Summary
Лист спрей масс-спектрометрия является метод прямого химического анализа, который минимизирует пробоподготовки и устраняет хроматографии, позволяя для быстрого обнаружения малых молекул из растительных тканей.
Abstract
Растения производят тысячи маленьких молекул, которые являются различными в их химических свойств. Масс-спектрометрия (МС) – это мощный метод для анализа метаболитов завод, потому что он обеспечивает молекулярным весом с высокой чувствительностью и специфичностью. Лист спрей MS это техника окружающего ионизации где растительной ткани используется для прямого химического анализа через электроспрей, устраняя хроматографии из процесса. Этот подход к выборки метаболитов для широкого круга химических классов позволяет обнаружить одновременно с нетронутыми растительных тканей, свести к минимуму количество пробоподготовки требуется. При использовании с высоким разрешением и точной массы MS, лист спрей MS облегчает быстрое обнаружение метаболитов интерес. Это также возможно для сбора тандем массового фрагментации данных с этой техникой, чтобы облегчить составные идентификации. Сочетание точных измерений массы и фрагментации является полезным в подтверждающие составного удостоверения. Лист спрей MS техника требует лишь незначительных изменений в источник ионизации наноспрей и является полезным инструментом для дальнейшего расширения возможностей масс-спектрометр. Здесь свежих листьев ткани из Sceletium tortuosum (Аизовые), традиционное лекарственное растение из Южной Африки, анализируется; многочисленные Мезембрин алкалоиды обнаружены с листьев спрей МС.
Introduction
Растения содержат широкий спектр малых молекул с различными химическими свойствами. MS – это мощный метод для анализа соединений растений, потому что он может предоставить элементарный композиции с высокой чувствительностью и специфичностью для обнаружения и идентификации метаболитов1. Чаще всего MS выполняется растворителя извлечены образцы, которые разделены хроматографии до MS анализ1. Однако использование жидкостной хроматографии (LC) требует длительного анализа раз и часто ассоциируется с обширной выборки подготовка1. В отличие от прямой химический анализ нетронутыми тканей, который обходит хроматографии это очень быстрый метод, требующих минимальной образца подготовка2. Таким образом в случаях, где может быть неполученный хроматографического шаги, прямой химический анализ может быть весьма выгодным.
Типичный LC-MS для натуральных продуктов и метаболомики исследования опирается на длительных массового извлечения сушеных или замороженных растительных материалов, содержащих несколько тканей и клеток типа3. Кроме того прямой химический анализ, например MS обнаружения метаболитов из растительной ткани, можно изолировать типы клеток и избежать подготовки артефакты4. Лист спрей МС, также упоминается как ткани спрей5,6, является прямой окружающего ионизации MS метод, который требует по существу не образца подготовка5,7. Лист спрей, который МС тесно связана с бумаги спрей МС, окружающего ионизации технику с характеристиками электроспрей ионизации, которая позволяет для обнаружения аналитов, залегают на бумаге7. Несмотря на название, лист спрей MS для различных видов растительных тканей, не только листья и был продемонстрирован на фрукты, семена, корни, цветочные ткани и клубни, среди других,6,8,9 10,,1112. Техника способствует ионизации эндогенного фитохимические непосредственно из растительного сырья в масс-спектрометр для обнаружения8. Лист спрей MS также может предоставить информацию о пространственном распределении химических веществ в ткани различных типов растений13. Когда лист спрей MS сравнивается с жидкостной экстракции и LC-MS, результаты предполагают спрей листьев, MS позволяет для быстрого обнаружения поверхностных метаболитов из типов уникальных клеток например трихом13. Рисунок 1 иллюстрирует экспериментальной установки MS спрей листьев. Прямые электроспрей ионизации происходит после лишь незначительные источника изменения. Высокое напряжение применяется к заводе ткани через металлический зажим, производства спрей высоко заряженных капель, образуя Тейлор конус, который несет ионов на входе ионов электроспрей г-жа ионизация происходит от естественной жидкости завода или растворителя appl СВУ на поверхности растений. Заостренным кончиком на ткани облегчает электроспрей и может быть естественно происходя или созданного путем разрезания.
Лист спрей MS это быстрый метод для качественного и полуколичественного анализа нетронутыми растительных тканей, которые нашли утилита для широкого ряда приложений. Например этот метод был использован для обнаружения эндогенных соединений различать родственных видов и даже для оценки изменений в того же вида, выращиваемые в различных условиях. Предыдущие исследования показали этот подход путем измерения метаболитов в Бьютиберри (Callicarpa L.) 12 и американский женьшень (Panax quinquefolium L.) 6. в последнем примере, гинзенозиды, аминокислоты и олигосахариды могут быть обнаружены после смачивания ткани сырой женьшень. Диких и культивируемых американский женьшень были дифференцированы от клубней ломтиками6. Женьшень клубней целостность был грядущие спрей лист MS, что позволило за последующие инспекции морфологических и микроскопических6. Кроме того может быть также обнаружен экзогенных соединений на образцы растений. Количество пестицидов (ацетамиприд, дифениламина, уничтожения, linuron и ботвы) были обнаружены в кожуре или целлюлозно фрукты и овощи9. Хотя эти исследования и многие другие показали полезность листьев спрей MS для различных конкретных целей, подробный протокол уже не сообщалось ранее.
Здесь описание протокола не будет сосредоточена на оптимизации метода для конкретной ткани или соединения. Скорее, обнаружение алкалоидов Мезембрин из Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. (Аизовые) используется в качестве примера для обсуждения необходимости оптимизации мер, которые следует использовать при создании листа спрей MS эксперимент для видов, ткани, или Compound(s) в первый раз. S. tortuosum это сочные эндемик полузасушливых Karroo региона Южной Африки. Традиционной медицины Сан и общины кой кой народов, он был использован для аппетита и жажда подавления, а также его психотропных и обезболивающий эффекты14,15. В настоящее время стандартизированные экстракты используются для лечения психоневрологических и нейропсихологические расстройства16,17. Основных соединений интерес включают алкалоид Мезембрин и его производные, многие из которых также находятся в смежных видов Sceletium 15. Популяций диких и культивируемых S. tortuosum имеют переменную концентрации Мезембрин алкалоидов, представляя таким образом проблема контроля качества18. Метод для быстрого обнаружения Мезембрин алкалоидов, например лист спрей МС, может быть полезным в мониторинге Sceletium продукции. Потому, что ранее было не подробный визуальный экспериментальный протокол для листьев спрей MS технику, мы проиллюстрируем метод, с помощью примера S. tortuosumи описан ниже: модификация наноспрей источника, отбор и подготовка растительных тканей, приобретение данных, интерпретация результатов и оптимизации параметров MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. изменения наноспрей источник для листьев спрей MS
- Используйте измененный наноспрей источник для листьев спрей МС. Как не аэрогидродинамических компоненты необходимы для листьев спрей MS, измените источник, удалив LC зонд из источника.
- Соберите листьев спрей MS провод, который будет применяться к растительной ткани с соответствующим ПИН-код для подключения к источнику напряжения. Припой булавку, чтобы один конец изолированные провода; припой зажим в противоположном конце провода.
Примечание: Зажим (Аллигатор клип тип) может иметь или не иметь зубы. Для небольших ткани зажим без зубов является предпочтительным. Необязательный flex руку с зажимом могут быть добавлены к источнику наноспрей для оказания помощи в позиционировании тканей растений. Обратите внимание, что этот протокол конкретно описано выполнение листьев спрей MS на гибридные квадрупольного ионная ловушка массового анализатор системы MS (см. Таблицу материалов); Однако другие MS систем могут быть изменены для выполнения этот метод6. Муфта листьев спрей MS с портативных масс-спектрометр реального времени химический анализ может выполняться на месте без необходимости транспортировки растительного материала в лаборатории19,20. - Позиция антистатический коврик на полу ниже источник для уменьшения электрического разряда, которое может произойти от источника при использовании высоких напряжений.
2. Подготовка системы MS лист спрей MS
- Если система недавно была в использовании, позволяют ему прохладный на ощупь и удаления любого альтернативного источника и развертки конуса. Присоедините источник MS спрей наноспрей листьев.
- Создайте файл настройки с параметрами соответствующие ионизации следующим: оболочка, вспомогательные и развертки газ 0; спрей напряжения 2-5 кв; капиллярные температуру до 150-250 ° C; и S-объектив РФ уровень 50. Сохраните файл настройки с нужными параметрами8,13. Оптимизируйте напряжения и температуры для лучших ионизации ткани и compound(s) интерес.
Примечание: Хороший отправной точки являются 4 кв и 200 ° C. - Сделать файл метод, включая файл настройки спрей MS листьев с: положительные и отрицательные полный МС; резолюция 70000; Целевой объект СМЖЛ 1 x 10-6; максимум это 200 мс; и желаемого сканирования диапазона m/z. Кроме того используйте только 1 полярности.
3. подготовка инструмента, растворителей и тканей растений
Примечание: Всегда надевайте перчатки и не использовать растительной ткани, который был обработан с голыми руками. В противном случае загрязнения ионы как полиэтилен гликоль будет доминировать спектры.
- Принесите растительных тканей для анализа в такой же комнате как MS системы для быстрой выборки.
- Для тканей растений, который не имеет естественно заостренным кончиком используйте лезвие бритвы на слайде стекла сократить точки конические (рис. 2). Определить количество ткани, необходимых для анализа, основанного на инструмент чувствительность, тип ткани и compound(s) интерес (например, молодой S. tortuosum лист это ~ 5 мм в длину).
- Вырезать S. tortuosum листья 10 недель после прорастания на тонкие полоски, каждый с коническим концом сформировать точку.
- Используйте щипцы для нежно выбора тканей растений в конце, что будет зажато. Проведение ткани с щипцами, тщательно передача его в зажим.
Предостережение: Не прикасайтесь исходного документа, если напряжение на. - Отрегулируйте гибкие руки и проволока с зажимом позиционировать ткани в соответствии с MS впускного, так, чтобы расстояние между растительной ткани и входе ионов МС составляет 5-10 мм для тройной четырехполюсника (например, TSQ) и линейной ловушку четырехполюсника (LTQ) и 10 -для ловушек ионной масс-анализатор (например, Орбитрэп)850 мм.
- Подключите противоположный конец провода источник. Если первые попытки производить сигнал низкого уровня интенсивности, переместите растительной ткани ближе к входу ионов (см. обсуждение для оптимизации).
- Загрузить файл метод; имя файла данных и задать место хранения файла. Затем включите систему MS, нажав играть и нажмите на старт , чтобы начать приобретение данных.
- Применить растворителя (например, метанол) с помощью пипетки с наконечником гель загрузки увеличить расстояние между руками и высокого напряжения для защиты пользователя.
Примечание: Объем растворителя требуется, зависит от размера, сухости и текстуры ткани, обычно ~ 2-20 мкл. S. tortuosum листья не требуется каких-либо растворителей для добавления. Осторожно применять растворителя и не прикасайтесь исходного документа, когда напряжение на. Используйте растворители класса LC-MS и посуда, которая была кислоты промывают и бесплатно моющих средств. В некоторых тканях сигнал может наблюдаться без добавления растворителя из-за природной воды содержание растительной ткани. Однако большей интенсивности сигнала и снижение S/N, обычно достигается путем применения растворителя на ткани. - Приобретение данных до тех пор, пока сигнал сохраняется или до тех пор, пока достаточное спектров были собраны, обычно 30-60 сек. При необходимости, примените дополнительные растворителя для поддержания интенсивности высокий сигнал для длительного количества времени. Остановить сбор данных и приостановки системы MS.
- Удаление ткани и мыть зажим с 100% метанола и ворса протрите. Очистите впускной Ион MS после примерно 1-2 ч и приобретения лист спрей MS согласно спецификациям производителя. Кроме того чистые MS Ион входе между анализ типов различных тканей.
4. данные оценки качества
- Откройте файл данных и визуально проверить базовый пик массовых Интеренет. Убедитесь, что интенсивность сигнала ~1.0 x 107 до 5,0 x 108. Если сигнал ниже, переместите ткани ближе к входу ионов. Если выше, передний конец системе MS станет грязной, так переместите ткани дальше входе ионов.
- Основываясь на наличие или отсутствие ионов интерес к массового производства спектры, измените параметры.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
5. тандем массового фрагментации
- Решите, какие ионы представляют интерес для массового фрагментации тандем (МС/МС); массового спектрах сигнал, что > 1,0 x 105 достаточна для выделения ионов для МС/МС.
- Сделать новый файл метод с включение перечня m/z , чтобы 4 десятичных разрядов. Нажмите на глобальные списки и включение. В разделе Свойства PRM, выберите фрагментации энергии [например, нормализованных столкновения энергию (Лазурный берег NCE) 30-50 является хороший выбор для начала] и другие параметры МС/МС.
- Для получения данных МС/МС для Мезембрин алкалоиды, фрагмент следующих ионов, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zи 292.1897 m/z, NCE 35.
Примечание: Получение данных MS/MS может выполняться сразу после MS или в более позднее время. Же ткани могут часто остаются зажатыми после полной МС и может быть повторно использован для приобретения данных MS/MS. Однако если повторного распыления не обеспечивают достаточного сигнала, используйте новые ткани.
- Для получения данных МС/МС для Мезембрин алкалоиды, фрагмент следующих ионов, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zи 292.1897 m/z, NCE 35.
- Загрузите файл метод МС/МС и файл данных с именем. Включите MS системы и начать приобретение данных, добавляя растворитель при необходимости. Когда собрали достаточное спектры, обычно после 30-60 сек, остановите приобретения.
- Соберите фрагментации на многих различных энергий при назначении фрагмент ионов.
Примечание: Поскольку лист спрей MS отсутствует хроматографического разделения, спектры фрагментации, скорее всего, содержат много ионов, и фрагментации в различных энергий поможет внести ясность.
6. предполагаемого опознания разртвом Точная масса и тандем массового
- Сделать предполагаемого идентификаций, ссылаясь на точных измерений массы из публично доступных метаболит баз данных, таких как Метлин21,22человека метаболом базы данных, массы банка23, липидов карты24, Национальный институт Стандарты и технологии MS Поиск25, уважение фитохимические26или27ВНП.
- Эти базы данных не являются исчерпывающими, выполните обзор дополнительную литературу на химически характеризуется как необходимые виды растений.
- Матча фрагментации ионов из листьев спрей МС/МС в вышеупомянутой базы данных, когда МС/МС информация доступна, или к литературе. Альтернативно используйте ручной интерпретации ионов МС/МС фрагмент или фрагментация подлинный стандарт, выполняемые прямого впрыска или LC-MS/MS.
7. анализ данных
- Конвертировать raw файлов MS mzXML файлов с помощью инструмента msConvert Proteowizard28.
- Используйте пакет программного обеспечения XCMS, реализованы в R для максимальной комплектации. Используйте прямые вливания, метод для листьев спрей MS анализа обработки.
Примечание: Хорошо аннотированных сценарии, используемые для обработки данных можно найти на https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code. - Чтобы получить полуколичественного измерения, учета для экспериментальной изменчивости, нормализовать интенсивность каждого метаболит всего текущего Ион (ТИЦ), как лист спрей, интенсивности сигнала MS может варьироваться, отчасти из-за небольшие вариации в позиционировании лист в источнике и различия в форму листьев и размер.
- Кроме того, использовать предоставленных поставщиков программного обеспечения для анализа данных или MZmine2 (чтобы найти на http://mzmine.github.io/)29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В 10 недель, листья после прорастания, свеже собранных выросли парниковых S. tortuosum были проанализированы лист спрей МС. Экспериментальный рабочего процесса для обнаружения метаболитов от S. tortuosum листья с помощью спрей листьев, которые MS проиллюстрирована на рисунке 2. Лист был выбран, разрезать на тонкие полосы с коническим концом сформировать точку и зажимается с листьев спрей MS провод зажим аппарат. Ткани растений был позиционирован ~ 30 мм от входе ионов и в соответствии с x - и y. После инициирования спрей листьев, листья MS S. tortuosum были обнаружены ионы без растворителей приложения. Растения семейства Sceletium , суккуленты с толстыми листьями с высоким содержанием воды, позволяющий электроспрей ионизация распылением MS листьев без внешнего приложения растворителя. Однако как правило, растительных тканей требуют растворителя приложения для обнаружения ионов.
Массового Интеренет и массовых спектры густонаселенных с ионами были произведены после 30 s приобретения в режиме положительных ионизации (рис. 3). Хронология представляет успешный лист спрей, MS эксперимент, где сохранялся стабильный сигнал на весь срок действия приобретения. В этом исследовании в общей сложности девять Мезембрин, что алкалоиды были обнаружены листьев спрей, MS и предполагаемого опознания были сделаны из точной массы ионов протонированных ранее характеризуется соединений (Таблица 1)30. Это выгодно для выполнения листьев спрей MS с высоким разрешением, точная масса (HRAM) масс-спектрометр, что делает его возможным урегулировать немного отличающиеся масс. Например, m/z в 262.1794 могут быть предположительно определены как dihydrojoubertiamine вместо mesembrenone-м (диметиловый - дигидро-), который был бы на m/z 262.1443.
Ткани листа остаются зажатыми тандем массы (МС/МС) степень фрагментации ионов в нескольких интерес (Таблица 1). Рисунок 4 показывает три примера из листьев спрей MS, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zи 292.1897 m/zМС/МС фрагментации спектров. Предполагаемого тождества были проверены массы фрагментов и подтвердил ранее выявленных фрагментов30. Протонированных Ион 276.1583 m/z была определена как два различных изомеров Мезембрин-м (диметиловый) и еще двух изомеров mesembrenone-м из-за присутствия диагностических фрагментов для каждого изомера (Таблица 1).
Мезембрин и Мезембрин M (дигидро-) были обнаружены распылением MS листьев и предположительно определены точные массы, а также массовые фрагментации. Протонированных Ион Мезембрин на 290.1742 m/z является одним из наиболее распространенных ионов в спектре; Таким образом она может быть вероятным кандидатом как биомаркер для будущих исследований. Два главных алкалоидов S. tortuosum , Мезембрин и mesembrenone, оба из которых были легко обнаруживаемых лист спрей МС. Некоторые из соединений, обнаруженных листьев спрей, которую МС может быть полезным в мониторинг растительных материалов Sceletium и производных продуктов.
Рис 1: диаграмма спрей MS лист настройки. Лист спрей MS является метаболитом профилирования метод, который позволяет для быстрой выборки нетронутыми растительной ткани. На диаграмме показан лист спрей MS с кв высокого напряжения с зажимом и возможность применить растворителя к заводе ткани. Лист спрей MS облегчает электроспрей ионизации непосредственно из растительной ткани в входе MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: рабочий лист спрей MS эксперимент. Выбранный растительной ткани, лист Sceletium tortuosum , был вырезать, а затем переданы с щипцами зажимается, и затем позиционируется перед Ион входе до сбора данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Метаболит профилирования Sceletium tortuosum распылением MS листьев с позитивным ионизации. (A) Эта группа показывает лист спрей MS всего Ион игр (TIC) массовые Интеренет. Для каждого пика верхнее число это время (мин) и нижней m/z. (B) Эта группа показывает лист спрей MS метаболит профиль спектра положительных массового Sceletium tortuosum . Врезные отображает 260-295 m/z. Точных масс сообщается 4 десятичных с ошибка < 6 млн. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Лист спрей MS позитивные ионизации тандем массового спектров от Sceletium tortuosum вырезать лист. Эти панели показывают тандем массового спектры (МС/МС) собраны в режиме положительных ионизации спреем листьев, г-жа распространение идентификации алкалоидов, сделаны из Точная масса и массовых фрагментации для следующего: (A) Мезембрин- и mesembrenone М изомеры, Мезембрин (B) и (C) Мезембрин M (дигидро-). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Соединение | Молекулярная формула | Измеренные Monoisotopic массы m/z [M + H] | Ошибка ppm | Фрагменты |
| Dihydrojoubertiamine | C16H23№2 | 262.1794 | 5.0 | Н/Д |
| Mesembrenone-M (O - диметиловый-) | C16H19№3 | 274.1431 | 4.5 | Н/Д |
| Мезембрин M (O - диметиловый-) | C16H21№3 | 276.1583 | 5.9 | 121, 152, 195, 201, 218, 219, 258 |
| Мезембрин M (N - диметиловый-) | C16H21№3 | 276.1583 | 5.9 | 109, 121, 138, 189, 201, 218, 247 |
| Mesembrenone-M (O-диметиловый - дигидро-) | C16H21№3 | 276.1583 | 5.9 | 124, 205, 218, 227, 245 |
| Mesembrenone-M (N-диметиловый - дигидро-) | C16H21№3 | 276.1583 | 5.9 | 120, 151, 210, 229, 241 |
| Mesembrenone | C17H21№3 | 288.1587 | 4.3 | 124, 151, 191, 199, 226, 230, 257, 270 |
| Мезембрин | C17H23№3 | 290.1742 | 4.9 | 110, 121, 134, 152, 201, 215, 219, 232, 233, 241, 259, 260, 272 |
| Мезембрин-M (дигидро-) | C17H25№3 | 292.1897 | 5.2 | 151, 177, 201, 217, 243, 259, 274 |
Таблица 1: предполагаемый идентификации Sceletium tortuosum Мезембрин алкалоиды распылением г-жа лист Эта таблица сообщает о положительных ионизации точных масс и фрагмент ионов для Sceletium tortuosum Мезембрин алкалоиды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успешное использование этого протокола опирается на оптимизации различных шагов для видов растений, тип ткани и целевой compound(s) интерес. Параметры, указанные в настоящем Протоколе обеспечивают хорошей отправной точкой. Следующие экспериментальные решения должны быть изготовлены и испытаны: ли или не использования (1) вырезать или необрезанный ткани и (2) растворителей или без растворителя, (3) какие растворителя использовать и в каком объеме, (4) что расстояние ткани от ионного входе должно быть и (5) амплитуды напряжения. Цель оптимизации заключается в том, чтобы найти условия, которые производят непрерывный сигнал, который сохраняется в течение по крайней мере 30 s до нескольких минут. Условия должны обеспечить адекватную и воспроизводимый сигнал интенсивности, которая необходима для выполнения точной массы и МС/МС измерений. Сигнал высокого уровня интенсивности достигается посредством успешного и надежного спрей ионов из ткани. Спрей качества зависит четкость кончик ткани, указывающую входе ионов, расстояние между кончиком отверстия ткани и Ион и электрического напряжения. Успешного спрей очень сильно зависит четкость точки оконечности ткани и, в некоторых случаях, ткани должны быть сокращены сформировать заостренным кончиком. В частности незначительные изменения в резкость угол конической формы на кончике резки ткани имеют значительное влияние на конечное качество ионизации и таким образом интенсивности сигнала производится7. В тех случаях, где ткани уже указал то не резки необходимой, как в случае с лезвия травы или Ланцет образный листья5,13.
Ион сигнала могут быть подавлены и нестабильности, когда плазмы разряда происходит из ткани в результате существо помещается слишком близко входе ионов или электрического напряжения, будучи слишком высокой. Правильное позиционирование ткани и выбор напряжения электрического тока требуются для обеспечения стабильной и последовательной спрей между выборками. Расстояние ткани от MS Ион входе также влияет на качество и количество сигнал. В общем меньше образец ткани должен располагаться ближе к входу, хотя мелкие ткани не может привести к сигнал низкого уровня интенсивности, если кончик чрезвычайно указал или соединений высокой концентрации. Интенсивность и характер спектров должны быть оптимизированы эмпирически путем сравнения нескольких позиций размещения вдоль оси z. Это важно для подходящего ионизации, что тканей растений выравнивается с MS-Ион входом в x - и y. Однако если тканей растений неоправданно близко к входе Ион, это может потребовать более частой очистки ионной оптики и передней части системы MS.
Объем растворителя применяется поверх ткани может варьироваться от 0 - 50µL в зависимости от содержания воды и размер образца ткани. В тех случаях, когда ткани чрезвычайно высок в содержание воды и вырезать, как в случае сочных Sceletiumмогут быть добавлены без растворителя. Однако это более типично для использования по крайней мере 5-10 мкл растворителя для по крайней мере одного приложения. Добавление растворителя необходим при использовании ткани сушеные или свежие ткани с низким содержанием воды для облегчения спрей. Если на большой кусок растительного материала используется небольшое количество растворителя, он вероятно быть покрыты без производить достаточно спрей. И наоборот Если используется слишком большого объема, соединения могут быть ослаблены или надлежащего desolvation не происходит легко и эффективно. Альтернативный вариант для вручную закупорить растворителем является постоянно применять растворителя в ткани через шприцевый насос так, что наблюдаемые сигнала убывает как функцию от времени как соединение истощается из материала растений10. Различные типы растворителей должны быть судимы, и результирующая спектры по сравнению с проверить любое улучшение количества и последовательности ion(s) для compound(s) интерес. Добавление растворитель не только производит спрей, но также может предоставить избирательности для извлечения различных соединений. Органических растворителей с разными полярностями (метанол, дихлорметан, гексаны, ацетонитриле, хлороформе и ацетон) сравнивали и привести к существенно различных ионов присутствует в спектрах арахис семена8. В общем метанола является хороший первый выбор растворителей, как было показано, работает хорошо для многих растительных тканей и широкий спектр фитохимические, включая аминокислоты, алкалоиды, флавонолов, углеводов, органических кислот, жирных кислот и фосфолипидов8. Применение 100% воды на режиссерский растительных тканей обычно не работают хорошо, но может быть улучшено с добавлением соли10. Во многих случаях, помимо ионов протонированных соединения, другие обильные аддукты обнаруживаются как натрия и калия аддукты. Присутствие этих соли аддуктов является даже более распространена, когда Соль добавляется растворитель и может быть выгодным. Например повышенная чувствительность и селективность фенольных гликозидов из Populus видов были замечены с добавлением ионов натрия и калия в прикладной растворителем10.
Два основных ограничения листьев спрей MS техника (1 низкий динамический диапазон и (2) проблемы с quantitation. Как правило только наиболее распространенных соединений ионизированный и обнаружен технику. Уменьшает эффективность ионизации из-за подавления иона, что резко происходит в отсутствие хроматографического разделения являются менее важной проблемой с обильным метаболитов. Чтобы обойти это ограничение, можно регулировать сканирования диапазона сосредоточиться на только m/z спектр интересов. Однако низкий изобилие соединений по-прежнему могут не обнаруживаться без разделения и концентрации, предоставляемые хроматографии. В отличие от типичных количественный соединений из экстракта внутренние стандарты нельзя смешивать должным образом в завод материал до листьев спрей г-жа Semi-quantitative измерений и относительные концентрации были получены путем размещения известный концентрация стандартного раствора на поверхности ткани и затем позволяя ему высохнуть до листьев спрей MS анализ8,9,31. Например количественный стандарт дополнение метод был использован для вычисления отношение представителя Ион для внутреннего стандарта Ион интерес для определения относительных количеств32. Калибровочная кривая была использована для оценки относительной концентрации. С помощью этого метода, можно было сравнить отношение различных гликозидами для внутреннего стандарта, rebaudioside D, и относительная концентрация конкретную гликозиды затем может рассчитываться в пределах Steчерез листья33. Кроме того более точный количественный возможен с гетерогенны помечены стандартом соединения интереса, хотя коммерческой доступности может быть сложной задачей. Использование метаболически помечены растительной ткани может также улучшить количественный с этот метод34.
Учитывая, что обычные LC-MS/MS требует обширной пробоподготовки и хроматографического разделения, другие методы для анализа часто пожеланы. Лист спрей MS является прямой химический анализ техника, которая может быть легко применено и предлагает простоту, точность, точность и быстрое метаболит обнаружения и полу количественный. По этой причине мы исследовали пригодности листьев спрей MS для мониторинга химического содержания S. tortuosum, который может послужить основой для chemotaxonomic инструментов для дифференциации видов рода Sceletium , основанный на биохимические подписи. Некоторые анатомические свойства этого растения делают его идеальным испытательного образца для листьев спрей МС. Это сочные, содержащий большое количество воды, которая выгодно как спрей может быть создан без применения растворителя. Sceletium лист содержит15 idioblasts (мочевого пузыря подобных клеток), которые служат для хранения запасов где специализированных метаболиты могут накапливаться. Лист спрей MS – техника анализа в естественных условиях , для характеристики тканей растений в быстром образе. Общая методика применима для многих видов растений, типы тканей и классы соединений. Методы, которые захватывают сведения о соединений растений представляют большой интерес для понимания метаболизма завод первичной и специализированной для использования человеком, здравоохранения, питания, сельского хозяйства и энергетики35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Грант программы исследований генома растений NSF IOS-1238812 и докторантура стипендий в биологии IOS-1400818. Работа финансировалась Монсанто студенческих стипендий для Кэтрин а. Сэммонс. Программа Фулбрайта для африканских исследователя ученых (2017-2018 годы) поблагодарил за финансирование присуждена Nokwanda P. Makunga. Мы высоко ценим пожертвования наноспрей источник из Джессика Prenni и протеомики и метаболомики объекта в университете штата Колорадо.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Conn Pin | Digi-Key elctronics | WM2563CT-ND | pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage |
| small clamp | Digi-Key elctronics | 314-1018-ND | CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A |
| large clamp | Digi-Key elctronics | 290-1951-ND | ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A |
| Heat shrink | Digi-Key elctronics | Q2Z1-KIT-ND | to cover soldering joints |
| NSI source Nanospray Ion Source | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Tune Software | Thermo scientific | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument | |
| Xcalibur Software | Thermo scientific | ||
| Plant of interest - S. tortousum |
References
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography - mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
- Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
- Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
- Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
- Chan, S. L. -F., Wong, M. Y. -M., Tang, H. -W., Che, C. -M., Ng, K. -M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
- Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
- Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
- Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
- Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
- Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
- Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
- Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
- Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
- Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
- Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
- Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
- Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
- Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
- Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
- Metlin. , Available from: http://metlin.scripps.edu (2018).
- Human Metabolome Database. , Available from: http://www.hmdb.ca/ (2018).
- Mass Bank. , Available from: http://www.massbank.jp/?lang=en (2018).
- Lipid Maps. , Available from: http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html (2018).
- National Institute of Standards and Technology MS Search. , Available from: http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/ (2018).
- ReSpect. , Available from: http://spectra.psc.riken.jp/ (2018).
- GNPS. , Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
- Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
- Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
- Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate? Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
- Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
- Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
- Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
