartilha de etiqueta para a frente | 1 | 0,4 ΜM |
| Primeira demão reversa | 1 | 0,02 ΜM |
| 10x buffer de Taq | 5 | 1 X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0.2 | 1 U |
| Água | 37,8 | - |
| Total | 50 | - |
Tabela 4. Reagente PCR assimétrico misturar componentes na reação de 20 L.
| Modelo | Sequência de | Comprimento (nt) |
| Modelo de DNA aleatório | 5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT (sequência aleatória, 40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| Cartilha de etiqueta-Forward (Tag-F) | 5'-GGT AAT ACG ATO CAC TAT AGG MORDAÇA ATA CCA GCT TCA TAT ATT-3' | 42 |
| Primeira demão reversa | 5'-AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
Tabela 5. Informações de sequência de microesfera-PCR.
| Reagente | Volume para reação de 1 x (μL) | Concentração final |
| AP-microesferas | microesferas de ~ 25 | - |
| Modelo de DNA aleatório | 1 | 1 ng/μL |
| Cartilha de etiqueta-Forward | 1 | 0,4 ΜM |
| 10x buffer de Taq | 5 | 1 X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0.2 | 1 U |
| Água | 37,8 | - |
| Total | 50 | - |
Tabela 6. Reagente de microesfera-PCR misturar componentes de reação de 50 L.
| Modo de digitalização | Avião |
| Dimensionamento de | X: 2,49 μm, y: 2,49 μm |
| Tamanho da pilha | X: 1272.79 μm, y: 1272.79 μm |
| Varredura de zoom | 0.7 |
| objetivo | CE plano-Neofluar 10 x / 0,3 M27 |
| Média | 1 |
| Pinhole | CH2: 104... |
| Filtros | Ch3: LP 420 |
| Divisores de feixe | MBS: HFT 488 / 543, DBS1: espelho, DBS2: 515 NFT, FW1: nenhum |
| Comprimento de onda | 543 nm 100,0% |
Tabela 7. Configurações para o microscópio confocal.
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Discussion
Contaminantes de dsDNA são um grande problema no ssDNA amplificação. Continua a ser difícil minimizar dsDNA amplificação em PCR amplificação assimétrica convencional15. Além disso, apesar de melhorias técnicas para gerar ssDNA permitiram-na aumentar a eficiência da taxa de transferência de amostra, ssDNA isolamento ainda é problemático devido a seus elevados custos e rendimentos de purificação incompleta.
PCR assimétrico é um dos métodos mais desafiadores usados quando estiver trabalhando com ssDNA. Este método aplica-se quantidades desiguais de primer (por exemplo, relação 20: 1) a fim de gerar grandes quantidades de ssDNA. No entanto, é muito difícil otimizar cada reação de amplificação para render ssDNA. Assim, os subprodutos (dsDNA) devem ser eliminados do resultantes4.
A fim de gerar ssDNA sem passos adicionais de separação, nós produzimos microesferas de poliacrilamida para expor as sondas de DNA baseadas no método de copolimerização de acrydite. Nosso método de fixação de DNA foi adaptado facilmente usando uma plataforma baseada em gotículas microfluidic. Copolymerized oligomicrospheres ter diâmetros de microescala com êxito foram produzidos. Consequentemente, microesfera-PCR foi utilizada para amplificar o ssDNA em uma único tubo de reação. Claro, para adaptar esse procedimento para outros experimentos PCR, comumente os ajustes necessários (por exemplo, alterando o ciclo da amplificação, recozimento modelo sequências e temperatura) são necessários. Em conclusão, microesfera-PCR tem sido detalhada aqui, tornando-o disponível para desenvolvimento de bioensaio, sequenciamento de DNA e análise de DNA microarray.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Este estudo é apoiado por um projeto intitulado "cooperativa programa de pesquisa para agricultura Science & Technology Development (projeto n. º PJ0011642) "financiado pela administração do Desenvolvimento Rural, República da Coreia. Esta pesquisa foi também parcialmente suportada por um fundo (NRF-2017R1A2B4012253), do programa de pesquisa de ciência básica através da Fundação Nacional pesquisa (NRF), financiado pelo Ministério da ciência, TIC & planejamento futuro, República da Coreia. Esta pesquisa também foi apoiada por uma bolsa (N0000717) do programa de educação para criativo e convergência industriais financiados pelo Ministério do comércio, indústria e energia, República da Coreia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
References
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