Summary
Здесь мы представляем протокол дифференцировать от человеческих плюрипотентных стволовых клеток, имея пациента производные мутации клетки сетчатки пигментного эпителия (ПЭС). Мутант клеточных линий может использоваться для функционального анализа, включая immunoblotting, иммунофлюоресценции и фиксации. Этот подход болезни в блюдо обходит трудности получения собственных клеток человека ПЭС.
Abstract
Хотя более 200 генетических мутаций в гене BEST1 человека были выявлены и связанные с дегенеративными заболеваниями сетчатки, патологические механизмы остаются недостижимой главным образом из-за отсутствия хорошего в vivo модель для изучения BEST1 и его мутации в физиологических условиях. BEST1 кодирует ионного канала, а именно BESTROPHIN1 (BEST1), которая функционирует в пигментный эпителий сетчатки (ПЭС); Однако крайне ограниченный доступ к родной НПП клеток человека представляет собой серьезную задачу для научных исследований. Этот протокол описывает способы создания человеческого RPEs, принимая BEST1 болезнетворные мутации индуцированных дифференциация от человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs). Как hPSCs самостоятельно возобновляемых источников, такой подход позволяет исследователям иметь устойчивый источник hPSC-RPEs для различных экспериментальных анализов, например immunoblotting, иммунофлюоресценции и фиксации и таким образом обеспечивает очень мощную модель болезни в блюдо для BEST1-связанный сетчатки условий. В частности эта стратегия может применяться для изучения физиологии НПП (патолого) и других генов изначально заинтересованности в ПЭС.
Introduction
Это задокументировано, что по крайней мере пять сетчатки дегенеративные заболевания вызваны генетические мутации в BEST1 гена1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, количество зарегистрированных мутаций уже более 200 и все возрастающего. Эти BEST1-сопутствующих заболеваний, также известный как bestrophinopathies, причиной потери прогрессивное видение и даже слепоты, и в настоящее время нет эффективного лечения. Белковый продукт BEST1, а именно BESTROPHIN1 (BEST1), является Ca2 +-активированные канал Cl– (CaCC) конкретно выражена в пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) глаза5,6, 8,9. Важно то, что клинический фенотип BEST1-сопутствующих заболеваний является снижение визуальные ответ на свет стимулы, называется свет пик (LP) измеряется в,10электроокулограммой11; Считается, что LP опосредовано CaCC в НПП12,,1314. Для того чтобы лучше понять патологических механизмов BEST1 перегласовок и работать в направлении потенциальных терапий, важно изучить мутантов BEST1 каналы эндогенно выражена в клетках человека ПЭС.
Однако получение НПП клетки непосредственно из живых пациентов очень непрактично. Хотя родной НПП клетки могут быть собраны из биопсии человеческих трупов и плодов, трудно доступности к этим источникам значительно ограничивает научные исследования. Таким образом важно иметь альтернативные НПП источников, отличных от человеческих глаз. Этот призыв был дан ответ на недавние выдвижения в технологии стволовых клеток, как функциональные НПП клетки могут теперь быть продифференцированным от человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), включая эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), последний создается путем перепрограммирования фибробластов кожи первичной от доноров16,17,18. Важно отметить, что самообновлению и плюрипотентности hPSCs обеспечить надежный источник для генерации RPEs, в то время как пациент специфика hiPSCs и потенциал геномной модификации ЭСК (например, путем ТРИФОСФАТЫ) предлагают универсальная модель болезни в блюдо для желаемый BEST1 мутации.
hPSC НПП имеет ряд преимуществ над мышей НПП модели: 1) BEST1 нокаут мышей не отображать любые сетчатки аномалия19, повышение возможности различных генетических требование о BEST1 в НПП между мышей и людей; 2) только 3% клеток человека НПП binucleate, в отличие от 35% мышей20; 3) hiPSC НПП потенцирует аутологичной трансплантации в клинических лечения сетчатки расстройства21. Тем не менее Животные модели по-прежнему необходимы для изучения НПП физиологии и патологии в живой системе, и нельзя игнорировать онкогенных потенциал hiPSC.
Здесь описано, полезным и умеренно простой hPSC НПП дифференциация протокол, который может использоваться для научных исследований и клинических целей. Этот протокол использует никотинамид (витамин B3) для усиления дифференциации hPSCs в нервной ткани, который далее индуцируется дифференцироваться в НПП лечение с activin-A. Никотинамид лечение доказано увеличить количество пигментных клеток (знак дифференцировку в НПП), возможно путем ослабления деятельности apoptotic дифференциации клеток22. Результате клетки hPSC НПП отображения же ключевых маркеров, булыжник морфологии и клеточных функциональность как родной человеческие клетки НПП22. Таким образом в условиях исследований результате клетки hPSC НПП подходят для вниз по течению функционального анализа, включая immunoblotting, иммуноокрашивания и зажим поклеточного патч, для которых предоставляются подробные экспериментальные процедуры. Клинически НПП клетки, полученные из стволовых клеток показали большой потенциал для трансплантации лечения макулярной дегенерации в исследованиях на животных и человеческих испытаний23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. дифференциация hPSC ПЭС
- Поддерживать и проход hPSCs как описано18.
Примечание: Все клетки (в том числе hPSCs и hPSC-RPEs), выращенных в 37 ° C на 5% CO2 во время роста и дифференцировки протоколов. -
До дифференциации Сплит вырожденная hPSCs предварительно покрытых 6-ну плитам.
- Для пальто плиты, оттепель базальной мембраны матрицы на льду около 1 h, приостановить отраборавшим матрицы в среде DMEM 4 ° C на 1:50 разрежения, добавить 800 мкл покрытие смесь каждой скважины и проинкубируйте по крайней мере 1 ч при 37 ° C.
- При завершении покрытия, аспирационная смеси и сразу же добавить 1,5 – 2 мл среды в скважины.
- Чтобы поднять hPSCs от старой культуры пластин, инкубации клеток с PBS плюс 0,5 мм ЭДТА в течение 5 мин при комнатной температуре, аспирационная решение и Ресуспензируйте клетки в небольшие сгустки с питательной среды.
- Клетки семян на ~ 20% confluency в новой пластинки.
Примечание: Хранить базальной мембраны матрицы в 100 мкл аликвоты при-20 ° C и использовать один Алиготе Пальто плиты 6-хорошо. Время для покрытия может быть продлен до 4 ч при 37 ° C, или на ночь при комнатной температуре. Важно, приостановить и семян hPSCs как небольшие сгустки клетки 3 – 5, а не отдельные клетки.
- Когда клетки растут в полной confluency, замените питательной среды дифференциации среднего (4 мл/хорошо) (Таблица 1, без activin-A). Культура на 14 дней, изменив носитель (4 мл/хорошо) 3 x / неделю.
Примечание: HPSC плиты плотность удваивается примерно каждые 24 ч. значительные клеточной смерти ожидается после начала процедуры дифференциации. Агрегатов мертвых клеток и мусора в скважинах можно увидеть невооруженным глазом во время среднего изменения. - От дня 15 в день 28 дополнить дифференциации среднего человека 100 нг/мл в activin-A (Таблица 1, с человека activin-A). Изменение среднего (4 мл/хорошо) 3 x / неделю.
- Остановите activin-A добавок начиная день 29 (Таблица 1, без человека activin-A). Далее, культивирования клеток в дифференциации среднего для 8 – 10 недель до появления пигментированной hPSC НПП кластеры (рис. 1A-B).
Примечание: Кластеров пигментных клеток можно рассматривать как небольшие темные точки на плите культуры клеток невооруженным глазом (рис. 1A-B, топ). Индивидуальные пигментные клетки с булыжником форма подписи можно увидеть под микроскопом 20 X (рис. 1A-B, внизу).
2. изоляция и культуры клеток дифференцированных НПП
- Удалить дифференциации среднего, мыть раз с PBS, добавляют 1 мл 0,05% трипсина плюс 1 U/мкл коллагеназы в каждой скважине и инкубировать при 37 ° C на 20 – 30 мин удалить трипсина/коллагеназы и аккуратно добавить 2 мл подогретым НПП среды в каждой скважине пластину 6-ну (< C0 > таблица 2).
Примечание: Используйте инвертированным микроскопом для мониторинга морфологию клеток hPSC НПП, которые многоугольные до лечения трипсина/коллагеназы, и стать раунда после достаточно пищеварение. -
Использование горелки Бунзена тянуть стекла, которую пипетки Пастера.
- Обеими руками, провести длинный (9 дюймов) пипетка Пастера на обоих концах, так что это горизонтальный и выше горелка Бунзена около 2/3 по всей длине тонкой части пипетки.
- Как только стекло становится мягкой от пламени, быстро вытяните двух концах друг от друга, таким образом, чтобы кончик микро скребок как образуется в новой конце пипетки (рис. 2).
- Повторите несколько раз для создания нескольких «клетка скребки». Спрей вытащил пипетки с 70% этанола для стерилизации и просушите их в капюшоне культуры клеток.
-
Под микроскопом, используйте микро «клеток скребок» чтобы аккуратно отделить кластеров пигментных hPSC НПП от пластины.
- Аккуратно нажмите (не царапать) непосредственно на пигментные клетки, которые будут плавать вверх в питательной среды после того, как они отмежеваться от нижней части скважины.
- Сразу же используйте 20 мкл микропипеткой мягко всасывания диссоциированных hPSC НПП клетки и передавать их на предварительно покрытых 6-ну плита с НПП средних24.
- В каждой предварительно покрытием хорошо из 12-ну пластины, повторив шаги 2.3.1–2.3.2 несколько раз, при необходимости соберите ~ 5 x 103 клеток (confluency как заметил под микроскопом 20 X ~ 10%). Окончательный объем среднего довести до 2 мл.
Примечание: Для предотвращения диссоциированных hPSC НПП клетки от плавающих прочь, Избегайте движения плит во время процесса диссоциации что диссоциированных клетки, плавающие в среде, но по-прежнему локально концентрированных.
- Клетки (0P) культура вновь изолированных hPSC ПЭС на 12-ну пластины в среде НПП еще 6-8 недель дать им возможность сформировать пигментированной монослоя (рис. 1 c).
- Изменить средний 3 x / неделю. При смене носителя, оставьте примерно 1/3 объем старой среды в каждой скважине и добавить 2/3 объема свежего, подогретым НПП среды. На данном этапе, используйте 2 мл НПП среднего для каждой скважины в пластине 12-ну (таким образом, Обмен 1,3 мл среды каждый раз).
Примечание: Монослое клеток hPSC НПП0 P могут образовывать куполов, предполагая, что клетки активно перевозят жидкости и крепятся на плотных25. Таким образом купол формирование является показателем статуса зрелых НПП.
3. НПП судьба проверка по Immunoblotting
- Сделайте hPSC НПП клеток, lysate с помощью млекопитающих белка добычу буфера дополнена ингибитора протеиназы, коктейль. Инкубируйте lysate клетки на льду за 30 мин до центрифугирования в 13 000 x g 15 мин при 4 ° C отказаться от нерастворенных ячейки мусор. Измерение концентрации общего белка lysate.
- Денатурируйте 40 мкг общего белка в буфер Лэмли SDS образца при 75 ° C за 10 мин отделить белок образцы на геле трис глицин SDS-PAGE 10% при постоянном напряжении 90 V 15 мин и затем 150 V до краска фронта достигает нижней части геля.
- Передача белков на нитроцеллюлозную мембрану в предварительно охлажденным буфера Tris глицин, дополнена 10% метанола на 100 V за 1 ч.
- Блокировать мембрану в буфер Tris физраствора с 0.1% неионные моющего средства (TBST) и 5% обезжиренное сухое молоко, за 1 ч при комнатной температуре.
- Проинкубируйте мембрану с первичных антител, разбавленных в блокирующем буфере при температуре 4 ° C на ночь. Разбавьте антитела, ориентация НПП конкретных маркер белки следующим: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1, 1:1, 000. Разбавьте антитела против β-актина в мэм обнаружить β-актина как элемент управления загрузки.
- Промойте мембрану с TBST 3 раза, с 5 мин для каждой стирки.
- Проинкубируйте мембрану с Флюорофор конъюгированных коза анти мыши IgG мэм вторичное антитело разбавляют в блокирующем буфере 1 ч при комнатной температуре.
- Промойте мембрану с TBST 4 раза, с 10 мин для каждой стирки.
- Обнаруживать белки с помощью инфракрасной системы (рис. 3).
4. Проверка субцеллюлярные локализации BEST1, иммуноокрашивания
- Один раз мыть hPSC НПП клетки с 2 мл PBS и исправить в 2 мл 4% параформальдегида 45 мин при комнатной температуре.
- Вымойте с 2 мл PBS дважды и инкубации клеток в 2 мл PBS с 0.1% неионные ПАВ и 2% осла сыворотка для 45 мин для блокирования сайтов связывания неспецифические.
- Инкубируйте клетки с BEST1 антитела (разбавления 1: 200) за 2 ч при комнатной температуре.
- Вымойте клетки с 2 мл PBS 3 раза. Проинкубируйте с Флюорофор конъюгированных вторичных IgG (1:1, 000) за 1 ч при комнатной температуре.
- Вымойте с 2 мл PBS 3 раз, чтобы удалить несвязанные вторичные антитела.
- Отмечать окрашенных клеток, confocal микроскопии (рис. 4).
5. запись Ca2 +-зависимых ток Cl– в hPSC НПП по поклеточного патч зажим
- 24 – 72 часов до фиксации, Сплит полностью вырожденная хорошо (на 12-ну плиты) из зрелых клеток hPSC НПП0 P (булыжник образный и пигментированной). Аспирационная средний, мыть раз с PBS и добавить 1 мл 0,05% трипсина плюс 1 U/мкл коллагеназы в колодец.
Примечание: Предварительно теплой трипсина/коллагеназы до 37 ° C перед использованием. - Инкубируйте при 37 ° C 8 мин.
Примечание: После этого шага, hPSC НПП клетки по-прежнему верна и подключен. - Использовать 1 мл микропипеткой аккуратно мыть клетки у плиты и передавать клетки в пищеварение смесь 15 мл Конические трубки. Мыть хорошо с 1 мл раствора подогретым трипсина/коллагеназы для сбора остаточной клетки и объединить их в 15 мл Конические трубки.
Примечание: HPSC НПП клетки все еще большие сгустки в этот момент. Не пытайтесь разорвать скопления клеток, энергичные закупорить. Некоторые сгустки могут придерживаться внутренней стенке кончик 1 мл. - Инкубируйте Конические трубки в сухой ванне с 37 ° C за 8 мин.
- Используйте 1 мл микропипеткой до нежно пипеткой прихваченного 10 – 15 раз микс пищеварение.
Примечание: Скопления клеток становятся гораздо меньше, но все еще видны. Избегайте энергичные закупорить. - Повторите два предыдущих шага.
Примечание: Большинство клеток должно быть в одной ячейки подвеска после закупорить. Там может быть несколько крошечных клеток сгустки, которые являются приемлемыми. Дополнительно: Инкубируйте Конические трубки при 37 ° C для дополнительных 5 мин, следуют нежный закупорить. Общее время в трипсина/коллагеназы при 37 ° C не должно превышать 30 мин (8 + 8 + 8 + 5 = 29). - Добавьте 5 мл подогретым НПП среды 15 мл конические трубка, содержащая усваивается клетками. Спина на 200 x g 5 минут собрать клетки. Вновь приостановить и семян клетки на предварительно покрытых 35 мм блюда на 10 – 20% confluency (например, 100% вырожденная хорошо на 12-ну пластины для пяти блюд 35 мм для 10% confluency).
Примечание: Во все времена, Избегайте энергичных закупорить, которые могут вызвать значительные клеточной гибели в лице очевидной карцер мусора в надосадке после центрифугирования. Хорошо разделенных одноклеточных посева имеет важное значение для записи зажим патч. - Выполните поклеточного патч зажим как описано ранее,18,26,27,28,,2930,31. Получить текущий следы от семьи шаг потенциалов (от -100 до + 100 мВ от Холдинг потенциал 0 mV) (Рисунок 5).
Примечание: Рецепты решений внутренних и внешних, описаны в таблице 3 и таблице 4, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наиболее технически сложным шагом является ручной изоляции, которая направлена на достижение высокой чистоты дифференцированной P0 hPSC НПП населения. После успешной изоляции > 90% клеток в населенности0 P будет расти и укрепляться для отображения подписи НПП морфологии (рис. 1 c). Наличие незначительных часть не ПЭС или незрелых клеток НПП в населенности0 P почти неизбежна, но не будет мешать течению эксперименты, пока количество пигментных и булыжник образный hPSC НПП клеток подавляющее Большинство.
С подходом на основе hPSC НПП болезни в блюдо каждый пациент конкретных BEST1 мутация может быть всесторонне характеризуется в естественных условиях для ее выражения протеина (immunoblotting, рис. 3), торговли (мембраны иммуноокрашивания, рис. 4) и ионных каналов (поклеточного патч зажим, рис. 5). Эти результаты будут предоставлять важную информацию для выяснения патологических механизмов мутаций канала и для разработки персонализированной медицины.
Как преимущественно BEST1 выражается в НПП клеток, она может использоваться как сотовой маркера для проверки статуса зрелой НПП. Следует отметить, что некоторые мутации BEST1 может повлиять на его выражения протеина, так что другие устоявшиеся НПП маркеры например RPE65 и CRALBP еще нужно быть оценены (рис. 3).
Созрели P0 hPSC НПП клетки могут поддерживаться за 2-3 месяца до колки (для P1) для фиксации поклеточного. P0 клетки старше 3 месяцев не рекомендуются для фиксации, но по-прежнему может использоваться для immunoblotting и иммуноокрашивания экспериментов.
Рисунок 1: дифференцированных клеток hPSC ПЭС на разных стадиях. Представитель изображения кластеров пигментных hPSC НПП в культуре тарелки на первое появление (A), до изоляции (B) и после роста до погашения пост изоляции (C). Глаз Просмотр и 20 X фазы контрастность изображения показаны в верхней и нижней панели, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель изображение микро клеток скребок вытащил из пипетки Пастера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Проверка состояния зрелой НПП дифференцированных hPSC НПП клеток, immunoblotting. Помарки, показаны выражение ПЭС конкретных белковых маркеров BEST1, RPE65 и CRALBP в клетках hPSC и hPSC НПП WT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: иммуноокрашивания BEST1 в hPSC WT-RPEs. (A) представитель immunofluorescent изображения, показывающие мембраны локализации WT BEST1 в клетках булыжник образный hPSC НПП. (B) иммуноокрашивания минус управления, минуя BEST1 основное антитело.
Рисунок 5: поклеточного патч зажим записи hPSC-RPEs. (A) A единый hPSC НПП ячейки для поклеточного фиксации. (B) представитель текущего следы записан с BEST1 WT hPSC ПЭС и BEST1 мутировал hPSC ПЭС на пик Ca2 +. Напряжения протокол, используемый для получения токи показана вставка. Шкалы бар = 1 nA, 150 г-жа см. таблицы 3 и таблице 4 патча зажима детали подготовки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Реагент | Сумма |
| Нокаут-DMEM (KO) | 500 мл |
| KO сыворотки замена | 15% (75 мл) |
| Заменимые аминокислоты | 1% (5 мл) |
| Глютамин | 1% (5 мл) |
| Пенициллин стрептомицином | 1% (5 мл) |
| Никотинамид | 10 мм |
| Человеческого activin-A * | 100 нг/мл |
| * Человека activin-A дополняется дни 15 – 28 дифференциация протокола. | |
Таблица 1: НПП дифференциации среднего.
| Реагент | Сумма |
| MEM (α модификация) | 500 мл |
| Плода бычьим сывороточным | 5% (25 мл) |
| Дополнение N1 | 1% (5 мл) |
| Глутамин пенициллин стрептомицином | 1% (5 мл) |
| Заменимые аминокислоты | 1% (5 мл) |
| Таурин | 125 мг |
| Гидрокортизон | 10 мкг |
| Triiodo-thyronin | 0,0065 мкг |
Таблица 2: НПП питательной среды.
| Реагент | Концентрация |
| CsCl | 130 мм |
| 2 MgCl | 1 мм |
| EGTA | 10 мм |
| Магния СПС | 2 мм |
| HEPES (рН 7,4) | 10 мм |
| CaCl2* | Варьируется |
| Глюкоза ** | ~ 5 мм |
| * Добавьте2 CaCl для получения желаемой Ca2 + концентрации | |
| ** Используйте глюкозу для регулировки осмолярности до 290 – 295 мОсм/Л | |
Таблица 3: Патч зажим внутреннего решения.
| Реагент | Концентрация |
| NaCl | 140 мм |
| KCl | 5 мм |
| 2 MgCl | 1 мм |
| CaCl2 | 2 мм |
| HEPES (рН 7,4) | 10 мм |
| Глюкоза * | ~ 5 мм |
| * Используйте глюкозу для регулировки осмолярности до 300-305 мОсм/л. | |
Таблица 4: Патч зажим внешние решения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Самой важной процедурой для болезни в блюдо подход является дифференцировать hPSCs с болезнетворные мутации в линии правильные ячейки, которая является НПП для BEST1. Таким образом после каждого эксперимента дифференциации, результате клетки hPSC НПП должно тщательно проверяться для их пожилые статуса ПЭС конкретных морфологии и белковых маркеров16,17,18. Для сведения к минимуму клоновых артефакт, несколько hiPSC клоны из той же пациентки или несколько Госкомсанэпиднадзором клоны с же мутации должны использоваться всякий раз, когда это возможно.
HiPSC и Госкомсанэпиднадзором линии могут быть продифференцированы ПЭС с тот же протокол. hiPSCs с или без мутации в гене BEST1 могут быть перепрограммированы из фибробластов кожи BEST1 больных и здоровых доноров, соответственно. ЭСК, принимая мутации в BEST1 можно генной инженерии от родителей Госкомсанэпиднадзором линии, которая имеет BEST1 (WT) одичал тип. HiPSC ПЭС и Госкомсанэпиднадзором НПП маршруты имеют свои преимущества и недостатки. Первый из них более конкретного пациента и клинически значимых, особенно для персонализированной медицины. Однако, стоит отметить, что существует несколько ограничений для hiPSC НПП подхода: 1) технически трудно получить доступ к полный спектр BEST1 пациентов образцов, как пожертвования от больных всегда не может быть предоставлена, и некоторые мутации являются очень редкие в первую очередь; 2) неспецифической фенотипов может привести разных генетических и физических условий доноров; 3 hiPSC НПП дифференциация эффективность варьируется для различных доноров, таким образом, что иногда может быть технически сложным получить hiPSC-RPEs. С другой стороны, маршрут Госкомсанэпиднадзором НПП, хотя и более искусственным, предлагает универсальная платформа для создания isogenic Госкомсанэпиднадзором RPEs с желаемой мутации по требованию беспристрастности функциональные исследования.
Зрелые клетки НПП пигментированная, многоугольные и связаны плотные соединения в монослое. После разделения на одну ячейку населения для фиксации, свежие заполнения hPSC НПП клетки будет потерять полигональной формы, но до сих пор сохраняют пигментации на несколько дней (Рисунок 5A). Патч зажим-осуществляется 24-72 ч после разделения клетки, во время которого пигментации по-прежнему может использоваться как видимый маркер для выделения ячеек с хорошим НПП статус. Нежный клеток, раскол, в результате в большинстве хорошо разделенных единичных клеток без значительных клеточной смерти является ключом к успеху в патч зажим.
Несколько других протоколов дифференциации, используя средства массовой информации культуры различных клеток и факторов роста были зарегистрированы в литературе21,32. Время, необходимое для дифференциации hPSC НПП аналогичен все эти протоколы, в том числе наша, хотя это трудно сказать, если есть любой значительная разница в эффективности дифференциация без бок о бок сравнение. Следует отметить, что в текущем протоколе, hPSC НПП клетки выращивают в регулярных плоское дно тарелки, но не, на плитах с вставки мембраны, поэтому hPSC НПП, порожденных этой процедуры не может лучше всего резюмировать полярности НПП клетки в естественных условиях. Таким образом методы, описанные выше главным образом подходят в исследования параметр33, хотя созданные hPSC НПП клетки могут также культивировали в Transwell пластин в виде монослоя НПП листы для клинических целей17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Этот проект финансировался NIH грантов EY025290, GM127652 и Университет Рочестер начального финансирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
