Summary
אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים לקיר כלי הוא תנאי הכרחי בטן יונת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור assay פונקציונלי במבחנה לניתוח ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין, נוגדנים או גורמים אחרים על הדבקה תא דינמי של תאים אנושיים באמצעות addressin מצופים נימים.
Abstract
יונת הבטן של תאים חיסוניים חשוב בפתוגנזה של מחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי). אינטגרין תלויית התא הדבקה על addressins שלב חיוני בתהליך זה, אסטרטגיות טיפוליות המפריעים אדהזיה הוקמו בהצלחה. הנוגדן אינטגרין anti-α4β7, vedolizumab, משמשת לטיפול קליני של מחלת קרוהן (CD) ו קוליטיס (UC) ותרכובות נוספות נוטים לעקוב.
הפרטים של ההליך אדהזיה ו את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-אינטגרין עדיין אינם ברורים בנוגע רבים בשל השיטות הזמינות מוגבל לחקר תפקודית בתחום זה.
כאן, אנו מציגים וזמינותו אדהזיה דינמי עבור ניתוח תפקודי של התא האנושי אדהזיה תחת תנאי זרימה וההשפעה של טיפולים אנטי-אינטגרין בהקשר של מחלת המעי הדלקתי. הוא מבוסס על זלוף תאים אנושיים הראשי דרך נימים addressin מצופה זכוכית ודק במיוחד עם ניתוח מיקרוסקופי בזמן אמת. וזמינותו מציע מגוון רחב של הזדמנויות עבור ליטושים והשינויים ומחזיק פוטנציאל תגליות מכניסטית ויישומים translational.
Introduction
תא תנועה הוא תהליך מוסדר בחוזקה לארגונה ההתפתחות והתפקוד של אורגניזמים רב תאית, אך הוא גם מעורב בפתוגנזה של שפע של מחלות1. לאחרונה, תהליך הביות של תאים חיסוניים של זרם הדם אל רקמות היקפיים צברה תשומת לב גדלה והולכת, מאז היא תורמת חידוש מלאי והרחבה של תאים פתוגניים ברקמות דלקתי במחלות immunologically בתיווך2 ,3. בפרט, יונת הוכח שיש רלוונטיות translational במחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי). טיפולי אנטי-α4β7 אינטגרין נוגדן vedolizumab הפרעה המעיים יונת הראה יעילות בניסויים קליניים גדולים4,5 , נעשה בהצלחה בעולם האמיתי הקלינית6,7 , 8. תרכובות נוסף נוטים לעקוב אחר9,10. באופן דומה, הנוגדן אינטגרין טיפולי אנטי-α4, natalizumab, משמשת לטיפול של טרשת נפוצה (MS)11.
אולם, שלנו פונקציונלי להבנת תהליך הביות באופן כללי, מנגנון הפעולה של נוגדנים טיפולית כזה בפרט הוא עדיין מוגבל. היא מבוססת היטב כי יונת כוללת מספר שלבים לרבות תא tethering, מתגלגל עם תא עוקבות אדהזיה שמוביל המשרד מעצר ואחריו טרנס ההעברה אנדותל12,13. הנוגדנים הנ ל לנטרל אינטגרינים על פני התא מניעת אינטראקציה עם addressins על אנדותל של הקיר כלי. זה נחשב לעכב תא המשרד אדהזיה14,15. ובכל זאת, אנו רק מתחילים להבין את הרלוונטיות דיפרנציאלית של אינטגרינים ספציפי עבור תא אירוח של קבוצות משנה נפרדות תא. יתר על כן, ההשפעות של נוגדנים אנטי-אינטגרין על שונים תא קבוצות משנה ואינם שיוכים מנה-תגובה במידה רבה ידועים שמוביל המון שאלות פתוחות בתחום של טיפולים ביות והצמדות אנטי-בטן ב מחלת המעי הדלקתי.
לכן, כלי עבודה נוחים כדי לטפל שאלות כאלה יש צורך נואשות. ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין על האינטראקציה addressin-אינטגרין עד כה בעיקר יוערכו על-ידי הערכת יעילות/איגוד מחייב עיכוב עם cytometry זרימה או דרך הידבקות סטטית מבחני16,17 ,18,19,20, ובכך עם פישוט לכאורה, סטייה במצב פיזיולוגי. לאחרונה הקמנו assay אדהזיה דינמי ללמוד תלויי-אינטגרין הידבקות של תאים אנושיים כדי addressins ואת ההשפעות של נוגדנים אנטי-אינטגרין תחת גזירה2. העיקרון של הטכניקה הוכח מקודם עם העכבר תאים21,22. . כאן, זה היה הותאם ופיתח להתייחס אל כל השאלות translational שהוזכרו לעיל, הפתיחה השדרות רומן טוב יותר להבין את המנגנונים של טיפול עם אנטי-אינטגרין נוגדנים ויוו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקרים שתוארו בסעיפים הבאים בוצעו על פי אישור של ועדת האתיקה של אוניברסיטת פרידריך-אלכסנדר ארלנגן-נירנברג.
1. הכנת נימים
- להתחבר נימים מלבני לאורך צינור גומי על ידי מתיחה לאורך צינור בצד אחד עם מספריים קטנות והכנסת בקפידה את נימי (כ 0.5 ס מ) לתוך הצינור. חותם את הקשר בין נימי צינור עם סרט פרפין פלסטיק.
- מעיל של נים עם µL 20 addressin (recombinant Fc כמירה; 5 µg/mL addressin, כגון MAdCAM 1, במאגר ציפוי (150 מ מ NaCl + 1 מ HEPES)) או הפתרון בקרת isotype המתאים באמצעות פיפטה p20 (נוזל יציף עצמה לתוך נימי). לאחר מכן, לאטום את הצד אינו מחובר את הצנרור עם הסרט פלסטיק פרפין, תקופת דגירה של פחות שעה ב 37 º C. שימוש נימי מלא רק עם המאגר ציפוי או עם הפקד המתאים isotype כפקד שלילי.
- להסיר את הסרט פלסטיק פרפין מקצה נימי, לרוקן את הציפוי בכך שהוא מאפשר את להשרות נוזל החוצה נימי על נייר מגבת ולחסום נימים במשך לפחות שעה עם 20 µL של חסימת פתרון (1 x PBS עם 5% BSA) ב 37 º C. חותם בצידי פתח נימי עם סרט פרפין פלסטיק. אל תסיר הפתרון החסימה לפני שימשיך מיקרוסקופ.
2. תא בידוד, טיפול והכנה מיקרוסקופ
הערה: השלבים ניתן לבצע במהלך תקופות הדרושים להכנת נימי.
- לאסוף 18 מ של דם אנושי מלא anticoagulated עם אוסף דם אספטי של וריד cubital התנדבות אנשים (למשל, מחלת המעי הדלקתי חולים ו/או פקדים בריא) לאחר הסכמה בכתב מושכלת בהתאם לנהלים המקומי ועדת האתיקה.
הערה: שלב זה צריך לבצע אך ורק על ידי צוות רפואי מיומן ומנוסה לפי תקנות לאומי ו/או מקומיים. - למלא את הדם לתוך צינור 50 מ ל ו לדלל לאמצעי אחסון של 35 מ עם 1 x PBS. אז זאת דר תערובת דם-PBS עם 10 מ"ל של צפיפות בינונית הדרגתיות.
- לבצע צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות עבור 15 דקות ב x 800 גרם ו- 24 ° C ללא בלמים כדי להפריד בין תאים.
- לאסוף את תאי תאי הדם ההיקפיים (PBMCs) על ידי כ רפה בעברית השכבה תא לבן ישר לראש צפיפות צבע בינוני השכבה (שכבה אמצעית ברור). העברת PBMCs לתוך צינור מ"ל, למלא עד 50 מ עם 1 x PBS, צנטריפוגה 10 דקות 300 x g ו- 10 מעלות צלזיוס.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של 1 x PBS, לאחר מכן לספור מספרים תא, למשל, באמצעות תא נויבאואר ספירת קאמרית.
- אופציונלי: ללמוד הידבקות של גרנולוציטים בצע את ההליך הבא. אחרת, להמשיך עם שלב 2.7 או 2.8.
- לאסוף את השכבה גרנולוציט (השכבה התחתונה ביותר לאחר צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות המכיל גם את אריתרוציטים). Resuspend התאים ב- 40 מ ל 1 x PBS. לאחר מכן להוסיף 8 מ של 6% לתוספי ב- PBS 1 x, לערבב בעדינות ולתת משקעים תאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: אריתרוציטים ישקעו לתחתית הצינור, ואילו הגרנולוציטים יישאר ההשעיה. - לאחר 30 דקות, לאסוף את תגובת שיקוע, להעביר לתוך צינור מ"ל צנטריפוגה במשך 6 דקות 300 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע ואת lyse של אריתרוציטים הנותרים על-ידי הוספת 5 מ של 0.2% NaCl ב- ddH2O. Incubate עבור 1 דקות.
- הוסף 5 מ של 1.4% NaCl ב- ddH2O דגירה עוד דקה. לעצור את פירוק היפוטוניק על-ידי הוספת 20 מ"ל של 1 x PBS, צנטריפוגה עבור 6 דקות ב x 300 גרם ו- 4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של 1 x PBS. לאחר מכן, ספירת מספרי הטלפון הנייד באמצעות תא נויבאואר ספירת קאמרית.
- לאסוף את השכבה גרנולוציט (השכבה התחתונה ביותר לאחר צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות המכיל גם את אריתרוציטים). Resuspend התאים ב- 40 מ ל 1 x PBS. לאחר מכן להוסיף 8 מ של 6% לתוספי ב- PBS 1 x, לערבב בעדינות ולתת משקעים תאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- אופציונלי: ללמוד את הידבקות של קבוצות משנה PBMC, לטהר לסוגי תאים שונים או קבוצות משנה (למשל, CD4+ ו CD8+ T תאים או CD19+ B תאים) באמצעות גרגרי לפי הפרוטוקול של היצרן או על-ידי לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא מיון (FACS). אחרת, להמשיך עם שלב 2.8.
- Centrifuge התליה תא 10 דקות 300 x g ו- 10 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע, כתם תאים עם תאים מעקב צבע (למשל, CFSE) על פי הוראות היצרן.
- לאחר מכן, centrifuge את התאים עבור 10 דקות ב x 300 גרם, ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend ב- 1 x PBS, לקבוע את מספר הטלפון ואת צנטריפוגה שוב למשך 10 דקות ב x 300 גרם.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ויטראז'ים ב הכמות המתאימה של מאגר אדהזיה (150 מ מ NaCl + 1 מ HEPES + MgCl 1 מ2 + 1 מ מ CaCl2) כדי לקבל השעיה של 1.5 x 106 תאים למ"ל. לאחר מכן, הוסף את הכמות המתאימה של 100 מ מ MnCl2 בריכוז הסופי של 1 מ מ.
הערה: תאים אלה מוכנים עכשיו מיקרוסקופ. - אופציונלי: מתייחסים לתאים עם ציטוקינים, נטרול נוגדנים או תרכובות אחרות. אחרת, להמשיך את שלב 3.
- להשמיט שלב 2.10, resuspend בגדר תא מוכתם מהשלב 2.9 RPMI בינוני (עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין) בריכוז של 1.5 x 106 תאים למ"ל.
- פיפטה 1 מ"ל של ההשעייה תא לתוך בארות רבות של צלחת 48-ובכן כפי ישנם תנאים כדי להיות מנותח. תמיד הכינו באר אחת עם תאים שלא טופלו כדי להיות perfused דרך נימי ללא ציפוי כפקד שלילית וכל אחד עם תאים שלא טופלו כדי להיות perfused דרך נימי addressin מצופים כפקד חיובי.
- לטיפול עם נוגדנים anti-אינטגרין, להוסיף את הכמות המתאימה של נוגדנים (למשל, 10 vedolizumab µg/mL) התליה תא. תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס. הטיפול בעזרת ציטוקינים, להוסיף את הכמות המתאימה של ציטוקין רקומביננטי (למשל, 10 ng/mL CXCL10) התליה תא. תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
- לאחר דגירה, קציר תאים על-ידי resuspending תאים מספר פעמים באמצעות פיפטה של p1000. העברת תאים לתוך צינור 2 מ"ל, לשטוף היטב שוב עם 1 מ"ל של PBS 1 x ולהוסיף הצינור 2 מ"ל. לקבוע את המספר הסלולרי.
הערה: דגירה של אוכלוסיות תאים חסיד (למשל, ומונוציטים) עשוי לדרוש אמצעים נוספים (למשל., טיפול עם טריפסין) כדי לנתק את התאים מהצלחת.
- צנטריפוגה תאים עבור 10 דקות ב x 300 g ב- 10 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב הכמות המתאימה של מאגר אדהזיה לקבל השעיה של 1.5 x 106 תאים למ"ל. לאחר מכן, הוסף את הכמות המתאימה של 100 מ מ MnCl2 בריכוז הסופי של 1 מ מ. כאשר pretreating עם נוגדנים אינם מוסיפים MnCl2 התליה תא. תאים אלה מוכנים עכשיו מיקרוסקופ.
הערה: האחסון המזערי משמש וזמינותו היא תלויה המשאבה ואת צינורות בשימוש. במחקר זה, באמצעות משאבת סחרור של הצנרת המצוין בטבלה של חומרים, נפח מינימלי של 400 µL היה נדרש. אם הרצוי, ישים (בהתאם לסוג התא תשואה) ניתן להגדיל את הריכוז תא ההשעיה למדוד הדבקה גבוה יותר תוך תקופה קצרה של זמן. - פוטנציאל השינוי: assay תחרותי דינמי אדהזיה
- בצע את השלבים הנ עם אוכלוסיות תאים שונים לצורך השוואה אחד לשני (למשל, רגולציה ו אפקטור T תאים מבודדים באמצעות בידוד חרוז מגנטי בעקבות הוראות היצרן לפי שלב 2.7).
- כתם לכל האוכלוסייה עם צבע שונה (למשל, CFSE ו FarRed) כפי שמתואר צעדים 2.8 – 2.9 היכולת להבדיל בין אוכלוסיות תאים במהלך מיקרוסקופ.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כדורי תא ויטראז'ים ב הכמות המתאימה של מאגר אדהזיה (150 מ מ NaCl + 1 מ HEPES + 1 מ MgCl2 + 1 מ מ CaCl2) כדי לקבל השעיה של 1.5 x 106 תאים למ"ל.
- לערבב נפחים שווים של המתלים התא (למשל, 500 µL של תאי T רגולטוריים) ו- 500 µL אפקטור T תאים כדי להשיג סופית מעורב תא ריכוז של 1.5 x 106 תאים למ"ל. לאחר מכן, הוסף את הכמות המתאימה של 100 מ מ MnCl2 בריכוז הסופי של 1 מ מ. כזאת השעיות לאחר מכן ניתן לניתוח תחרותי של תהליך הדבקה על ידי פרפוזיה אוכלוסיות תאים שונים דרך נימי אותו.
3. חיים תא הדמיה של אדהזיה דינמי
- הפעלת המיקרוסקופ, בחר במסנן המתאים או לייזר כדי לעורר את התא מעקב dye(s) (למשל, 488 ננומטר לייזר עבור CFSE), אובייקטיבית המתאים (למשל, 40 X), רכישת מצב המאפשר זמן לשגות לדימות.
- הסר את הסרט פלסטיק פרפין מקצה נימי וחבר את נימי עם חתיכה קצרה של אבובים (כ 5 ס מ אורך) על ידי מתיחה לאורך צינור בצד אחד עם מספריים קטנות והכנסת בקפידה את נימי (כ 0.5 ס מ) לתוך הצינור. חותם את החיבור בין נימי צינור עם הסרט פלסטיק פרפין.
- לטעון את נימי על מגש קיבעון (למשל, מכסה מצלחת 6-ובכן עם מלבני לגזור את מעט קצר יותר מאורך נים) ומניחים את נימי קבוע על מגש האוחז המיקרוסקופ, כך נימי נמצא המוקד ומוכן עבור מיקרוסקופ.
- הכנס לאורך צינור גומי לתוך החריץ המתאים של המשאבה ממברנות ולמקם הסוף שאינו מחובר את נימי לאמבטיה מדגם עפ י המכיל התליה תא. הכנס הצינור קצר בצד השני של נים צינור 15 מ"ל. לאיסוף זרימה דרך.
- . תן את המילוי אבובים עם קצב זרימה של 500 µL לדקה עד התליה תא מגיע כמעט את נימי. אז תן מילוי קפילרי קצב זרימה של µL 100/min.
הערה: מהיר להתמלא של נים מבטיחה בהתפלגות רגילה של התליה תא פנימה נימי. - כאשר נימי מתמלא התליה תא, להתאים את קצב הזרימה כדי µL 10/min.
הערה: המחירים זרימה הללו עשויים להשתנות, כאשר נימים של גודל שונה או משאבות סחרור שונים משמשים. במחקר זה, קצב הזרימה של µL 10/min אופטימלי עבור משאבת ו נימים לחקות ויוו זרימת הדם. - לכידת תמונות בצילום מואץ של תאי עובר לאט דרך נימי לאורך addressin מצופים בתוך הקיר כל 2 s עבור סכום כולל של 3 דקות.
הערה: במרווחי זמן של הזמן הכולל עשויות להשתנות בהתאם לסוג התא שאלה שתפנה. - לפני השלכת את נימי, מסך את כל נימי דרך היצירה העין של מיקרוסקופ כדי לוודא כי הסעיף שמוצג על הוידאו הוא נציג. במידת הצורך, לבצע הקלטה השני.
- ללא הצנרת מהמשאבה ולתת את הנוזלים הנותרים לרוץ בחזרה לתוך הצינורית 2 מ"ל, ולאחר מכן נתק את נימי אבובים ממגש קיבוע ולהמשיך נימי הבא.
4. הערכה וספירת תא
- לפתוח את רצף זמן לשגות עם התוכנה המתאימה ולייצא את התמונות הראשון שלוש ("התחלה") ותמונות שלושת ("סיום") כקובצי Tiff.
- שלושה "מתחיל" התמונות ב- ImageJ, פתוח להמיר ל- 32 סיביות ('תמונה | סוג | 32 סיביות ') מיזוג תמונות (' תמונה | צבע | למזג ערוצי; להקצות את הצבעים אדום, ירוק וכחול תמונות שונות). המרת תמונה ללא הפרדות צבע RGB (' תמונה | Type-RGB') ולשמור כקובץ Tiff. חזור עם תמונות "סיום".
הערה: במבחני אדהזיה תחרותי דינמי עם תאים צבעונית עם צבעים שונים, לפצל תחילה את הערוצים של תמונות כדי לנתח את הידבקות של אוכלוסיות תאים שונים בנפרד. - לספור את התאים הלבנים גלויות ב- "התחלה" של "סיום" הפרדות צבע, החסר את מספר התאים הלבנים "מההתחלה" את התאים הלבנים בסופו של דבר"".
הערה: ההבדל מייצג מספר לאחרונה הקפדה תאים במרווח זמן 3 דקות. בתמונה ללא הפרדות צבע, תאים שזז גלויים בצבע מסוים שובץ למסגרת המתאימים מאז הם בתרגום במקום אחר במסגרת הקודמים והבאים. עבור תאים שנמצאים כנצרות, האותות אדום, ירוק וכחול באותו החפיפה ספוט ללבן. - כדאי להמחיש את התוצאות, לקמפל וידאו רצפי זמן לשגות, למשל, באמצעות ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה המובאת כתב יד זה שואף לדמות התהליך ויוו של התא האנושי אדהזיה לקיר אנדותל פונקציונלית ככל האפשר כדי להעריך תא אדהזיה ואת התפקיד של נוגדנים מפריעות. לכן, נימים זגוגית מצופה addressins, perfused עם תאים אנושיים fluorescently שכותרתו עניין באמצעות משאבה זלוף. ניתן לצפות באמצעות תא חי הדמיה את הידבקות תאים אנושיים כדי addressins בזמן אמת (איור 1).
שיטה זו מתאימה במיוחד התירי את המנגנונים של טיפולים למניעת הידבקות במחלת המעי הדלקתי. כפי שמוצג באיור 2A, מוביל זלוף של נימים מצופה ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM 1 ו- Isotype Fc הכימרה עם PBMCs האנושי אדהזיה מסומן, כשיש לאחד addressins 3. לעומת זאת, הדבקה על נימים מצופים isotype היא מזערית. עיכוב של addressin-אינטגרין אינטראקציות באמצעות נוגדנים נטרול בדרך כלל מוביל ירידה ניכרת של אדהזיה דינמי זה נעדרת, מתי isotype שליטה נוגדנים נוספים (representatively אילוסטרייטד ב איור 2B, איחדו נתונים כמותיים ב- 2C איור).
באופן דומה, ההשפעה של נוגדנים על זיקה אינטגרין אפנון יכול ייחקרו במערכת זו על ידי דגירה מראש עם כזה פפטידים בתוך חוץ גופית. כפי שמוצג על-ידי נציג נתונים איור 3, טיפול של CD4+ אנושיים ותאי T עם CCL2 או CXCL10 מוביל אדהזיה מוגברת MAdCAM-1 לעומת תאים אנושיים ללא טיפול.
איור 1: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה. הכנת addressin מצופה נימים ודק במיוחד, שכותרתו fluorescently תאים אנושיים (משמאל) ואחריו זלוף של תאים דרך נימי באמצעות משאבת סחרור (באמצע) זמן לשגות מיקרוסקופ (מימין). שינוי בהיתר הפניה23. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אדהזיה דינמי של ציוד היקפי האנושי דם תאי תאי (PBMCs) מתורמים שליטה שונה addressins. (א) מספר לאחרונה הקפדה PBMCs כדי נימים מצופה עם addressins ספציפי או עם שליטה Fc Isotype (n = 6). (B) להחליפן בתמונות של אדהזיה דינמי בנימים ICAM-1 מצופה perfused עם לא מטופל PBMCs (NT) או תאים מודגרות עם נוגדן anti-CD18 µg/mL 10 או 10 µg/mL IgG isotype בפקד. התחלה: התמזגה תחילה שלוש תמונות של הרצף 3 דקות; סוף: התמזגה לאחרונה שלוש תמונות של הרצף 3 דקות; תאים הקפדה מתוארים לבן. המספרים שלהם, כמו גם את ההבדל (קרי, שזה עתה הקפדה תאים) מסומנים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ג) ההשפעה של נוגדנים אנטי-integrin (כל אחד משמש-ריכוז של µg 10/mL) על הידבקות דינמי. משמאל: מספר לאחרונה הקפדה לתאים נימים מצופה ICAM-1, perfused עם מטופל, anti-CD18-טיפול או אג isotype תאים שטופלו שליטה; האמצעי: מספר לאחרונה הקפדה לתאים נימים מצופה VCAM-1, perfused עם מטופל, שטופלו natalizumab או אג isotype תאים שטופלו שליטה; מימין: מספר לאחרונה הקפדה לתאים נימים מצופה MAdCAM 1 ו perfused עם מטופל, שטופלו vedolizumab או אג isotype שטופלו שליטה תאים (n = 5-6). ברים מצביעים על אמצעי עם שגיאת התקן של הממוצע (SEM). בדיקות סטטיסטיות בוצעה עם חד-כיווני אנובה ואחריו מבחן השוואה ניומן-Keuls מרובים (* p < 0.05; * * p < 0.01). שינוי בהיתר הפניה23. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: בתיווך כימוקין דינמי הידבקות של CD4 האנושי+ T תאים MAdCAM-1. תמונות אדהזיה דינמי נציג וזמינותו של נימים MAdCAM 1-מצופה perfused עם לא מטופל CD4 (NT)+ T תאים או תאים מודגרות עם rhCXCL10 ng/mL 10 או 100 ננוגרם למ"ל rhCCL2. התחלה: התמזגה תחילה שלוש תמונות של הרצף 3 דקות; סוף: התמזגה לאחרונה שלוש תמונות של הרצף 3 דקות; תאים הקפדה מתוארים לבן. המספרים שלהם, כמו גם את ההבדל (קרי, שזה עתה הקפדה תאים) מסומנים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. Preincubation עם נוגדנים הפניות המסוכן דינמי מוגברת, ככל הנראה בשל אפנון אינטגרין-זיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
SupplementaryVideos: סרטים מ-3 דקות רצפי תמונות של נימים MAdCAM 1 מצופה perfused עם PBMCs fluorescently שכותרתו. נימי (א) perfused עם תאים ללא טיפול. נימי (B) perfused עם תאים שטופלו vedolizumab 10 µg/mL. נימי (C) perfused עם תאים שטופלו 10 µg/mL IgG isotype לשליטת האדם. זרימה תא מלמטה למעלה, שזה עתה הקפדה תאים מסומנים באמצעות החצים הלבנים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הנ ל מתאר טכניקה שימושית ללמוד אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים אנושי כדי ליגנדים אנדותל. דרך וריאציה על ליגנדים מצופה, סוגי תאים perfused או קבוצות משנה, דגירה עם גירויים נוספים או נטרול נוגדנים שונים, הוא כמעט בלתי מוגבל של יישומים אפשריים. לכן, מבחני אדהזיה דינמי כזה עשוי להיות שימושי לענות על שתי שאלות עקרוניות של מחקר בסיסי, כמו גם שאילתות translational שיכול לעזור לפתח, לייעל את הטיפול הקליני עם סמים מפריעים לתהליך אדהזיה.
השירות של וזמינותו לחקור את ההשפעות של טיפולים אנטי אדהזיה קליניים לאחרונה הוכח. יתר על כן, אוכלוסיות תאים שונות להביע סוגים וכמויות של אינטגרינים מראים רמות עקבית של הדבקה דינמי על addressins בהתאמה, לשיטה assay23.
באופן כללי, השלמת הפרוטוקול צריך בערך 6 שעות של עבודה ומציגה האתגרים הטכניים ביניים. לאחר הציפוי של נים החלה, נושא קריטי הוא כדי למנוע התייבשות. זה דורש איטום מדויק במהלך השלבים דגירה וטיפול זהיר של הנימים, בעת החלפת פתרונות. בנוסף, החניכה של תהליך זלוף מחייבת זהירות מסוימים. עקב כמות הצנרת מת, זה לא ריאלי כדי למלא את הצנרור שלם עם קצב הזרימה זלוף הסופי. מצד שני, שינוי קצב הזרימה, אחרי ששטף את נימי במהירות גבוהה מצריכה את הסיכון של הפרעות זרימה מוביל לאפשרות של הידבקות סטטית הגבלת התוקף לגבי אדהזיה דינמי. לכן, בורר בזמן קצב הזרימה הסופי הוא חיוני. קצב הזרימה הסופי צריך להיבחר תלויים הגודל משאבה, אבובים, נימי המשמש. כדי לחקות את זרימת הדם האנושי venules אנדותל גבוה בתור קרוב ככל האפשר, זרימה נפח של 0.1 ל 5 מ מ/s מומלץ24,25.
הקושי וזמינותו עשוי להגדיל במידה ניכרת, כאשר השינויים מוחלים. לדוגמה, ניתוח של קבוצות משנה תא T ספציפי עשוי לדרוש בדרישה אסטרטגיות של קיטוב או טיהור-26. כמו כן, כולל את השלבים ביות של הפעלת tethering, מתגלגל ותא12 לתוך הניסוי הבאות נגדיל יותר את הקושי, מאז זה עשוי להיות צורך מעיל שילוב של ליגנדים הפנימי של נימים או לטיפול (קדם) perfused תא אוכלוסייה עם כימותרפיה או ציטוקינים להביא בחשבון תלויי-בחירת שמלות מתגלגל ו תא כימוקין-induced ההפעלה של אינטגרין זיקה אפנון27. עם זאת, אלה עשוי להיות מעניין במיוחד שאלות למחקר עתידי, במיוחד כפי שהוצגו הטכניקה מאפשרת להתייחס באופן פונקציונלי כזה מתוחכם האינטראקציה של מולקולות שונות עם תאים אנושיים, ליגנדים. כפי שהוזכר לעיל, וניתוח תחרותי דינמי אדהזיה מספר אוכלוסיות תא מוכתם אחרת באותו קפילרי יכולים להוסיף רמה נוספת של מורכבות. יתר על כן, זה גם הוכח כי ניתן להשתמש בתאי אנדותל במערכות fluidic במקום ליגנדים רקומביננטי28.
למרות assay פונקציונלי, הטכניקה מוגבל על ידי צמצום של רשתות מורכבות ויוו לקבוצה הנבחרת של מולקולות מעורב במבחנה. משמעות הדבר היא כי ההשפעות של גורמים נוספים לא ידוע או לא צפוי ייתכן להתעלם או לא מספיק בחשבון. עם זאת, זה בעיה בתדירות גבוהה במחקר האנושי, בגלל שיקולים אתיים לעיתים קרובות וחלילה מכניסטית ויוו חקירות29.
יחדיו, פרוטוקול זה מציג וזמינותו פונקציונלי לניתוח של אינטגרין תלוית אדהזיה דינמי טיפולים אנטי-אינטגרין במחלות מעי דלקתיות. העיקרון הבסיסי הוא די ישר קדימה, לא קשה מדי לביצוע, זה יכול להיות מיופה, שונה לגבי מספר ויש לו את היכולת לענות על שאלות translational לגבי טיפול אנטי אדהזיה מחלת המעי הדלקתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.F.N. שימש כיועץ עבור Pentax, ג'וליאני, MSD, Abbvie, ינסן, טקדה ו- Boehringer. M.F.N., ש ז קיבל תמיכה במחקר טקדה, רוש.
Acknowledgments
המחקר של CN, IA, מחוברים MFN SZ נתמך על ידי המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF), תוכנית ELAN את אוניברסיטת ארלנגן-נירנברג, Kröner-Fresenius-Stiftung אחר, פריץ-בנדר-Stiftung, קרוהן, גרמנית ו קוליטיס קרן (DCCV), טופס קבוצת מחקר קליני של הגרמנית למחקר המועצה (DFG), התוכנית נושא DFG על Microbiota, היוזמה שדה המתעוררים את DFG שיתופי מחקר מרכזי 643, 796 and 1181.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 mL Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02 mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Binder, M. -T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , in press (2018).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
- Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
- Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
- Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), London, England. 309-318 (2014).
- Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), London, England. 135-144 (2017).
- Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
- Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
- Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
- Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), Baltimore, Md. 1497-1505 (1997).
- Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
- Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
- Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
- Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
- Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
- Binder, M. -T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
- Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
- House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
- Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).
