Summary
Ici, nous montrons comment utiliser un test de ligature de proximité (PLA) pour visualiser MST1/MST2 hétérodimérisation dans les cellules fixes à haute sensibilité.
Abstract
Interactions de protéine-protéine réglementés sont un principe directeur pour de nombreux événements de signalisation, et la détection de tels événements est un élément important pour comprendre comment ces voies sont organisés et comment ils fonctionnent. Il existe de nombreuses méthodes pour détecter des interactions protéine-protéine dans les cellules, mais relativement peu peuvent être utilisés pour détecter des interactions entre protéines endogènes. Une de ces méthodes, le dosage de la ligature de proximité (PLA), présente plusieurs avantages pour recommander son utilisation. Par rapport aux autres méthodes courantes d’analyse des interactions protéine-protéine, PLA a la spécificité et la sensibilité relativement élevée, peut être réalisée avec manipulation cellule minimale et, dans le protocole décrit ci-après, nécessite seulement deux spécifique à la cible anticorps provenant de différentes espèces (p. ex.., de souris et le lapin) et un réactif spécialisé : un ensemble d’anticorps secondaires qui sont des oligonucléotides par covalence liés à certains qui, quand à proximité d’un autre, créer un amplifiable plate-forme pour in situ par PCR ou l’amplification de cercle roulant. Dans cette présentation, nous montrons comment appliquer la technique PLA pour visualiser les changements à proximité de MST1 et MST2 dans les cellules fixes. La technique décrite dans ce manuscrit est particulièrement adaptée pour l’analyse des études de signalisation cellulaire.
Introduction
Perturbation de la signalisation de MST1/Hippo a été liée à des troubles du développement et de la carcinogenèse1. Chez les mammifères, les kinases MST1 et MST2 activent (phosphoryler) MOB1 et LATS1/2, dont le dernier puis phosphoryle et inactive l’activateur de la transcription co Oui-associated protein (YAP)2. Sous sa forme active (lieu), YAP a activité oncogénique, améliorant la transcription des gènes de la prolifération cellulaire ; à l’inverse, lorsque YAP est inactivée par la voie de l’hippopotame, la prolifération cellulaire est supprimée et l’apoptose promu3. Dans les tissus, MST1 et MST2 existent principalement sous forme d’homodimères active, mais des stimuli oncogènes peuvent augmenter les niveaux de MST1/MST2 hétérodimères et telles hétérodimères sont inactifs4. Cependant, comment hétérodimérisation MST1/MST2 est réglementée reste mal comprise. Les deux homo - et hétérodimères sont médiée par les interactions entre régions coiled-coil C-terminales de MST1 et MST2 dite SARAH domaines5. En utilisant un in situ PLA démontré dans cet article, nous montrons la présence de MST1/MST2 hétérodimères dans les cellules de Schwann humaine (HSC) et rein embryonnaire humain cellules (HEK-293). PLA a un avantage sur les autres méthodes de détection d’interactions protéine/protéine parce qu’il permet la détection des interactions protéine-protéine endogène, qui peuvent être identifiés et quantifiés sans le besoin d’expression du transgène ou l’utilisation d’étiquettes d’épitope 6.
Signalisation des voies de transduction sont en grande partie contrôlés par l’association conditionnelle des protéines composant. Par exemple, stimulation de la plupart tyrosine kinase entraîne leur homo - ou hétéro-dimérisation et association subséquente avec d’autres protéines de signalisation intracellulaires, qui eux-mêmes formant des complexes plus. L’objectif de la méthode PLA est de visualiser un lien étroit entre les protéines dans les cellules, sous réserve que les protéines sont moins de 30-40 nm apart. Proximité de protéine est généralement détectée en premier en incubant les cellules avec des anticorps primaires appropriés chez les différentes espèces (p. ex.., lapin et souris) contre chaque protéine d’interaction, puis en ajoutant des anticorps secondaires propres à chaque espèce, des sondes d’ADN avant couplé à court. Si les sondes ADN sont à proximité, un oligonucléotide spécifique d’ADN liant pouvez lier simultanément deux de ces sondes, formant une plate-forme pour l’amplification par in situ par PCR ou par mécanisme de cercle de roulement. Étiquettes fluorescentes ajoutés à la réaction d’amplification permettent visualisation des protéines qui interagissent, qui apparaissent comme des points fluorescents qui peuvent être facilement quantifiés et localisés à des régions particulières dans la cellule7,,8, 9 , 10.
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Protocol
1. préparation des Solutions
- Préparer la solution de fixation : 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 1 x. Prendre 10 mL, 2,5 mL de 16 % PFA et ajouter 7,5 mL de PBS 1 x.
Risques : PFA est cancérogène aux doses faibles. Fumées et contact avec la peau sont dangereux. Conserver à-20 ° C. - Préparer la solution de la perméabilisation : 0,1 % Triton X-100 dans du PBS 1 x. Pour 100 mL de solution, ajouter 100 µL de Triton X-100 dans 100 mL de solution 1 PBS x. Conserver à température ambiante (RT).
- Préparer le tampon de lavage : 1 x TBST. Pour 1 L, prendre 100 mL de 10 x TBS 890 mL de dH2O et 10 mL de Tween 20 (10 %).
- Préparer la solution blocage tel que fourni par kit. Vous pouvez également utiliser des solution de PBS 1 x contenant 2 % de BSA.
- Préparer le diluant d’anticorps est livré en kit. Vous pouvez également utiliser des solution de PBS 1 x contenant 1 % de BSA.
2. électrodéposition de cellules
Remarque : Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules de Schwann humaines immortalisé (iHSC) et des cellules humaines embryonnaires rein 293 (HEK 293) ; Toutefois, cette méthode peut être utilisée pour de nombreux types de cellules adhérentes.
- HEK 293 en DMEM supplémenté de 10 % la culture FBS, 0,2 % Glucose, 2 mM de L-Glutamine, 100 U/mL de pénicilline G et 100 µg/mL de streptomycine sur plaques imprégnées de culture tissulaire à 37 ° C à 5 % de CO2. Maintenir iHSC dans 10 % FBS/DMEM supplémenté avec Pen/Strep et 2 µM forskoline. Régulièrement tester les cellules pour les mycoplasmes. Aucune authentification de ligne cellulaire a été réalisée.
- Enrober une coulisse chambre 16 puits 50 µL de 10 µg/mL natural souris laminine ou 0,01 % poly-L-lysine solution et incuber 30 min à 37 ° C à 5 % de CO2. Fractionner les cellules à l’aide de 0,04 % trypsine-EDTA.
- Plaque iHSC et HEK-293 dans 100 µL de milieu à la confluence de 80 % (15 000-25 000 cellules/puits).
- Incuber les cellules pour les 12-24 heures à 37 ° C dans un humidifié, 5 % CO2 incubateur.
3. fixation et Permeabilization
- Enlever le milieu des puits et laver avec 100 µL de solution 1 PBS x. Aspirer avec une micropipette pour minimiser le risque de retrait de l’échantillon.
- Fixer les cellules en ajoutant 50 µL de 4 % PFA par puits et incuber pendant 10 min à RT, sans agitation. Les cellules sont sensibles au détachement, donc éviter de pipetage les solutions directement sur les cellules.
- Laver les cellules avec 0.05 % TBST trois fois de 5 min chacun. Aspirer avec une micropipette pour minimiser le risque de retrait de l’échantillon.
- Traiter les cellules avec solution perméabilisation (0,1 % Triton x-100 en solution 1 PBS x) pendant 10 min sans agitation à température ambiante.
- Laver les cellules avec un mélange TBST trois fois de 5 min chacun, avec agitation.
4. blocage
- Appuyez sur désactiver le TBST (très doucement avec une micropipette). Visualiser la diapositive dans un microscope pour voir si les cellules restent attachées.
- Ajouter une goutte (50-60 µL) de Solution de blocage 1 x dans chaque échantillon.
- Préchauffer une chambre humide (boîte de pointe vide avec de l’eau) à 37 ° C et laisser incuber les lames dedans pendant 1 h à 37 ° C.
5. premier anticorps
- Diluer les anticorps primaires (au 1/100) dans le diluant anticorps (voir Table des matières). Préparer la solution d’anticorps 40 µL / puits.
- Retirez solution bloquante les diapositives en tapotant le liquide. Ne laissez pas les cellules à sécher.
- Vortex et ajouter 40 µL des solutions anticorps dans chaque puits.
- Incuber 1 h à 37 ° C dans une chambre d’humidité préchauffé.
6. proximité ligature test sondes
NOTE : Sondes PLA sont fournis dans le cadre d’un kit (voir Table des matières). Le choix des sondes dépendra de l’espèce des anticorps primaires utilisés pour détecter les protéines d’intérêt.
- Diluer les deux pointes de PLA (anti-souris MINUS et anti-lapin PLUS) 1:5 dans le diluant d’anticorps. Pour chaque échantillon, préparer 40 µL de sonde PLA. Incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante.
- Appuyez sur désactiver la solution de l’anticorps primaire de la glisse. Laver les lames deux fois plus de 5 min chacun, avec le tampon de lavage à température ambiante.
- Doucement, tap de la mémoire tampon de lavage de la glisse et ajouter la solution de sonde PLA diluant à Herbert George wells (40 µL/puits).
- Incuber les lames dans une chambre d’humidité préchauffé pendant 1 h à 37 ° C.
7. ligature
Remarque : L' in situ rouge de réactifs de détection, Ligase et ligature Solution sont fournis dans le cadre d’un kit (voir Table des matières).
- Utiliser l' in situ rouge de réactifs de détection.
- Immédiatement avant l’emploi, vortex et diluer les volumes requis du 5 x stock ligature 1:5 à haut degré de pureté de l’eau.
Remarque : Ne pas stocker les réactifs dilués. - Cliquez sur désactiver la solution de sonde PLA de la glisse. Laver les diapositives en 1 x tampon de lavage deux fois plus de 5 min chacun, à température ambiante.
- Immédiatement avant l’addition aux échantillons, vortex et ajouter Ligase à la solution de ligature à 01:40 dilution et vortex à nouveau.
- Appuyez sur le tampon de lavage de la glisse et ajouter la solution de ligature/Ligase dans chaque cupule (40 µL/puits).
- Incuber les lames dans une chambre d’humidité préchauffé pendant 30 min à 37 ° C.
8. amplification
Remarque : Le stock d’amplification est fourni dans le cadre d’un kit (voir Table des matières). Les réactifs sont sensibles à la lumière ; donc éviter d’exposer les diapositives à la lumière.
- Vortex et diluer les volumes requis du 5 x stock Amplification 1:5 dans de l’eau ultra-pure et mélanger.
- Cliquez sur désactiver la solution de ligature/Ligase de diapositives. Laver les diapositives en 1 x tampon de lavage deux fois plus de 2 min chacun, à température ambiante.
- Vortex et rajouter la polymérase à la solution d’Amplification à la dilution de 1 : 80 et vortex.
- TAP off tampon de lavage de la glisse et ajouter la solution d’Amplification/polymérase dans chaque cupule (40 µL/puits). Incuber les lames dans une chambre d’humidité préchauffé pendant 100 min à 37 ° C.
9. préparation pour l’imagerie
Remarque : Voici les réactifs sensibles légères. Garder les lames à l’abri de la lumière.
- Cliquez sur désactiver la solution de l’Amplification-polymérase de la glisse et laver deux fois pendant 10 min chaque dans 1 x tampon de lavage à température ambiante.
- Supprimer complètement les chambres et le silicone autour des puits de la diapositive. Raclez les bits restants de silicone avec un rasoir. Dessiner une grille sur la diapositive qui sépare chaque bien.
- Ajouter ~ 40 µL de la milieu de montage au DAPI. Veillez à ne pas emprisonner de bulles d’air sous la lamelle couvre-objet. Les bords de la lamelle couvre-objet peuvent être scellés avec un vernis à ongles.
- Attendez au moins 20 minutes avant d’effectuer l’analyse d’images à l’aide d’un microscope confocal.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. - Après l’imagerie, entreposer les lames à-20 ° C à l’obscurité.
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Representative Results
Nous avons utilisé le test PLA pour tester l’interaction entre MST1 et MST2 HEK-293 et iHSC. Les cellules ont été fixées, perméabilisées et colorées avec les anticorps différents, suivies en situ amplification selon le protocole PLA (Figure 1). Afin de documenter le niveau de hétérodimérisation de MST1/MST2, les cellules ont été colorées avec des anticorps MST1 ou MST2 (Figure 1 a, 1C et 1 G). Comme témoin positif, nous avons également utilisé ERK et pERK anticorps qui sont censés se trouver à proximité dans les cellules activées ERK (Figure 1 b et 1F). Cellules dépourvues de MST1 et MST2 ne montrent aucun signal PLA (Figure 1). Cellules colorées avec un seul des deux anticorps ne montrent même aucun signal PLA (Figure 1). Ces résultats suggèrent que les cellules HEK-293 et iHSC contiennent des hétérodimères MST1/MST2, en accord avec les résultats précédents de notre laboratoire4. Comme un contrôle négatif supplémentaire nous avons incubé les cellules avec des anticorps primaires ERK et MST2 pour montrer la spécificité des signaux (Figure 1 et 1 H).
Pour vérifier les niveaux d’expression MST1 et MST2, extrait de WT et cellules HEK-293 de MST1/MST2 knock-out, respectivement, ont été analysés par immunoblot avec les anticorps indiqués (Figure 1I).
Figure 1 : Les données représentant PLA. (A-H) Les cellules étaient fixées et colorées avec les anticorps indiquées, suivies par la procédure PLA. Bleu : DAPI, rouge : signal PLA. Photomicrographies ont été obtenus avec un microscope confocal Leica SP5. (I) Immunoblot pour MST1 et MST2. Barre d’échelle est 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous avons trouvé utile d’utiliser des lames de verre chambre pour cette expérience, car il est très pratique réaliser l’expérience avec plusieurs lignées de cellules (14-16) et il n’y a pas besoin de changer l’échantillon chaque fois lors de l’analyse de la microscopie. Quelques complications peuvent survenir, comme une augmentation du risque de contamination croisée avec des anticorps. Par conséquent, nous suggérons de laver chaque cupule individuellement au lieu d’utiliser une coloration, malgré la durée de l’expérience. En outre, la suppression de silicone insert est une affaire délicate et doit être faite avec soin et patience. Même avec la technique méticuleuse, il est parfois possible de voir des petites quantités de débris de silicone après l’enlèvement de l’insert. Pour cette raison, on doit éliminer l’insert silicone scrupuleusement, à l’aide d’un rasoir, si nécessaire, comme trop laissée silicone peut modifier la distance confocale au cours de la microscopie. Il peut également être utile dessiner des lignes alors que les frontières des puits après avoir enlevé l’insert de silicium pour aider à trouver des cellules au microscope.
Il est impératif d’utiliser des anticorps primaires non-cross que chacun ne reconnaît qu’un seul membre de l’hétérodimère (p. ex., le MST1 anticorps ne devraient pas également reconnaître MST2 et vice versa). En outre, il est important de se rappeler d’utiliser différents conseils pour éviter la contamination croisée des anticorps primaires et des sondes PLA, pour éviter de toucher le fond du puits et d’éviter de pipetage directement sur des échantillons. Nous avons constaté que pour iHSC, il est préférable de manteau chambre diapositives avec une solution de poly-L-lysine de 0,01 %, et pour HEK-293, il est préférable de manteau avec laminin 10 µg/mL de souris.
Comme pour toute procédure, il existe certaines limitations de cette méthode. L’essai PLA, alors qu’une méthode puissante pour toutes les raisons énumérées ci-dessus, est limitée par la spécificité et la sensibilité des anticorps. En outre, concentrations d’anticorps et les conditions de culture cellulaire doivent être finement réglées avant que des expériences en laboratoire sont mis en place pour réduire les coûts des analyses. À cet égard, une alternative pour réduire le coût des analyses est d’utiliser plat fond en verre 35 mm non couché au lieu de diapositives de la chambre.
Un avantage du dosage est que l’intensité et le nombre de points fluorescents peut être quantifiée à l’aide de différents logiciels tels que le logiciel Blob-finder, l’outil Image Duolink et th /olink Bioscience.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous remercions le laboratoire Chernoff ensemble pour contribuer à l’optimisation et la validation du présent protocole, notamment Maria Radu et Galina Semenova. Nous remercions également Andrey Efimov de l’installation d’imagerie cellulaire au Fox Chase Cancer Center. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (R01 CA148805) de JC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
