Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para matrizes de anticorpos identificar alterações nas vias de sinalização em vários modelos de celulares. Estas mudanças, causadas por drogas/hipóxia/ultra-violet luz/radiação ou superexpressão/downregulation/nocautes, são importantes para vários modelos da doença e podem indicar se uma terapia será eficaz ou pode identificar mecanismos de drogas resistência.
Abstract
Pacientes com câncer com um regulamento aberrante das redes de fosforilação de proteínas são frequentemente tratados com os inibidores de tirosina quinase. Quase 85% as taxas de resposta são comuns. Infelizmente, os pacientes muitas vezes se tornam refratários ao tratamento, alterando suas vias de transdução de sinal. Uma implementação do perfil de expressão com microarrays pode identificar as alterações do nível de mRNA em geral, e proteomics pode identificar as mudanças globais nos níveis de proteína ou pode identificar as proteínas envolvidas, mas a atividade da transdução do sinal caminhos só podem ser estabelecidos por interrogar modificações borne-translational das proteínas. Como resultado, a capacidade de identificar se um tratamento medicamentoso for bem-sucedida ou se resistência surgiu, ou a capacidade de caracterizar qualquer alterações nas vias de sinalização, é um importante desafio clínico. Aqui, nós fornecemos uma explicação detalhada das matrizes de anticorpo como uma ferramenta que pode identificar alterações de todo o sistema em várias modificações borne-translational (por exemplo, a fosforilação). Uma das vantagens do uso de matrizes de anticorpo inclui sua acessibilidade (uma matriz não requer um especialista em proteômica ou equipamento caro) e a velocidade. A disponibilidade de matrizes, visando uma combinação de modificações borne-translational é a principal limitação. Além disso, abordagens imparciais (phosphoproteomics) podem ser mais adequadas para a descoberta do romance, Considerando que o anticorpo matrizes são ideais para os destinos mais amplamente caracterizados.
Introduction
A aplicação clínica dos inibidores da quinase de tirosina alvo (TKI) transformou-se tratamento de câncer, fornecendo os médicos com ferramentas eficazes para atingir as proteínas específicas essa transformação neoplásica de carro. Estes compostos inibem ou bloqueiam a fosforilação de proteínas alvejado de tirosina quinases1,2. TKIs foram desenvolvidos em parte porque as alterações genéticas na chave de vários genes de sinalização são suficientes para unidade câncer início e progressão [por exemplo, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), quinase de tirosina-proteína proto-oncogene Src (SRC), BCR-ABL e receptor de fator de crescimento epidérmico humano (HER2) de 2]3,4. O impacto de TKIs sobre o ciclo celular5 e a de vias de sinalização molecular6 representa uma transformação do não segmentados para o tratamento de câncer molecularmente guiada. A principal vantagem dos TKIs versus quimioterapia é as taxas de resposta maior e o menor risco de toxicidade para as células saudáveis7. Como resultado, lá tem vindo a aumentar a atenção na pesquisa e no desenvolvimento do romance TKIs.
Acesso aos resultados de sequenciamento genômico começou com o projeto genoma humano8,9,10 e continua hoje com várias geração (NextGen) câncer sequenciamento esforços [por exemplo, o genoma do câncer Atlas (TCGA)11,12]. Isso inspirou muitas metodologias experimentais que fornecem informações simultâneas sobre milhares de genes e/ou fornecem instantâneos imparciais de genes ou proteínas moduladas por perturbações biológicas13. Desde que o Regulamento da função celular ocorre em múltiplos níveis, a partir da transcrição de genes para a modificação pós-traducional de proteínas e a sua actividade, uma compreensão completa dos eventos controlando a função celular será em última análise, requerem uma integração de dados de várias leituras biológicas. A capacidade de monitorar os níveis de RNA mensageiro (mRNA) de milhares de genes com uma resolução de célula única gene aumentou a capacidade de fazer inferências sobre a função dos genes e interações em uma escala do inteiro-genoma. No entanto, a interpretação de matrizes de expressão do gene sempre será inerentemente incompleta sem a integração de outros níveis de regulamentação: ou seja, os níveis de expressão de proteínas, os Estados de modificação de proteína e a proteína pós-traducional modificações (fosforilação, ubiquitylation, metilação, etc.). Aqui, descrevemos o utilitário de matrizes de anticorpo como meio para interrogar modificações borne-translational de componentes importantes de sinalização como uma função de várias condições em uma única experiência14,15, 16.
Matrizes de fosfo-anticorpo podem ser empregados para distinguir e analisar as alterações no de vias de transdução de sinal16. Estas podem surgir de uma modificação genética ou tratamentos de linhas celulares com inibidores da quinase, chemotherapeutics, estresse causado pela inanição de privação, hipóxia ou soro de glicose. De nota, a resistência de droga ou de um gene específico - up ou downregulation também pode causar mudanças no de vias de transdução de sinal17.
Resistência às drogas, por exemplo, pode surgir de mutações do alvo para evitar a sensibilidade. Em câncer de pulmão, conhecido mutações do EGFR processam o câncer insusceptíveis de certas TKIs, mas mais suscetíveis a outros. Alternativa de vias de sinalização pode ser ativada após a mutação17. Como uma aplicação mais ampla para a identificação de vias de transdução de sinal envolvidas na resistência e hipóxia, etc., matrizes phospho-anticorpo fornecem mais a introspecção e, consequentemente, a compreensão de, os mecanismos envolveram.
Tecnologias que permitissem uma avaliação de modificações de proteínas representam um componente importante da biologia de sistemas porque muitas vezes servem uma função reguladora, tais como a atividade de uma enzima ou as interações físicas entre proteínas de modulação. A importância das modificações borne-translational é ilustrada pelo papel da fosforilação de proteínas em quase todos os sinal extracelular acionadas transdução vias18. Tradicionalmente, a identificação de quinases ou do estado de fosforilação de proteínas também pode ser determinada por análise ocidental do borrão, especialmente se o pesquisador está interessado em apenas 1 – 5 alvos. No entanto, borrões ocidentais são muito seletivos e podem ser inclinados para o conhecimento prévio e podem perder alvos importantes como resultado. Anticorpo matrizes fornecem uma leitura de rendimento médio de alvos múltiplos incorporando vários anticorpos de captura [pan-específicos fosforilada tyrosine(s), antiubiquitina, etc] em uma matriz sólida (por exemplo, vidro ou nitrocelulose). Anticorpos secundários fornecem informações sobre proteínas específicas em um formato de ELISA baseado em sanduíche (Figura 1). Este ensaio se torna mais poderoso e pertinente como mais alvos são de interesse ou o conhecimento prévio é restrito15. As phospho-matrizes são mais amplamente empregáveis como podem comparar a fosforilação, bem como gerais quantidades de proteína de uma ampla variedade de destinos em um experimento e fornecem uma quantificação significativamente melhorada através de espectrometria de massa. Esta técnica não é aplicável para a identificação dos sítios de fosforilação novas ou desconhecidas.
Proteômica de espectrometria de massa-baseado em larga escala pode ser empregada para identificar sites específicos da fosforilação de proteínas19. Embora essa técnica pode enumerar milhares de eventos borne-translational, requer instrumentação cara, dutos experimentais dedicados e uma experiência computacional que estão fora do alcance da maioria dos pesquisadores.
Matrizes de anticorpo fornecem uma leitura simultânea em várias proteínas leituras16. Estes podem ser mudanças na proteína ubiquitylation (matriz de ubiquitina) ou fosforilação. A principal vantagem dessa tecnologia de matriz é que fornece importante feedback sobre o estado biológico de vários caminhos biológicos associados a parâmetros de célula importante (proteínas de 53 kDa, p53, quinase de tirosina do receptor e vias intracelulares) ao mesmo tempo. Além disso, é possível combinar vários tipos de matriz para aumentar a penetração de um ensaio (por exemplo, apoptose e ubiquitina e fosforilação). Esta capacidade de combinar várias matrizes para avaliar várias alterações pós-tradução em várias amostras simultaneamente de uma vez - e cost - effective forma que não requer instrumentação específica ou conhecimentos é uma vantagem significativa no caso de matrizes de anticorpo.
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Protocol
1. extração de proteínas
- Placa de 5 x 106 células em uma placa de cultura de tecido de 10 mm (ou frasco) de um capuz de cultura de tecidos. Conte as células no momento do chapeamento com um contador automático de células ou hemocytometer. Alternativamente, estime a contagem de células.
- Enxagúe as células cultivadas na chapa de 10 mm (ou frasco) completamente 3x com 10 mL de tampão fosfato salino (PBS) (pH = 7,4). Certifique-se de remover todos os PBS antes de adicionar a Lise.
Nota: A lise é normalmente fornecido com o kit. Se não, então usar um buffer de ensaio radioimmunoprecipitation (RIPA) ou qualquer outro tampão de lise celular que contém um coquetel de inibidores de protease e fosfatase. - Lyse 1 x 107 células/mL de células no buffer de Lise, adicionando a quantidade correta de buffer para as células e raspando as células com um raspador de célula para o buffer de Lise. (por exemplo, para as células HeLa e MiaPaCa-2, use 600 µ l por placa de 10 cm).
- Pipetar o lisado acima e para baixo (aproximadamente 10 x) e transferi-lo para um novo tubo de 1,5 mL.
- Incube os lysates por 30 min a 4 ° C, de preferência em um balancim/shaker. Pressione o lisado por meio de uma seringa com uma agulha 27G x 10 garantir uma interrupção adequada do cell membrane(s). Em alternativa, proceda à sonicação o lisado. Armazenar os lysates a-20 ° C ou usá-los imediatamente.
- Centrifugue o lisado a 14.000 x g a 4 ° C por 15 min e transferir o sobrenadante para um tubo limpo 1,5 mL.
- Dosar a quantidade de proteína total por bicinchoninic ensaio ácido (BCA)20 ou equivalente como Lowry ou Bradford e continuar pelo menos 50 – 400 μg. Use as proteínas imediatamente ou alíquota e congelamento/loja-los a-70 ° C (evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento).
2. humano fosfoquinase matriz
- Trazer todos os reagentes à temperatura ambiente antes de começar (por cerca de 1h).
Nota: Todos os reagentes e desgaste de plástico estão incluídos no kit. - Preparar todos os reagentes frescos (buffers de matriz) antes de iniciar o procedimento seguindo as instruções do fabricante (dependendo a escolha de objectivos/matrizes, as instruções podem variar ligeiramente).
- Reconstituir os cocktails de anticorpo deteção em 100 μL de água desionizada ou siga as instruções do fabricante devem diferem para o tubo de ensaio de 1,5 mL fornecido.
- Preparar o tampão de lavagem 1X diluindo 40ml de 25 x tampão de lavagem em 960 mL de água desionizada e misturá-los por inversão.
Nota: Cristais dissolvem à temperatura ambiente. O buffer pode amarelar com o tempo, mas ainda funcionará. - Pipete 1 mL de tampão de matriz 1 em cada poço de uma bandeja multi 8 poços (ou 2 mL em uma bandeja multi 4-bem).
- Com uma pinça de ponta plana, retire as membranas de matriz entre as folhas protetoras e colocá-los em poços. Certifique-se que os números na membrana estão virada para cima.
Nota: Após a submersão, o corante na membrana irá desaparecer. - Cubra a bandeja com uma tampa e incube-lo num agitador de plataforma oscilante para 60 min à temperatura ambiente.
Nota: Esta é a etapa de bloqueio de membrana. - Durante o período de incubação, prepare as amostras da proteína. Adicione 50 – 100 μg de proteína total. Dilua o lisado, tendo um volume máximo de 334 μL, com tampão de Lise até um volume final de 1 mL.
Nota: 50 a 100 μg de proteína total geralmente é suficiente. - Aspire cuidadosamente o buffer matriz 1 e incubar as membranas com 1 mL das amostras durante a noite a 2 – 8 ° C num agitador de plataforma oscilante.
Nota: Não toque/riscar as membranas. - No dia seguinte, lave a matriz cuidadosamente removendo cada matriz e colocá-lo em recipientes de plástico individuais (aproximadamente 8 x 11 cm2) com 20 mL de tampão de lavagem 1 x. Lave as membranas 3 x 10 min em uma plataforma de balanço em 1x tampão de lavagem à temperatura ambiente.
- Adicionar 20 μL do anticorpo reconstituído cocktail de passo 2.3 para 1 mL de tampão de matriz 2 1x. Adicione 1 mL desta solução para cada 8 poços para ser usado.
- Cuidadosamente, remova as membranas as bandejas de lavagem. Borre a borda inferior para as toalhas de papel para remover qualquer tampão de lavagem em excesso e transferi-los de volta na bandeja contendo os cocktails de anticorpo. Cubra a bandeja com a tampa e incube-lo por 2 h à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço. Cuidadosamente lave as bandejas usadas com dH2O e secá-las para uso posterior.
- Cuidadosamente, remova cada matriz e colocá-los de volta para os recipientes de plástico limpo individuais (aproximadamente 8 x 11 cm2) com 20 mL de tampão de lavagem 1X. Lave-os 3 x 10 min com o tampão de lavagem em uma plataforma de balanço à temperatura ambiente.
- Dilua o Streptavidin-HRP (fornecido com o kit) ou tintura de streptavidin-fluorescente (para uma detecção mais quantitativa) 1:1,000 no buffer de matriz 2 em um tubo de ensaio de 15 mL de 1x.
- Retorno as membranas para os pratos de 8 poços contendo a solução de HP e incube-os por 30 min à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço (se usando fluorescência, envolva a bandeja em folha de alumínio para evitar qualquer exposição à luz).
- Remova o excesso buffer, colocando a membrana entre 2 pedaços de 5 mm de papel de 3 M. Para tratamento de imagens com uma câmera de filme/quimioluminescente de raio-x, incubar as membranas secas com uma solução de deteção de HRP (quimioluminescente mistura as duas soluções de 1:1) por 3 min e colocar a membrana em um protetor de folha de plástico transparente.
Nota: Membrane(s) secas também pode ser colocados em um sistema de imagem fluorescente para detectar o sinal fluorescente; Minimize a exposição à luz para a membrana antes de imagem. Para uma quantificação dos arquivos de filme ou câmera de raios-x, evite a superexposição. A maioria das impressoras a quimioluminescente/fluorescentes têm uma função para evitar a saturação do sinal.
3. análise de dados
- Baixar ImageJ, uma programa21, de processamento de imagem e instalar o software.
- ImageJ aberto clicando duas vezes no 'ícone do ImageJ ' ' '. Selecione a imagem a ser analisado clicando em 'Arquivo' na barra de menu, em seguida, selecione 'Abrir' do menu drop-down e procure os arquivos do computador para a imagem de interesse. Clique no arquivo para abri-lo.
- Inverta a foto para a análise (manchas pretas sobre fundo branco com manchas brancas sobre um fundo preto) clicando em 'Editar' na barra de menu e selecionando 'Inverter' do menu drop-down.
- Selecione o ícone' oval' na barra de ferramentas (a segunda opção da barra de ferramentas do ImageJ). Desenhe um círculo/oval clicando na imagem (Cruz preta) e movendo o mouse. Ajuste a tamanho/forma do círculo/oval para cercar os pontos sobre o borrão de ponto.
- Clique em 'Analisar' na barra de menu e selecione 'Medida' do menu drop-down para abrir automaticamente uma nova janela com os valores da área selecionada (área, média, mínimo e máximo).
- Mover a área circular arrastando o círculo do centro (colocar o ponto da seta para a direita no meio) e coloque-o em torno da próxima área de medição (ponto). Medir todos os pontos de interesse, o controle positivo, controle negativo e o plano de fundo para a análise.
Nota: O controle negativo é o PBS, o fundo é uma parte da membrana sem qualquer mancha (qualquer parte vai fazer), e o controle positivo é um controle fornecido pelo fabricante. - Selecione os pontos de controlo negativo PBS e subtraia o valor de cada ponto. Média da intensidade para cada par de pontos duplicados que representa cada receptor tirosina quinase (RTK). Cada intensidade média pode estar relacionada com o controle para calcular a variação de dobra.
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Representative Results
Para investigar o efeito da resistência de TKI em vias de transdução de sinal em linhas celulares, quatro amostras foram analisadas. Uma amostra de controlo (H3255r1) e 3 linhas de célula TKI-resistente (H3255r2-4) (Figura 2) foram relacionadas ao modelo de detectar anticorpos (Figura 3). 4 todas as amostras foram preparadas usando este protocolo. Seis fosfoproteínas com atividade diferencial foram escolhidas para a demonstração da análise das matrizes de anticorpo (Figura 4). O mapa de calor (Figura 5) fornece uma leitura semi-quantitativa sobre as mudanças na fosforilação de proteínas das proteínas de transdução de sinal importante. A validação dos resultados da matriz pode ser concluída com a implementação de abordagens ortogonais, como mancha ocidental.
Figura 1: esquemático de matrizes de anticorpo semi-quantitativa. As matrizes de anticorpo baseiam-se o princípio do imunoensaio sanduíche, onde uma coleção de anticorpos de captura é incorporada ou o vidro ou o suporte de nitrocelulose. Os lisados celulares são incubados com a membrana e as matrizes são submetidas a anticorpos secundários. Uma leitura semi-quantitativa pode ser obtida dos substratos quimioluminescente ou, para obter mais informações quantitativas, geração de imagens baseada em fluorescentes. Todos os sinais derivados de filme ou TIF imagens podem ser tratados por densitometria e um cálculo das mudanças-dobra para cada proteína. Todo o processo leva cerca de dia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: matriz de exemplo phospho-anticorpo desenvolvido com o tonalizador. Os spots fluorescentes são detectados em duplicado (duas vagas por destino). As amostras e pontos de controlo positivo mostram intensidades diferentes. Mostrado aqui é a comparação de H3255r1 o TKI-sensíveis e 3 matrizes de amostra resistentes (H3255r2-4), cada um dividido em membrana A e B. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: mapa dos pontos matriz. O mapa links os pontos para os alvos de anticorpo. As manchas são rotuladas A - G verticalmente e 1-10 horizontalmente. O controle positivo (laranja) está presente em todas as membranas e geralmente encontrados nos cantos. O controle negativo do PBS é realçado em preto, enquanto os pontos de amostra são realçados em amarelo. Para cada matriz, uma lista de anticorpos também é fornecida para identificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: exemplo de análise de dados. Controle do (A), a intensidade dos pontos de interesse, o positivo e o fundo foram identificados no mapa e medido para todas as amostras. (B) o parente intensidade (intensidade local com a intensidade de fundo removido e normalizados para uma intensidade de controle positivo) é exibida em um gráfico de barras para alguns candidatos escolhidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: mapa de calor de sinalização diferencial em H3255 sensível (r1) e linha resistente celular (r2-4). Uma intensidade relativa local foi usada para gerar um mapa de calor para uma comparação das alterações no CREB, P53, AKT e STAT5 em todos os 4 amostras. Qualquer altos níveis são exibidos em vários tons de vermelho, enquanto qualquer níveis inferiores são exibidos em azul22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Abordagens que combinam muitas leituras biológicas são inerentemente mais precisas representações da maquinaria celular em um experimento realizado. O advento de matrizes phospho-anticorpo permite uma rápida caracterização do padrão de modificações que podem ser mais informativo do que o status de modificação de qualquer proteína única. O fluxo de trabalho geral para a aplicação das disposições do phospho-anticorpo é baseado em uma modificação em serina, treonina ou tirosina. Este exemplo focada em caracterizar as mudanças associadas com a resistência à terapia em câncer de pulmão. A principal justificativa para esta aplicação é que a fosforilação de proteínas desempenha um papel central na transdução de sinal em muitos cânceres humanos18, e este método será transferível para outros sistemas. Uma desregulação da fosforilação em câncer geralmente envolve a hyperactivation de a tirosina quinase, e consequentemente, os substratos fosforilados (muitas vezes incluindo a quinase autofosforilada em si) estão presentes em níveis mais elevados do que no normal ajustes fisiológicos e, consequentemente, pode fazer uma fração significativa das fosfoproteínas em uma célula de câncer. Esses níveis mais elevados de fosforilação facilitará a deteção. Além disso, a fosforilação de proteínas tem um significado médico desde que a fosforilação da tirosina aberrante é uma marca registrada de muitos tipos de câncer,23. Além disso, uma vez que esta técnica é transferível para a investigação de outros sistemas biológicos que utilizam fosforilação, muitas das características descritas aqui poderiam facilmente ser ajustadas para se concentrar em outros tipos de matrizes de proteína (ubiquitina, apoptose, etc.).
Matrizes de fosfo-anticorpo são amplamente utilizados para a identificação de qualquer sinal de vias envolvidas, como um método exploratório ou verificação de um determinado caminho. Várias empresas fazem kits para ambos o estatuto de fosforilação e para os níveis globais de proteínas. Enquanto a análise de reação em cadeia (PCR) em tempo real do polymerase ou microarrays são muito mais quantitativos, eles levam apenas os níveis do mRNA em consideração, e uma tradução, bem como modificações borne-translational não podem ser resolvidas. Além de fosforilação, outras modificações borne-translational como glicosilação ou ubiquitylation também podem ser abordadas por matrizes24,25.
Um dos fatores importantes a considerar antes de começar a matrizes de anticorpo é começar com células saudáveis e ativamente divisórias. Hipóxia, estresse oxidativo e inflamação podem produzir mudanças no de vias de transdução de sinal26 que podem distorcer os resultados e processar uma má interpretação se tratados inadequadamente. Este stress pode ser atribuída à formulação dos meios de comunicação ou para chapear pilhas muito pouco ou demais, ou para expor as células aos ambientes mal regulamentadas, ou para tratar o controle contra a amostra ligeiramente diferentemente. Também notámos grandes diferenças no número passagem ou o tempo em que a cultura pós-descongelamento. A chave para evitar essas variáveis introduzidas artificialmente é manter tudo entre as amostras tão consistentes quanto possível. Não altere a porcentagem FBS ou o volume de mídia, etc., durante o experimento.
A análise de dados também deve ser considerada antes de iniciar um experimento de matriz. Uma análise quimioluminescente matriz é só semi-quantitativa, e seu alcance dinâmico é aproximadamente uma ordem de magnitude, enquanto uma fluorescente abordagem aumenta a gama dinâmica para aproximadamente duas ordens de magnitude. A escala em que matrizes são executadas depende as questà µ es biológicas específicas. É possível analisar uma linha de celular resistente específicas de interesse para todas as alterações nas modificações borne-translational, em comparação com a linha de celular original ou se concentrar em um caminho específico para uma ampla variedade de linhas de células resistentes. A escalabilidade desta abordagem deve ser considerada na fase de planejamento inicial. Além disso, os resultados de uma matriz de anticorpo sempre devem ser confirmado por um método secundário em amostras frescas e/ou os lysates mesmos. Uma análise ocidental do borrão pode ser empregada para verificar as alterações para alvos específicos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o generoso apoio financeiro do Lawrence J. Ellison Instituto de transformadora medicina da USC (um presente para David Agus). Agradecemos o apoio do outono Beemer e Lisa Flashner que conduzem à geração e publicação deste manuscrito. Agradecemos seu apoio administrativo-Laura Ng.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
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