Summary
ここで組織をクリア、蛍光標識と、それによって、大脳新皮質の細胞型の三次元組織の可視化を可能にするマウスの脳組織の大規模なイメージング手順をについて説明します。
Abstract
哺乳類の大脳皮質は特定の電気生理学的および生化学的性質、シナプス、それぞれ興奮性と抑制性のニューロンの多くの種類の構成され、生体内での機能しますが、彼らの基本的な機能と解剖学的組織細胞からネットワークの規模にはよくわかっていません。ここで脳皮質の細胞組織の調査のための広い領域にわたって蛍光標識細胞の三次元イメージング法について述べる.特定の種類のニューロンの蛍光の逆行性神経トレーサーの注射やトランスジェニック マウスにおける蛍光タンパク質の発現によってラベルです。ブロック脳サンプルなど北半球の固定後に準備、透明なクリア方法、組織で作られて、特定の細胞型の蛍光反応を受けます。大きな作動距離の対物レンズとモーターを備えられた段階装備共焦点または 2 光子の顕微鏡を使用して大規模な領域がスキャンされます。このメソッドは、マウス大脳皮質における細胞型固有マイクロカラム機能モジュールの定期的な組織を解決できます。プロシージャは、多様な脳の領域や他の複雑な組織に三次元細胞アーキテクチャの研究のために役立ちます。
Introduction
哺乳類の大脳皮質はそれぞれ特定の遺伝子発現パターン、電気生理学的および生化学的特性、シナプス接続は、細胞の種類、数が多いから成るし、生体内機能1,2 、3,4,5,6,7。これらの細胞型を繰り返し構造に整理するかどうかがはっきりしなかった。視覚的方位選択性コラムや体性感覚の樽など、皮質カラム構造を繰り返しているが、細胞組織不明8,9のままです。これらは特定の皮質領域内に存在であり、脳全体のシステムではないです。
新皮質層 5 のニューロンの大部分は、4 つの主要な種類に分類されます。サブ大脳投射ニューロン興奮性ニューロンの主要なタイプは、ポンス、脊髄、上丘など皮質下のターゲットへ軸索をプロジェクトし、したがって、皮質の主要な出力経路10を表します。皮質投射ニューロンの興奮性ニューロンのもう一つの主要なタイプは、皮質10を支配します。抑制的なニューロンはまた 2 つの主要なクラスを含む: パルブアルブミンと表現する-ソマトスタチン細胞11。
最近の分析は示す繰り返し構造12,13,14に 4 つのセルの種類を分類しました。サブ大脳投射ニューロン12,13,14と皮質投射ニューロン14は、直径 1-2 細胞の配向柱状を特定細胞型に整理します。パルブアルブミンとソマトスタチンを表現する細胞は、サブ大脳投射ニューロンの配向柱状で具体的にはなく、皮質投射ニューロン14の配向柱状を合わせます。配向柱状自身は定期的にフォーム六角形格子配列14およびマウス脳12,14言語、視覚、体性感覚と運動の分野を含む複数の皮質にある整列します。人間の脳の13のエリア。マイクロカラムを個々 のニューロン同期された活動の展示し、同様の感覚の反応がある14。これらの観察は、レイヤー 5 セル タイプはまとめる機能モジュールを繰り返しの最初の知られている脳全体の組織を表すマイクロカラム格子構造を示しています。
配向柱状約 10 μ m の半径を持っていると約 40 μ m の空間的周期.また、配向柱状の向きは尖樹状突起、皮質14の彼らの位置によって変化に平行です。したがって、マイクロカラム システムは数十マイクロメートルの典型的な厚さと従来の皮質のスライスを使用して解析することは困難です。さらに、周期性の解析の脳領域と、したがって、共焦点顕微鏡の典型的な画像領域の広い範囲から三次元データを必要とするまたは 2 光子励起イメージング生体内では狭すぎます。
最近では、厚い組織15,16をクリアする技術が開発されています。ここマイクロカラム システムを構成するマウス皮質層 5 の主要な細胞型の大型の三次元のイメージを取得するこれらのメソッドのアプリケーションについて述べる。逆行性ラベリングすることCrym egfpトランスジェニック マウス12と皮質投射ニューロンは、逆行のどちらかによりラベル付けされた強化された緑色蛍光タンパク質の発現によって、皮質下投射ニューロンが付きますラベリングやTlx3-cre/Ai9 マウス17の tdTomato 式で。パルブアルブミンと表現する-ソマトスタチン細胞の免疫組織化学によるラベルです。(抗体スケール S) AbScale 法18 (を参照してください深い脳) SeeDB 法19他の実験に使用されている間、実験を汚す抗体が使用されます。これらのメソッドは、従来のイメージング方法上記の困難を克服し、層 514の正確な細胞組織を明らかにします。
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Protocol
すべて実験プロシージャ理化学研究所和光動物実験委員会と理化学研究所遺伝子組換え実験安全委員会によって承認され、理化学研究所脳科学の動物施設の制度のガイドラインに従って実行研究所。
1. イメージング室の準備
-
イメージング室19
- シリコーンゴム シートを使用して、様々 な厚さの約 5 mm ・床版の厚さの商工会議所を準備します。また、シャーレ、ガラスの下部 (図 1 a) を準備します。
-
スペーサーをスライスします。
- シリコーンゴム シートの厚さ 0.5 mm (図 1) を用いたサンプルを保持するスペーサーを準備します。
2. トレーサー注入法
メモ: は、ポンス (2.1) または丘 (2.2) に注射をください。丘へ注入しながら、視覚と運動の領域を含む広い脳領域のポンス ラベル サブ大脳投射ニューロンへの注入は、視覚野でサブ大脳投射ニューロンをラベル付けします。制御実験用蛍光標識したコレラ毒素サブユニット b. の代わりに生理食塩水を注入します。無菌状態の維持のため、プラスチックの手袋をエタノールで洗浄と滅菌装置を使用します。
-
成体マウスの橋に注射をします。
- 蛍光標識したコレラ毒素サブユニット B の 1 μ L を描画 (25 μ g/μ L の PBS) 26 G ハミルトン注射器に。
- 注射器で噴射ポンプを配置します。
- 脳定位固定装置にマニピュレーターのツール ホルダーに注射器やポンプを配置します。マニピュレーター 12 ° 垂直軸から後方に傾けます。
- ペントバルビ タール ナトリウムを腹腔内に注入することによって (c57bl/6 j またはTlx3-cre/Ai9) オスかメスの成体マウスの麻酔 (60 mg/kg 体重) やイソフルラン (2-3%) を投与することによって。しっぽはマウスは完全に麻酔したことを示す、ピンセットでつままれてマウスの応答がないを待ちます。
- 脳定位固定装置にマウスを配置します。
- 感染症を防ぎ、頭皮の 10 mm を切る前とラムダが表示されるようにかみそりの刃を使用して髪を慎重に取り外します。ピペットを使用して 1% リドカインの 0.1 mL を管理します。前とラムダ、同じ z レベルできるように脳定位固定装置のマウスピースの垂直位置を調整することで頭の角度を設定します。
- 注射器の先端に近い前、脳定位固定装置にそれをスライドさせて、マニピュレーターの位置を調整し、マニピュレーターの位置を記録します。マニピュレーターのツール ホルダーを動かすことによって、注射器を撤回します。
- 移動マニピュレーター 5.4 mm 後方と 0.4 mm 横。先端が頭蓋骨にエントリ ポイントの近くにあるように注射器を進めます。注射器を撤回し、エントリ ポイントをマークします。
- マークの位置に直径約 1 mm の穴をドリルします。
- ヒント深さは 6.9 mm 前で測定するよりも、穴からシリンジの先端を挿入します。
- トレーサーの 0.2 μ L/分でポンプを使用の 1 μ L を注入します。
- 脳から注射器を削除します。
- 必要に応じて、微繊維性止血と瞬間接着剤の小さな断片と露出した脳をカバーします。
- 感染症を防ぐために、頭皮を縫合ピペット付属生理食塩水を使用して露出した脳をすすいでください。
- 脳定位固定装置から、マウスを削除します。通常は 1 h で 30 ° C でインキュベーターで麻酔から回復するマウスを許可します。放置しないでください、マウスまでそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。それは完全に回復した後マウスを他の動物の会社に戻ります。
- 3-7 日のマウスを維持します。
-
成体マウスの上の丘に注射をします。
- 先端直径 30-50 μ m のガラス ピペットを準備します。
- ガラス ピペットをプラスチック管 (図 2 a) ハミルトン注射器に接続します。
- パラフィン液体ガラス ピペット、プラスチック製のチューブ、およびハミルトンの注射器を入力します。
- 注射器で噴射ポンプを配置します。
- マニピュレーターをガラス ピペットを置き、マニピュレーター 60 ° 垂直軸 (図 2 b) から後方に傾けます。
- 2.1.4–2.1.9 を実行します。マニピュレーターの位置は、1.4 mm 後方に,、ラムダの外側 0.5 ミリメートルです。
- 頭蓋骨に小さなプラスチック パラフィン フィルムを配置し、トレーサー溶液の約 1 μ L をつけます。すぐにガラス ピペットを進めるし、トレーサー溶液の少なくとも 0.5 μ L でそれを埋めます。
- ヒント深さは脳の表面から 3.0 mm、ガラス ピペットを挿入します。
- 0.2 μ l/min のポンプを使用してトレーサーの 0.5 μ L を注入します。
- ガラス ピペットを脳から削除します。
- 2.1.13–2.1.16 を実行します。
3. 固定・ トリミング
- 注入ペントバルビ タール ナトリウム (60 mg/kg 体重) 腹腔マウス (c57bl/6 j またはTlx3-cre/Ai9、手順 2 で説明したトレーサー注入の有無。しっぽはマウスは完全に麻酔したことを示す、ピンセットでつままれてマウスの応答がないを待ちます。
- マウスをマウス transcardially20 0.9% 生理食塩水を灌によって人道的に安楽死させます。
- 灌によってマウス20を修正 0.1 M リン酸緩衝液 (7.5) で 4% パラホルムアルデヒド (PFA)。
-
はさみのペアを使用して記述されている20として頭蓋骨を公開する頭皮をカットします。
- はさみのペアを使用して公開されているスカルの正中線をカットします。頭蓋骨鉗子を使用してを削除します。
- 前とラムダの位置をマーキングが必要な場合は、まず頭蓋骨の 1 つの半球を削除します。前と頭蓋骨、脳に残りのラムダの位置で脳に細いタングステン針を挿入し、残りの頭蓋骨を削除します。
注: 脳は、4 ° C で PBS で格納することができます。
-
抗体の抑制的なニューロンの汚損を実行するためには、スライスに脳サンプルをカットします。
- Vibratome に脳サンプルを配置します。
- 室温で PBS で厚 500 μ m までのスライスを切り 5 (AbScale 法) の手順に進みます。
- 抗体染色が必要な場合はトリムに脳サンプル ブロック (3 mm 厚) かみそりの刃 (図 3) を使用して、手順 4 (SeeDB メソッド) に進みます。
注: 脳に格納できる PBS 4 ° C でカットまたはトリミング後。抗体の汚損が必要ない場合 AbScale 法よりも時間が必要なために、SeeDB メソッドをお勧めします。
4. 抗体染色 (SeeDB 法) なしクリア
- 0.5% α-チオグリセ 20 mL、20% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 4 時間インキュベートします。
- 0.5% α-チオグリセ 20 mL、40% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 4 時間インキュベートします。
- 0.5% α-チオグリセ 20 mL、60% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 4 時間インキュベートします。
- 0.5% α-チオグリセ 20 mL、80% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 12 時間インキュベートします。
- 0.5% α-チオグリセ 20 mL、100% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 12 時間インキュベートします。
- 0.5% α-チオグリセ 20 mL、80.2% (w/w) 果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 24 時間インキュベートします。
注: は、慎重に変形を可能な限り小さく維持するサンプルを処理します。サンプルはすぐに不透明になることが示されるより長いサンプルを孵化しないで。 - 80.2% 果糖液 (図 1 b) でいっぱい撮像室にサンプルを埋め込みます。必要に応じて、周辺ゴム接着剤の小さなピースを置くことによってサンプルを修正します。商工会議所が深すぎる場合は、サンプルを配置する前に商工会議所のフロア プレートを置きます。
- イメージングの商工会議所にガラスカバー付きシャーレを置き、皿と水浸漬の目的距離の長い作業と共焦点または 2 光子顕微鏡を用いた画像に水を入れます。励起波長と放出フィルターは、表 1のとおりです。必要に応じて、電動ステージを使用します。
5. 抗体染色 (AbScale 法) をクリア
- 表 2に説明されているように、試薬を準備します。
- Sca/es 0 溶液 4 mL を含む 5 mL プラスチック チューブにヘラを使用してスライスを転送し、37 ° c (図 4 b) 穏やかな揺れで 12 時間のそれらを孵化させなさい。
- ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し Sca/eA2 溶液 4 mL を追加し、37 ° C で穏やかな揺れで 36 h のスライスを孵化させなさい
- ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し Sca/eB4 溶液 4 mL を追加し、37 ° C で穏やかな揺れで 24 h のスライスを孵化させなさい
- ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し Sca/eA2 溶液 4 mL を追加し、37 ° C で穏やかな揺れで 12 h のスライスを孵化させなさい
- ピペットを使用してチューブからソリューションを削除して 4 mL の PBS を追加し、室温で穏やかな揺れで 6 時間スライスを孵化させなさい。
- ヘラを使って 2 mL プラスチック チューブにスライスを慎重に取り外します。
- 穏やかな揺れで 37 ° C (図 4)、48-72 時間 AbScale 溶液 1 mL の一次抗体 (表 3) を孵化させなさい。
- ヘラを使用して 5 mL プラスチック チューブにスライスを慎重に取り外します。
- 穏やかな揺れで部屋の温度で 2 回 2 h の AbScale 溶液 4 mL で孵化させなさい。
- ヘラを使って 2 mL プラスチック チューブにスライスを慎重に取り外します。
- 蛍光標識二次抗体 (テーブルの材料、1: 100) 穏やかな揺れで 37 ° C で 48 時間 AbScale 溶液 1 mL 中にインキュベートします。
- 慎重に AbScale 溶液 4 mL を含む 5 mL プラスチック チューブにヘラを使用してスライスを削除、室温で穏やかな揺れで 6 時間スライスを孵化させなさい。
- ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し AbScale 溶液 4 mL を追加し、室温で穏やかな揺れで 2 回 2 h のスライスを孵化させなさい。
- ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し、4% の 4 つの mL を追加 PFA と室温で穏やかな揺れで 1 h のスライスを孵化させなさい。
- ピペットを使用してチューブからソリューションを削除して 4 mL の PBS を追加し、室温で穏やかな揺れで 1 h のスライスを孵化させなさい。
- ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し Sca/eS4 溶液 4 mL を追加し、37 ° C で穏やかな揺れで 12 h のスライスを孵化させなさい
- スライド ガラスにスペーサーを配置、スペーサーでのスライスを配置し、Sca/eS4 ソリューションとスライスを浸します。カバーガラス (図 1) とスペーサーをシールします。
- カバーガラスと共焦点または 2 光子顕微鏡を用いた浸水距離目標の長い作業イメージに水を置きます。必要に応じて、電動ステージを使用します。
注: サンプルの深い部分は、ラベリングの偏りのないことを確認する表面的な部分に同様にラベル付けするかチェックしてください。
注: テスト抗体の浸透は、表 3に示すです。
6. セル位置の決定
- 各位置にスキャンした画像の三次元画像フィルター14 (図 5 a-5D) を使用して相関値を計算します。
- (図 5) の相関値のピークの位置を決定します。
- セル (図 5E) を検索するピークの周りの画像を調査します。
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Representative Results
我々 は/Ai9 トランスジェニック マウスのTlx3-creで tdTomato の発現による皮質投射ニューロンをラベルし、サブ大脳投射ニューロンを橋に CTB488 の逆行性のトレーサーを注入して可視化します。脳の左半球は SeeDB メソッドを受けたし、長い作業距離目的浸水を搭載した 2 光子顕微鏡を使用してスキャン (25 X、n. a. 1.1 作動距離 2 mm) と電動ステージ。401 の画像のスタック (512 x 512 ピクセル; ピクセル サイズ = 0.99 μ m) z ステップ = 2.8 30 スキャン位置のそれぞれで μ m が得られました。2 つの細胞の細胞体は脳の領域 (図 6)、および定期的な配向柱状 (図 7 a) を示した光学セクションの広い範囲にわたって表示されていた。さらに、(c57bl/6 j の背景を持つヘテロ接合体として維持される) Crym egfpマウスの脳は SeeDB メソッドによって解除されされ上記のようにイメージします。光学セクション (図 7 b) は細胞体と樹状サブ大脳投射ニューロンの EGFP 発現のも表示されていた。
また、c57bl/6 j マウスの CTB488 を使用してサブ大脳投射ニューロンのレトログ ラード表示を行った。固定の脳は約 500 μ m の厚さでコロナのスライスにカットし、パルブアルブミン細胞 (抗パルブアルブミン、1: 1000; のラベルに AbScale メソッドを受ける抗マウス IgG 蛍光ラベル)。画像をスタック (512 × 512 ピクセル、ピクセル サイズ 1.24 μ m = z ステップ = 2.17 μ m, 268 画像/スタック) 水浸漬の目的距離の長い作業と共焦点顕微鏡を用いて (20 X、n. a. 1.0 作動距離 2 mm)。サブ大脳投射ニューロンとパルブアルブミン発現細胞の両方のスライス (図 7) に表示されていた。
図 1: イメージング室とスペーサー 。(A) 上部: 手作りガラス底ペトリ皿 (右)、(左) 下でガラスなしシャーレ。下: 商工会議所 (右)、床プレート (左) 製シリコーン シートです。(B) A マウスの半球上丘への CTB555 の注入を設定した後商工会議所に SeeDB メソッドを受けます。サンプルは、再使用可能な接着剤で固定されています。(C) A スライド ガラス (top)、シリコン シート、厚み 0.5 mm (下) 製のスペーサー。(D) 2 つのコロナ マウスの脳スライスは、スペーサーに設定され、カバー ガラスで覆われています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: トレーサー注入。(A) A ガラス ピペット プラスチック管を通してハミルトン注射器に接続されています。(B) A マウスは、脳定位固定装置に配置されます。ガラス ピペットが傾いている上丘への注入の垂直軸から後方約 60 °。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 脳サンプルのトリミングします。CTB555 の丘と固定注入後 (A) 全脳サンプル。前とラムダは、タングステン針 (矢印) とマークされました。半球を取得する (B) 同じサンプルがトリムされます。タングステン針に (矢印) が残っていることに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: SeeDB と AbScale メソッドのソリューションに脳サンプルの浸漬。(A) 半球サンプル 0.5% α-チオグリセと SeeDB メソッドの 20% (w/v)、果糖に浸漬します。(B) コロナ スライス AbScale メソッド Sca/eA2 溶液中に浸漬します。(C) コロナ スライス AbScale のメソッドのための抗体を含む AbScale 溶液に浸漬します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: セル位置決定します。サブ大脳投射ニューロンは、5 週齢で橋に CTB488 の逆行性のトレーサーを注入することでラベル付けされました。左の脳半球は SeeDB メソッドを受けるし、2 光子励起顕微鏡でスキャン (512 × 512 ピクセル、ピクセル サイズ = 0.99 ツオ z ステップ = 2.8 μ m, 601 画像/スタック)。A (A) 単一のイメージ。単一の画像のスタックから 5 (B) の画像。(C) 画像フィルター CTB ラベル サブ大脳投射ニューロンを検出するために使用します。(D) (C) でフィルターを使用 (B) の 5 枚の画像の相関値が計算されます。(E) 検出されたサブ大脳投射ニューロンの例です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 大規模なイメージングの代表の結果。Tlx3-cre/Ai9 トランスジェニック マウスの tdTomato 式で標識された皮質投射神経細胞 (緑) とサブ大脳投射ニューロン (マゼンタ) の 7 週間で橋に逆行性トレーサー CTB488 を注入することによって想像されたもの年齢。左の脳半球は SeeDB メソッドを受けた、2,690 μ m 横に面積 1,250 μ m および-3,400 μ m 前前方 1,230 μ m には 2 光子顕微鏡を用いたスキャンだった。(A) 平面図です。皮質領域のおおよその位置を示した。(B-D)CTB 488 蛍光サブ大脳投射ニューロン (B) を示す皮質投射ニューロン (C) と (D) の結合のイメージを示す tdTomato 蛍光の斜視。A: 前部;P: 後部;M: 内側;D: 背側。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 代表的な結果の高倍率の写真。(A)図 6内のイメージの光学セクション。厚さのイメージ = 20 μ m. (B) 6 週齢でヘテロCrym egfpマウス EGFP ラベル サブ大脳投射ニューロン。画像の厚さ 30 μ m. (C) 皮質下投射 c57bl/6 j マウスのポンスに生後 49、パルブアルブミン細胞 (緑) AbScale メソッドによって想像されたもので CTB488 を注入することにより標識された神経細胞 (マゼンタ) を =。厚さのイメージ = 55 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 蛍光体 | 例: (nm) | フィルター (nm) |
| EGFP | 910 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| tdTomato | 1,000 | 578 633 (D605/55 m、クロマ) |
| Alexa Fluor 488 | 750 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 555 | 750 | 563-588 (FF03-575/25-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 594 | 750 | 601-657 (FF01-629/56, Semrock) |
| DAPI | 700 | 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock) |
表 1: 励起波長と 2 光子顕微鏡用フィルター。
表 2: AbScale のメソッドのための試薬。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
| 抗原 | 免疫動物 | 製品 ID | 濃度 | 3 mm ブロック | 500 μ m のスライス |
| NeuN | マウス | MAB377 | 1: 500 | ND | + |
| NeuN | ウサギ | ABN78 | 1: 500 | ND | + |
| CTIP2 | ラット | ab18465 | 1: 100 | L1 L6 | + |
| Statb2 | マウス | ab51502 | 1: 100 | - | - |
| GAD67 | マウス | MAB5406 | 1: 200 | ND | + |
| GABA | ウサギ | A2052 | 1: 100 | - | - |
| パルブアルブミン | マウス | 235 | 1: 1000 | ND | + |
| パルブアルブミン | ヤギ | 太陽光発電-移動-Af460 | 1: 100 | L1-L2/3 | + |
| パルブアルブミン | マウス | P3088 | 1: 1000 | ND | + |
| パルブアルブミン | ウサギ | ab11427 | 1: 500 | ND | - |
| ソマトスタチン | ウサギ | T-4103 | 1: 1000 | L1-L2/3 | + |
| Fos | ウサギ | PC38 | 1: 1000 | ND | + |
テーブル 3: テスト抗体の浸透します。3 mm 厚のブロックの結果は以下のとおり。L1-L6: 浸透全皮質の厚さ;L1-L2/3:2/3; の層に浸透-: ないの分類;ND: 未定。500 μ m の厚さにスライスの結果は以下のとおり。+: 制服の分類;-: ないまたは制限付きのラベルします。
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Discussion
我々 はマウス皮質層 5 の主要な細胞型の細胞型特異組織の大規模な三次元画像を取得するための手順を提示しています。従来スライス染色に比べると、メソッドは新皮質の三次元組織の決定に有用です。メソッドにより、広いから画像取り込みと深い脳領域は一般的な生体内の2 光子励起顕微鏡または従来の共焦点顕微鏡と比較してし、したがって、皮質細胞の包括的な分析を許可できます。組織。
このメソッドの重要なステップは、抗体浸透です。抗体のサブセットは貧しい浸透厚い標本 (表 3) を示し、したがって、AbScale メソッドには使用できません。本研究で使用される抗体と均一なラベルを取得するには、脳を 500 μ m のスライスにカットする必要があります。小さい抗体フラグメント、例えば、工場または F(ab') 2 フラグメントおよび/またはクリア方法21,22,23,24,25,26、他の使用 27,28可能性があります結果を向上させます。
抗体の抗原結合の特異性は通常薄い組織スライスの特徴ですがクリアリングのある厚い組織の異なる処理の可能性があります。抗体の特異性を制御するためは、トランスジェニック動物のトレーサー注入とマーカー遺伝子の発現と組織を共同ラベルし、も抗原蛋白質およびペプチッドの14を使用してブロックの実験を行った。これらのプロシージャおよびターゲット抗原に欠けている突然変異体の動物を用いた制御実験は、抗体の特異性を確認するために役立ちます。
メソッドの制限は、標本のいくつかの変形はソフト大量サンプルの処理のために避けられないことです。固定する前に体内の画像を取得し、参照は、このような変形を修正するのに役立ちますこれらのイメージを使用して。
現在のプロシージャは皮質層 5 の解析設計されました。最近の分析は多くの分子マーカーでは他のレイヤー4,5,6,7、そのラベル種類の神経細胞を識別した、現在のメソッドにこれらのメーカーのアプリケーションを有効にすることがあります。他のレイヤーの重要な細胞組織の id。さらに、それは配向柱状のよう正確な細胞組織が存在するかどうかを調べるため、脳以外の臓器、脳皮質以外に同様の分析を行うことが可能する必要があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ありがとう宮脇敦史・洋浜 AbScale 実験に彼らのアドバイスは、原稿の編集のためのチャールズ ・横山恵理子大島とその技術支援のみゆき岸野。この仕事は科学研究省の教育、文化、スポーツ、科学、技術 (文部科学省) 日本の倫理学に理化学研究所から研究資金倫理学と補助金によって支えられた (革新的なエリア「メゾスコ ピック Neurocircuitry」; 22115004) とS. S. (25890023)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
References
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