Summary
Biz bir fare orthotopic meme kanseri modeli ve radikal mastektomi modeli insan meme kanseri ilerleme taklit etmek için tümör yükünü ölçmek için bioluminescence teknolojisi ile tanıtmak.
Abstract
Meme kanseri ilerleme değerlendirmek için in vivo fare modelleri preklinik ilaç gelişmeler de dahil olmak üzere kanser araştırmaları için gereklidir. Ancak, pratik ve teknik ayrıntılarını çoğunluk sık, bu nedenle, özellikle cerrahi teknikleri gerektirdiğinde modelleri çoğaltmak zor hale getiren yayımlanan el yazmaları içinde göz ardı edilir. Bir tümör aşikar olmadığında bile bioluminescence teknoloji kanser hücrelerinin küçük miktarlarda değerlendirme için sağlar. Kanser hücrelerinin luciferase ifade kullanmak, biz bir meme kanseri orthotopic aşılama tekniği yüksek tumorigenesis oranı ile kurmak. Akciğer metastazı bir ex vivo tekniği kullanılarak değerlendirilir. Biz, o zaman, mastektomi manken metastatik tümör yükünü değerlendirmek için düşük yerel yineleme oranıyla kurmak. Burada, biz, ayrıntılı olarak orthotopic implantasyon ve mastektomi meme kanseri ile bir yüksek tumorigenesis oranı ve düşük yerel nüks oranları, cerrahi teknikleri sırasıyla, meme kanseri modeli verimliliği artırmak için açıklar.
Introduction
Hayvan modelleri kanser araştırmalarında önemli bir rol oynar. Bir hipotez tüp bebek kanıtlanmış zaman içinde vivo klinik önemini değerlendirmek için sınanmalıdır. Kanser ilerlemesi ve metastaz genellikle daha iyi tüp bebek modelleri ile karşılaştırıldığında hayvan modelleri tarafından yakalanır ve ilaç geliştirme1,2için preklinik bir çalışma olarak bir hayvan modelinde yeni bir ilaç test etmek esastır. Ancak, teknik ayrıntılarını hayvan deneyleri de zorlu model başarılı çoğaltmak için yapım o yayınlanan makalelerinde açıklanan değildir. Gerçekten de, bu orthotopic aşılama ve mastektomi modeller kuran yazarlar deneme yanılma uzun ve titiz süreçler gitti. Sonra kanser hücre aşılama başarısını belirlemek için önemli faktörlerden biri ve verimlilik bir hayvan tumorigenesis başarı oranını3çalışma. Hücre ve hücre aşılamak için aşı site ve fareler suşu sayısı tüm önemli faktörlerdir. İyi için tüp bebek teknikleri ile karşılaştırıldığında bireysel farklılıklar nedeniyle hayvan deneyleri sonuçlarına büyük varyasyon vardır bilinmektedir. Bu nedenle, köklü bir model ile standart bir teknikle istikrarlı sonuçları, hayvan deneyleri verimliliğini artırmak ve yanıltıcı sonuçlar önlemek için elde etmek önemlidir.
Bu İnceleme köklü teknikleri4 meme kanseri orthotopic ve mastektomi fare modelleri oluşturmak için sağlar. 1) insan meme kanseri ilerleme ve tedavi kursları taklit etmek için 2) daha fazla verimlilik ve diğer meme kanseri aşısı veya mastektomi teknikleri ile karşılaştırıldığında daha yüksek başarı oranları ile içinde vivo deneyler için bu yöntemlerin amacı vardır. Orthotopic kanser hücre aşı insan meme kanseri ilerleme, taklit etmek için biz #2 meme yağ yastığı göğüs içinde yer alan bir aşı site olarak seçin. Çalışmaların çoğunda, meme kanseri hücrelerinin subkutan aşılanmış5. Bu teknik ameliyat gerektirmez ve böylece, basit ve anlaşılır olmuştur. Ancak, subkutan microenvironment oldukça farklı kanser ilerlemesi ve hatta moleküler profilleri6,7ile sonuçlanır meme bezi microenvironment farklıdır. Bazı çalışmalarda #4 meme bezi, karın içinde bulunan bir aşı Makinası6olarak kullanın. #4 meme dokuları karın içinde yer alır, ancak, periton carcinomatosis7metastatik meme kanseri8az % 10 ile oluşur, en yaygın metastatik deseni vardır. #2 meme bezi burada anlatılan tekniği ile üretilen meme kanseri en sık görülen meme kanseri metastatik siteleri9biridir akciğer için metastaz.
Bu teknik ile aynı zamanda diğer meme kanseri aşılama teknikleri ile karşılaştırıldığında çok az tümör boyutu değişkenliği ile daha yüksek bir tumorigenesis oranı elde etmek için hedeftir. Bunu yapmak için kanser hücrelerinin bir jelatinimsi protein karışımı askıya bir medyan ön göğüs duvarı kesi yoluyla direkt görüş altında aşı. Bu teknik ile tümör boyutu ve şekli daha önce bildirilen3,7olarak subkutan veya cerrahi olmayan enjeksiyon kıyasla daha az değişkenlik yüksek tumorigenesis oranı üretir.
Biz de hangi orthotopic meme tümör çevre dokular ve aksiler lenf düğümleri ile rezeke bir fare radikal mastektomi teknik tanıtmak. Klinik, standart meme kanserli hastalarda olmadan uzak metastaz hastalık için tedavi mastektomi10,11ayardır. Daha önce bir mastektomi, aksiler lenf nodu metastazı görüntüleme ve sentinel lenf nodu biyopsisi tarafından incelenmiştir. Hasta aksiler lenf nodu metastazı kanıtı yok ise, bir toplam veya kısmi mastektomi aksiler lenf nodu rezeksiyon atlandı, o zaman kabul edilir. Toplam mastektomi meme kanseri tüm meme dokusu ile en bloc çıkarabileceğim için bir tekniktir kısmi mastektomi meme kanseri normal meme dokusu sadece, çevresindeki kenar boşluğu ile dalağı ise böylece kalan normal meme dokusunun korunması hasta. Ancak, sonra kısmi bir mastektomi normal meme dokusu kalan korumak hastalar postoperatif radyoterapi yerel yineleme10önlemek için gerektirir. Radikal mastektomi meme kanseri ile tüm normal kaldıran taahhüt aksiler lenf nodu metastazı olan hastalarda meme dokusu ve aksiller lenf düğümleri ve doku tr blok10,11işgal. Fare modelinde, gözetleme aksiler lenf nodu metastazı ve/veya post operatif radyasyon için uygun ya da mümkün değil. Böylece, biz yerel veya aksiler lenf nodu metastazı önlemek için radikal mastektomi tekniği kullanır.
Kanser hücre aşılama yolu ile kuyruk damar en yaygın akciğer metastazı fare modeli12, sözde "deneysel metastaz" var. Bu model oluşturmak kolaydır ve ameliyat gerektirmez; Ancak, farklı metastatik hastalık davranışlara neden olabilir insan meme kanseri ilerleme taklit değil. Metastaz kez Mastektomi sonra oluştuğu insan meme kanseri tedavi sahası taklit etmek için birincil tümör orthotopic kanser hücre aşı sonra kaldırılır. Bu teknik olarak daha önce raporlanmış13, basit Tümör rezeksiyonu kıyasla daha az yerel yineleme üretir ve Roman therapeutics, preklinik çalışmaları ve metastatik meme kanseri araştırma çalışmaları için yararlıdır. Burada açıklanan teknikler çoğu meme kanseri orthotopic modeli deneyler için geçerlidir. Ancak, jelatinimsi protein karışımı microenvironment etkileyebilir ve cerrahi stres/bağışıklık yanıtı14etkileyebilir dikkate almak önemlidir. Bu nedenle, microenvironment ve/veya stres/bağışıklık yanıtı eğitim müfettişler faktörler semptomlarıdır potansiyelini bilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Roswell Park kapsamlı Kanser Merkezi kurumsal hayvan bakım ve kullanım komite onayı için tüm deneylerin elde edildi.
Not: Dokuz on iki hafta-yaşlı kadın BALB/c farelere elde edilir. 4T1-luc2 hücreler, hızlı luciferase için tasarlanmış BALB/c fare türetilmiş bir fare meme adenokarsinom hücre satırı kullanılır. Bu hücreler Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta % 10 fetal Sığır serum (FBS) ile kültürlü.
1. Araçlar hazırlanması
- Donmuş jelatinimsi protein karışımı (örneğin, Matrigel) doku kültürü başlıklı buz çözme.
- Temiz ve basınçlı kap iki ameliyat öncesi cerrahi aletleri (mikrodiseksiyon makas, Adson forseps ve bir iğne bağı) ayarlar. Steril 5-0 ipek sütür hazırlamak ve sterilant (seri ameliyatlar planlanan zaman) kuru.
- Bir kesme makinesi kullanarak fare orta göğüs kılları klip ve cerrahi zaman önce kulak delme tarafından fareler kimlik için işaretleyin.
-
Hemen işlem için kullanılan yordam tablo hazırlamak.
- Bir emici Ped yaymak ve köşe bandı ile düzeltmek, anestezi burun koni sterilant ve dezenfektan (klorheksidin, iyot ve % 75 etanol) teyp ile çalışma alanının düzeltmek ve fareler işlemi sipariş.
2. (10 fareler için) hücreleri hazırlanması
Not: Hücreleri içinde 1 h azalma hücre canlılığı önlemek için yemek ilişkisi kesildi sonra aşılamak. Özellikle, hücre süspansiyon 15 dk içinde jelatinimsi protein karışımı içine canlılığı korumak için çanak hücrelerden ayırma sonra karışık olması.
- Kültür 4T1-luc2 hücreleri, luciferase, RPMI 1640 medya % 10 ile ifade bir fare meme adenokarsinom hücre kültürünü FBS oksijen kuluçka 37 ° c % 5 CO2.
- Fosfat tamponlu tuz (PBS) kullanarak bir 10 mL serolojik pipet ile 10 cm çanak yapisan 4T1-luc2 hücrelerde yıkayın. 1 mL % 0.25 tripsin P1000 pipet kullanarak ekleyin ve sonra örnek 5 min için 37 ° C'de kuluçkaya. Daha sonra büyüme ortamının 4 mL ekleyin (RPMI-%1640 10 ile FBS) 5 mL serolojik pipet kullanıp bir doku kültürü başlıklı 15 mL konik tüp hücre süspansiyon aktarmak. 180 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant Aspire edin ve PBS 2 mL hücrelerde resuspend; sonra hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- 2 x 106 4T1-luc2 hücreleri 40 μL soğuk PBS (pH 7.4, 4 ° C) doku kültürü mahallede askıya alma.
- 40-μL hücre süspansiyon 360 μL 1.5 mL microcentrifuge tüp buz doku kültürü başlıklı jelatinimsi protein karışımı karıştırın.
Not: Son 1 x 105/20 μL bölgedir (1:9 PBS: jelatinimsi protein karışımı). Orthotopic modeli için (mastektomi), 1 x 104/20 μL son konsantrasyon ötenazi ölçüt (tümör boyutu > 2 cm) iki hafta içinde ulaşmasını önlemek için da kullanıldı.
3. kanser hücre aşı
- Fareler sakince nefes kadar fareler % 2-4 isoflurane ve 0,2 L/dak oksijen akışı ile anestezi indüksiyon odasında koymak (2-3 dakika).
- Fare kavramak ve 0,05 mg/kg buprenorfin subkutan onun omuz enjekte.
- Bir ayak çimdik tepki eksikliği ile yeterli anestezi onaylayın. Fare burun inhalational anestezi ile % 2-4 isoflurane ve kömür teneke kutu birimine bağlı 2 L/dak oksijen akışını sağlar fare maskesi deliğe yerleştirin.
- Laboratuvar bant kullanarak fare bacaklarda dizginlemek ve derisi klorheksidin, iyot ve % 75 etanol, pamuk temizleme bezi kullanarak kullanarak sterilize.
- Steril mikrodiseksiyon makas, sağ tarafındaki yanında belgili tanımlık kesme cilt ve cilt makası kullanarak göğüs duvarından bağlantısını kesin ve sonra sağdaki #2 ortaya çıkarmak için cilt ters çevir'i Asansör kullanan ön göğüs duvarı ortasında bir 5 mm Cilt kesi yapmak Meme yağ yastığı.
- Dikkatle 20 μL kanser hücre süspansiyon 1 mL insülin 28,5 G iğne ile yara yoluyla direkt görüş altında yağ yastığı içine kullanarak enjekte et.
Not: İğne yara, deri gider. Jelatinimsi protein karışımı kuvvetlendirmek için zaman sağlar, çekmeye iğne 5 s rahip için yağ yastığı holding tutun. - Cilt kesi dikişi tarafından steril 5-0 absorbe olmayan dikiş kullanarak kapatın.
- Ameliyattan sonra hayvanlar temiz kafes için dönmek ve kadar iyileşti ve serbestçe hareket ediyor onları izlemek (sonra ~ 1-2 dk). Bir hayvan sağlıklı cerrahinin 24 h içinde olmak görünmüyorsa buprenorfin (0.2 mg/kg) yönetme.
- Anestezi altında dikiş çıkarın (bkz. Adım 3.1) ameliyattan sonra 7 d.
4. mastektomi
Not: Mastektomi zamanlaması çok önemlidir. Çok erken yapılırsa akciğer metastazı oluşmaz. Çok geç yapılırsa birincil tümör tam bir onkolojik rezeksiyon zorlayıcı olun büyük kan damarları işgal etmiştir. Böylece, birden fazla zaman puan mastektomi hangi zaman noktası rezeksiyon çok zor olmadan önce metastaz için bekleyen içinde uygun denge üretilen belirlemek için test edildi. 50'den fazla fare deneylerinde bunu yaptıktan sonra bu 8 gün sonra kanser hücre aşılama, mastektomi (veya tümör boyutu 5 mm ulaştığında) ideal olduğunu sunuldu zaman13denge elde etmek için nokta.
- Bir fare ile inhale % 2-4 isoflurane anestezi ve buprenorfin enjekte (3.1 ve 3.2 adımlara bakın).
- Fare dizginlemek ve derisi sterilize (bkz. Adım 3.4).
- 5 mm Cilt kesi 2 mm sola mikrodiseksiyon makas kullanarak ilk kanser hücre aşı yapılmıştı ameliyat izi üzerinden yapmak. Kök doğru kesi forelimb tümörü, uzatma, ameliyat izi ve tümör gibi aksiler lenf nodu Havzası ile temas lezyon içinde çoğu zaman da dahil olmak üzere deri görünür hiçbir lenf nodu mastect anda bulunmaktadır. Omy13. Aksiler damar zarar vermeyeceğine emin olun.
- Cilt kusurları dikişi tarafından "Y" şeklinde steril 5-0 absorbe olmayan dikiş kullanarak kapatın.
- Aynı adım 3,8, olduğu gibi geri dönüş fare temiz kafes ve monitör kadar ele geçirdiler.
- Anestezi altında dikiş çıkarın (bkz. Adım 3.1) ameliyat sonrası 7 gün.
5. kollarındaki Quantification birincil tümör (Orthotopic aşılama mastektomi olmadan) veya akciğer metastazı (mastektomi modeli)
Not: Birincil tümör yükünü miktar için bioluminescence x bir hafta sonra orthotopic aşılama günden itibaren ölçülen 2'dir. Akciğer metastazı miktar için bioluminescence x bir hafta sonra mastektomi günden itibaren ölçülen 2'dir.
- D-biyoluminesans Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 15 mg/mL bir doku kültürü Hood son bir konsantrasyon için geçiyoruz. Aliquot ışık korumalı 1.5 mL microcentrifuge içine tüpleri. Mağaza-80 ° C'de seyreltilmiş çözüm
Not: 20 g fare için seyreltilmiş D-biyoluminesans 200 µL gereklidir. - Görüntüleme yazılımını açın ve Başlat' ı tıklatın.
Not: Şarj kuplajlı cihaz (CCD) serin için yaklaşık 15 dakika sürer. CCD set sıcaklık ulaştığında, sıcaklık çubuğunun rengini kırmızıdan yeşile değiştirir. - Fare ile % 2-4 isoflurane görüntüleme önce adanmış indüksiyon odasında anestezi (bkz. Adım 3.1).
- Fareler tartın.
- 150 mg/kg D-biyoluminesans intraperitoneally orta Karin 28,5 G iğne kullanarak, noktasında enjekte.
- Her fare burun konisi içinde sırtüstü pozisyonda (yer en fazla beş fareler aynı anda) görüntüleme sistemi ile uygun. Anestezi % 1 - % 3 isoflurane (içinde % 100 oksijen), burun koni ile görüntüleme sırasında korumak.
-
Bir resim her 5 dk 50 dk (veya onaylanmış en yüksek bioluminescence kadar) en yüksek bioluminescence algılamak için yakalama.
- Işıma Otomatik, ortamolarak Binning görüş alanı Dolarak olarak seçin.
- Görüntü yakalamak için Al düğmesini tıklatın.
- Fareler için onların cage(s) dönün ve onlar (bkz. Adım 3.8) iyileşti kadar onları izlemek.
6. akciğer metastazı tümör yükünü miktar yanında Ex Vivo düşsel
Not: Akciğer metastazı miktar orthotopic aşılama ile ve ezelî mastektomi modelleri için geçerlidir. Mastektomi modelinde, ex vivo •ardışık görüntü• ya da hayatta kalma gözlem amacına bağlı seçilir. Orthotopic aşı (olmadan mastektomi) modelinde, çoğu zaman birincil tümör boyutu ötenazi ölçüt (> 2 cm) yaklaşık 21 gün sonra aşı üretmek.
- Akciğer metastatik lezyonlar ex vivo görüntüleme kanser hücre aşı tarafından sonra 21 gün ölçmek.
- Fare ile % 2-4 isoflurane adanmış indüksiyon odasında anestezi (bkz. Adım 3.1).
- Fareler tartın.
- İntraperitoneally 150 mg/kg D-biyoluminesans enjekte (bkz. Adım 5.6).
- Servikal yerinden çıkması, 15 dk sonra enjeksiyon tarafından fareler ötenazi.
- Karın eğri Mayo makas kullanarak orta karında cilt ve karın zarını keserek açın. Belgili tanımlık kesme sağa ve sola genişletir. Diyafram görüntülenir kadar karaciğerinden forseps ile çekin; sonra diyafram kesti.
- Eğri Mayo makas kullanılarak üzerinden ikili kaburga caudad kesme (12 kaburga) için cephalad (akciğer anterior toraks duvarı lanetleme tarafından ortaya çıkarmak için 1 kaburga).
- Bir kordon forseps kullanarak akciğerler kaldırarak için omurga, akciğer bağlanma gibi görünüyor torasik özofagus tanımlamak ve sonra yemek borusu mikrodiseksiyon makas kullanarak kesti.
- Asansör iki taraflı akciğer ve forseps (aşağı, yönünde cephalad için caudad çekerek traksiyon uygulamak) kullanarak ve sonra nefes borusu ve büyük gemiler akciğer apex kesilmiş kalp cephalad, mikrodiseksiyon makas kullanarak.
Not: Bu akciğer ve kalp vücuttan yalıtım sağlar. - Kalp akciğer mikrodiseksiyon makas kullanarak kaldırın.
- Akciğerleri bir 10 cm Petri kabına koyun.
- Bioluminescence görüntü yakalama (bkz. Adım 5.7.1 ve 5.7.2) 5 dk sonra ötenazi (20 dk sonra biyoluminesans enjeksiyon).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Orthotopic modeli amacı insan kanseri ilerleme (yani, ardından lenf nodu metastazı ve sonra uzak akciğer metastazı birincil tümör büyümesini) taklit etmektir15. Kanser hücre aşı sonra bioluminescence düzenli olarak sayılabilir (2-3 kez / hafta) (Şekil 1A). Akciğerlerde bioluminescence daha derin ve birincil lezyon daha küçük. Bioluminescence esas olarak canlı fareler3 (Şekil 1B ve 1 C) birincil tümör yükünü yansıtır. Tümör boyutu da Halife ölçüm tarafından ölçüldü. Tümör hacmi aşağıdaki denklemi kullanarak tahmin edilmiştir: birim = (uzunluk) x (genişlik)2/2 (Şekil 1 d). Miktar bioluminescence ve Halife ölçüm tümör yükünün benzer eğilimler gösterdi temsilcisi sonuçlarında (Şekil 1B ve 1 D); Ancak, bazen farklılıklar karşılaştı. Biz bioluminescence kullanan birincil tümör yükü miktarının tümör boyutu daha az 1,5 cm olduğunda tümör boyutu ölçüm için kumpas ile karşılaştırıldığında daha doğru olduğunu varsayalım. Uygun yansıtır çünkü kanser hücreleri, hatta hücre az sayıda bioluminescence tarafından tespit edilebilir ve yalnızca kanser hücreleri bağışıklık hücrelerinin infiltre veya stromal hücreler3çevreleyen tümör içinde algılanabilir. Bu model anti-kanser ilacı ve bağışıklık yanıtı3,7,16tarafından aracılı tümör regresyon etkinliğinin değerlendirilmesinde yararlıdır. Akciğer Metastazlari tümör yükünü de bu modelde (Şekil 1E); görüntüleme ex vivo tarafından sayılabilir Ancak, fareler metastatik tümör yükünü ölçmek için ötenazi gerekir kısıtlamadır.
Mastektomi modeli 1) yeniden17birincil tümör cerrahi olarak çıkarılması olan insan meme kanseri tedavisinde bakım standartları ve 2) metastatik tümör yükünü seri miktar içinde vivo izin vermek için amaçtır. Bu model roman therapeutics13gelişimi preklinik çalışmada özellikle yararlıdır. Orthotopic aşı mastektomi olmadan kullanarak birincil lezyon olarak daha önce yayımlanmış, bir Src inhibitörü, hangi etkinlik preklinik fare modelinde gösterdi ama meme kanseri tedavisi için klinik bir denemede başarısız oldu, AZD0530, etkinlik gösterdi ama değil akciğer metastazı mastektomi modeli kullanan burada sundu. Anti-kanser ilaçlar (örneğin, anthracyclines) bazen insanlarda neoadjuvan tedavi olarak birincil meme tümör tedavisinde kullanılan ilaçlar büyük çoğunluğu uyuşturucu yineleme riskini azaltmak için ameliyattan sonra nerede verilmiştir adjuvan tedavi olarak kullanılır klinik olarak belirlenemeyen kanseri tedavisinde veya metastatik kanser1,7,18için Palyatif tedavi olarak. Böylece, hangi insan tedavi süreci11taklit eden bu mastektomi modeli kurulmuştur.
Sekiz gün sonra kanser hücre aşılama birincil tümör cerrahi olarak olması (Şekil 2) kaldırıldı. Herhangi bir ilaç efficacies metastatik lezyonlar için test etmek için sonra mastektomi yönetilen. Metastatik tümör yükünü içinde vivo görüntüleme kullanan bir tespit bioluminescence sahip olduğu sürece bu modeli için akciğer metastatik lezyon miktar, aynı zamanda tüm vücut metastatik lezyon miktar, verir. Ön göğüs duvarı yerel yineleme oranı oldukça düşüktür. Deneyim, yerel yineleme oranı 50'den fazla fareler deneylerde % 5 daha az oldu. Ancak, ameliyat sonrası gün 1 bioluminescence 1.00E + 06 fotonlar (10 x diğer bireylerin büyük) aşarsa, bir yüksek olasılık var. yerel rezidüel tümör13 Kalan kanser hücreleri mevcut, elle tutulur bir tümör iki hafta içinde görüntülenir. Yerel rezidüel tümör olduğunda bioluminescence o yerel yineleme tercihan--dan herhangi bir metastatik lezyonlar esas olarak yansıtır. Yerel rezidüel tümör uzak metastaz19çok farklı davranmaya bilinir; Böylece, yerel yineleme bu hayvanlarla (< %5 deneyimlerimize) herhangi bir başka analiz çıkarılmalıdır. Bu mastektomi model ayrıca seri metastatik tümör yükünü hayvanlar ötenazi gerek kalmadan izlenmesi için izin verir. Ayrıca, bu tür kollarındaki izleme tarafından ex vivo akciğer metastazı miktar onaylanabilir. Ex vivo görüntüleme, böylece hayvanlar, ötenazi zorunda tarafından akciğer Metastazlari miktarının yerine fareler survival cerrahi tedavi sonrasında da çevrilebilir bir klinik bitiş (Şekil 2B) izlenebilir. Birincil bir lezyon olduğundan, fareler genellikle bir tümör boyutu tanımlanan ötenazi tümör ölçütlere uyan değil > 2 cm veya birincil tümör ülserasyon. Bu 4T1 mastektomi modelinde, tüm fareler kanser hücre aşılama metastaz nedeniyle sonra 60 gün içinde öldü.
Şekil 1: orthotopic model mastektomi olmadan bakış. Orthotopic zaman tabii model 4T1 syngeneic modeli kullanan (A) Bu panel gösterir. (B) Bu panel birincil tümör esas olarak yansıtan bir orthotopic modeli tüm vücut biyolüminesans gösterir. Hata çubuğu ortalama standart hatasını gösterir (n = 10). (C) Bu panel tüm vücut biyolüminesans (aynı fare) seri görüntüleri gösterir. Ölçek çubuğu 1 cm bu panel Masası BÇap pergeli tarafından ölçülen, gerçek tümör boyutunu gösterir. (D) gösterir. Hata çubuğu ortalama standart hatasını gösterir (n = 10). (E) Bu panel gösterir akciğer ex vivo bioluminescence görüntüleri 10 orthotopic modeli farelerin (n = 10). Ölçek çubuğu 1 cm. gösterir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: mastektomi modeli genel bakış. Mastektomi zaman tabii model 4T1 orthotopic syngeneic implantasyon sonra (A) Bu panel gösterir. Ölçek çubuğu 1 cm. (B) Bu panel metastatik lezyon esas olarak yansıtan mastektomi modeli tüm vücut biyolüminesans gösterir gösterir. Hata çubuğu ortalama standart hatasını gösterir (n = 10). (C) Bu panel tüm vücut biyolüminesans (aynı fare) seri görüntüleri gösterir. Ex vivo görüntüleme kullanmak, bu sinyalleri akciğer metastazı vardı ve hiçbir yerel yineleme yanında tüm vücut düşsel akciğer çıkarıldıktan sonra teyit edildi teyit edildi. Ölçek çubuğu 1 cm. (D) Bu paneli gösterir Kaplan-Meier sağkalım eğrisi herhangi bir uyuşturucu tedavi mastektomi modelinin =. Ötenazi ölçütleri eşlik eden herhangi bir durum ile ulaştığında fareler euthanized. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son on yıldır ki meme kanser modelleri3,7,13,16,20,21de dahil olmak üzere birden çok fare kanser modelleri kurulması. Daha önce biz meme kanseri hücre orthotopic aşılama direkt görüş altında meme bezi doku haline daha büyük bir tümör hücreleri bir cerrahi kesi7 olmadan meme çevresinde enjekte için karşılaştırıldığında daha az boyutu değişkenliği ile üretilen gösterdi . Bu model üzerine bir jelatinimsi protein karışımı bir hücre süspansiyon kullanarak geliştirilmiştir. Tümör jelatinimsi protein karışımı askıya hücreleri tarafından oluşturulan şekiller daha az değişkenlik ile yuvarlak, o PBS askıya hücreleri tarafından oluşturulan, ancak meme bezi3' te dağıldı.
Biz daha fazla cerrahi orthotopic implantasyonu yöntemi burada son derece sunulan tarafından oluşturulan tümörleri olan etkileşim ağları önemli kanser ilerleme bu cerrahi olmayan veya subkutan tarafından oluşturulan göre genlerin ifade doğrulanmadı Enjeksiyon7. Bu bulgular bu model daha iyi ameliyatsız orthotopic veya subkutan implantasyon7göre insan meme kanseri taklit eden ima. Biz de bu model allojenik ret3kullanarak meme kanserinin immün aracılı regresyon değerlendirmek uygun olduğunu gösterdi. Ancak, cilt kesi de tümör14çevresinde iltihap neden olabilir. Bu nedenle, araştırmacı tarafından test hipotez bağlı olarak inflamasyon olası karıştırıcı faktör olarak dikkate önemlidir.
Birincil meme tümör cerrahi olarak kaldırılan11sonra ayarlama neoadjuvan dışında büyük çoğunluğu sistemik tedaviler uygulanmaktadır. Bugüne kadar uyuşturucu yanıt birincil tümör ama metastatik lezyonlar1,18preklinik çalışmaları için yeni ilaç geliştirme çoğunluğu değerlendirmek. Metastatik lezyonlar gen profil kanser biyoloji ve tedavi için önemli sonuçları vardır birincil lezyon22önemli ölçüde farklı olduğu için bu tutarsızlık hayvan modelleri ve insan tedavi arasında önemlidir , hedefe yönelik tedavi22döneminde özellikle. Bu nedenle, adjuvan tedavi için ilaç etkinliğinin metastatik lezyonlar, sadece birincil tümör olarak değerlendirilmelidir. Zamanlama orthotopic aşılama sonra lenf nodu ve akciğer metastazı oluşumu 4T1 meme kanseri orthotopic modeli16kullanan doğrulanmadı. Biz de birincil tümör rezeksiyonu mastektomi modeli23kullanan metastatik meme kanseri hayatta geliştirilmiş gösterdi. Böylece, orthotopic kanser hücre implantasyonu sonra mastektomi manken kurmaya çalıştım. Ancak, bu düşük yerel yineleme modeli kurmak için uzun bir süre geçti. Çünkü kanser hücrelerinin cerrahi kesi enjekte, kanser hücrelerinin yara içine kolayca geçirin. Ayrıca, kanser hücrelerinin tümör çevresindeki göğüs duvarı kas ve deri gibi ile doğrudan temas içinde doku istila. Kanser hücrelerinin de mastektomi anda görünür bir aksiler kitle kurma olmadan aksiler lenf düğümlerine metastaz. Tümör kaldırma daha kolay bir yöntem olsa da, yerel yineleme13neden olur gibi yapıyor yani mastektomi meme kanser tedavisinde çevrilebilir değildir. Böylece, bu "radikal mastektomi modeli" Şekil 2' de açıklandığı gibi ön göğüs duvarı ve aksiler lenf nodu Havzası, tüm kanser hücreleri kaldırmak için kurulmuştur. Histoloji ve ex vivo görüntüleme akciğer akciğer metastazı doğruladı ve hiçbir parlayan lezyon mevcut tüm vücut görüntüleme akciğer çıkarıldıktan sonra tarafından yapıldı. Bu 4T1 orthotopic modelinde, kanser hücrelerinin sonunda 21 gün içinde her durumda akciğerlere metastaz. Ancak, metastaz zamanlama birincil tümör boyutuna bağlıdır; Böylece, birincil tümör boyutu daha az değişkenlik sadece da metastatik tümör yükü birincil tümör izlemek için önemlidir. Jelatinimsi protein karışımı kullanarak, tümör boyutu değişkenlik en aza indirilebilir. Ancak, jelatinimsi protein karışımı da tümör microenvironment etkileyebilir. Bu nedenle, jelatinimsi protein karışımı kullanımı ile ilgili faktörler semptomlarıdır potansiyeli, araştırmacı hipotezini bağlı olarak dikkate alınmalıdır.
Bu teknikler ve kanser hücrelerinin luciferase ifade izin daha az ölçüm hatası, hatta palpabl olmayan tümörler ile tümör yükünü miktar için kullanmak. Orada iki gazeteci sistemleri, kollarındaki ve floresan sinyallerini canlı hayvanlarda görselleştirmek için. Bu hedef sinyal çok düşük olduğunda bioluminescence ve floresans sinyalinin miktar için yeterince parlak olabilir bildirilmiştir iken, floresan arka plan sinyalinin hangi tahlil doğruluğunu azaltır, daha yüksektir. Buna ek olarak, bioluminescence daha doğru daha az arka plan parazit24ile daha düşük bir sinyal ile algılanır. Buna göre çoğu müfettişler bioluminescence muhabir sistemleri canlı kullanmayı tercih hayvan deneyleri24,25. Ancak, tümör yükünü miktar bioluminescence tarafından kendi sınırlamaları vardır. Biyoluminesans kardiyovasküler perfüzyon26tarafından kanser hücrelerinin ulaştığında luciferase ifade hücreleri Parlatıcı. Lezyon hipoksi ve/veya hipoperfüzyon bir alanı varsa, biyoluminesans hücrelere teslim edilmeyen ve bioluminescence değeri daha sonra gerçek tümör yükü düşük olduğu ölçülen. Nitekim, tümör boyutu 1,5 cm'den fazla ulaştığında biz uygunsuz bioluminescence miktar yaşadım. Biz açıklanan nedeniyle olduğunu varsayalım hipoksik ve/veya hypoperfused koşulu. Böylece, tümör elle tutulur bir boyuta ulaştığında tümör yükünü bioluminescence ve Halife ölçüm tarafından sayısal. Bir önemli dikkate almak bioluminescence miktar farelerin siyah kürk kısıtlamasıdır. Hatta kürk kaldırıldıktan sonra pigmentasyon cilt27vardır. Bioluminescence algılanabilir ve siyah kürklü farelerde sayısal iken, bu azalır ve bu nedenle, kollarındaki miktar kürk Renk karıştırıcı etkilerini azaltmak için fareler aynı kürk renk birbirleriyle karşılaştırmak önemlidir. Luciferase ifade hücreleri kullanımı çalışma için benzersiz bazı modalities sağlar. Örneğin, secretable luciferase tümör yükünü miktar için ölçüm kan veya idrar bioluminescence28tarafından kullanılabilir. Sunulan modelde burada, doğrudan tümör yükünü miktar secretable luciferase ile canlı hayvan uygun kanser hücrelerinin basit ve basit, hangi kan veya idrar numuneleri toplama gerektirmez.
Burada, daha fazla üretim tanıttığı modelleri tumorigenesis daha yüksek bir başarı oranı ile daha az değişkenlik üreten tarafından verimli hayvan deney anahtar bulgular kanıtlamak için benzer. Bir dedektif teknik öğrendi sonra mevcut modelde, % 100 tumorigenesis oranı elde etmek kolay. Ayrıca biz girmiştik modelleri dışında daha yüksek tumorigenesis oranları elde; Ayrıca, hücre süspansiyon tümör yükünü21ölçmek için bioluminescence teknoloji ile birlikte bir jelatinimsi protein karışımı kullanan bir kolon kanseri orthotopic model kurduk. Sonuç olarak, hayvan modeli burada sunulan kanser çalışma yapmak için uygun bir fare modeli sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser bioluminescence görüntüleri paylaşılan kaynak görüntüleme translasyonel paylaşılan kaynak Roswell Park tarafından satın alınan K.T. farelere NIH grant R01CA160688 ve Susan G. Komen Vakfı araştırmacı araştırma başlatılan Hibe (IIR12222224) tarafından desteklenmiştir Büyük Kanser Merkezi Destek Grant (P30CA01656) ve paylaşılan araçları hibe (S10OD016450) tarafından desteklenen kapsamlı Kanser Merkezi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissection Scissors | Roboz | RS-5983 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Adson Forceps | Roboz | RS-5233 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Needle Holder | Roboz | RS-7830 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Mayo | Roboz | RS-6873 | For ex vivo |
| 5-0 silk sutures | Look | 774B | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Dry sterilant (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Clipper | Wahl | 9908-717 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Matrigel | Corning | 354234 | For cancer cell inoculation |
| D-Luciferin, potassium salt | GOLD-Bio | LUCK-1K | For bioluminescence quantification |
| Roswell Park Memorial Insitute 1640 | Gibco | 11875093 | For cell culture |
| Fetal Bovine Serub | Gibco | 10437028 | For cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | For cell culture |
References
- Rashid, O. M., Takabe, K. Animal models for exploring the pharmacokinetics of breast cancer therapies. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 11 (2), 221-230 (2015).
- Schuh, J. C. Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice. Toxicologic Pathology. 32, 53-66 (2004).
- Katsuta, E., et al. Modified breast cancer model for preclinical immunotherapy studies. Journal of Surgical Research. 204 (2), 467-474 (2016).
- Sidell, D. R., et al. Composite mandibulectomy: a novel animal model. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 146 (6), 932-937 (2012).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Research. 25, 3905-3915 (2005).
- Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Rashid, O. M., et al. An improved syngeneic orthotopic murine model of human breast cancer progression. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (3), 501-512 (2014).
- Bertozzi, S., et al. Prevalence, risk factors, and prognosis of peritoneal metastasis from breast cancer. SpringerPlus. 4, 688 (2015).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Valero, M. G., Golshan, M. Management of the Axilla in Early Breast Cancer. Cancer Treatment and Research. 173, 39-52 (2018).
- National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf (2018).
- Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
- Katsuta, E., Rashid, O. M., Takabe, K. Murine breast cancer mastectomy model that predicts patient outcomes for drug development. Journal of Surgical Research. 219, 310-318 (2017).
- Veenhof, A. A., et al. Surgical stress response and postoperative immune function after laparoscopy or open surgery with fast track or standard perioperative care: a randomized trial. Annals of Surgery. 255 (2), 216-221 (2012).
- Wei, S., Siegal, G. P. Surviving at a distant site: The organotropism of metastatic breast cancer. Seminars in Diagnostic Pathology. 35 (2), 108-111 (2018).
- Nagahashi, M., et al. Sphingosine-1-phosphate produced by sphingosine kinase 1 promotes breast cancer progression by stimulating angiogenesis and lymphangiogenesis. Cancer Research. 72 (3), 726-735 (2012).
- Jones, C., Lancaster, R. Evolution of Operative Technique for Mastectomy. Surgical Clinics of North America. 98 (4), 835-844 (2018).
- Rashid, O. M., Maurente, D., Takabe, K. A Systematic Approach to Preclinical Trials in Metastatic Breast Cancer. Chemotherapy (Los Angeles). 5 (3), (2016).
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nature Genetics. 33 (1), 49-54 (2003).
- Aoki, H., et al. Murine model of long-term obstructive jaundice. Journal of Surgical Research. 206 (1), 118-125 (2016).
- Terracina, K. P., et al. Development of a metastatic murine colon cancer model. Journal of Surgical Research. 199 (1), 106-114 (2015).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Rashid, O. M., et al. Resection of the primary tumor improves survival in metastatic breast cancer by reducing overall tumor burden. Surgery. 153 (6), 771-778 (2013).
- Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
- Adams, S. T. Jr, Miller, S. C. Beyond D-luciferin: expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo. Current Opinion in Chemical Biology. 21, 112-120 (2014).
- Close, D. M., Xu, T., Sayler, G. S., Ripp, S. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors (Basel). 11 (1), 180-206 (2011).
- Chen, H., Thorne, S. H. Practical Methods for Molecular In Vivo Optical Imaging. Current Protocols in Cytometry. 59 (1224), (2012).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Aoki, H., et al. Host sphingosine kinase 1 worsens pancreatic cancer peritoneal carcinomatosis. Journal of Surgical Research. 205 (2), 510-517 (2016).
