Summary
يصف لنا وضع بروتوكول للحث على تصلب الشرايين في جذر الابهر الذين--/-- الفئران التي تتغذى على نظام غذائي atherogenic، من خلال إصدار مستمر من الدوستيرون. ويرد أيضا أساليب لتحديد خصائص تكوين اللوحة.
Abstract
تصلب الشرايين هو سبب استجابة التهابات مزمنة التي تؤثر على بطانة الأوعية الدموية وروجت عدة عوامل مثل ارتفاع ضغط الدم، ودسليبيدميا، ومرض السكري. وحتى الآن، هناك أدلة لدعم دور لتعميم الدوستيرون كعامل خطر لتطوير مرض القلب والأوعية الدموية. تم إنشاؤها نماذج الماوس المحورة وراثيا دراسة العمليات الجزيئية والخلوية، مما يؤدي إلى تصلب الشرايين. في هذه المخطوطة، يصف لنا بروتوكول الذي يستفيد من التسريب المستمر الدوستيرون في الفئران الذين-/- ويولد لويحات تصلب الشرايين في جذر الابهر بعد 4 أسابيع من العلاج. ولذلك، نحن، توضيح طريقة للقياس الكمي وتوصيف للآفات تصلب الشرايين على مستوى جذر الاورطي. تمثل القيمة المضافة لضخ الدوستيرون جيل آفات تصلب الشرايين الغنية بالدهون والخلايا الملتهبة بعد 4 أسابيع من العلاج. يصف لنا بالتفصيل الإجراءات المصبوغة التحديد الكمي لمحتوى الدهن وبلعم داخل اللوحة. جدير بالذكر أن في هذا البروتوكول، نقوم بقلب تضمين الأنسجة في أكتوبر من أجل الحفاظ على أنتيجينيسيتي أنسجة القلب وتيسير إمكانية الكشف عن المستضدات للفائدة. تحليل النمط الظاهري اللوحة يمثل نهجاً صحيحاً لدراسة الفسيولوجيا المرضية للتنمية تصلب الشرايين وتحديد الأهداف الدوائية رواية لتطوير الأدوية المضادة أثيروجينيك.
Introduction
تصلب الشرايين أحد الأسباب الرئيسية للوفيات والإصابة بالأمراض في جميع أنحاء العالم1. ويتميز بدولة التهاب مزمن حيث تكون الأوعية الدموية تسلل الدهون والكريات البيضاء التي تحدد تشكيل لويحات تصلب الشرايين. معظم الأحداث القلبية الحادة المرتبطة بأحداث الخثاريه بسبب تمزق اللوحة. يتم تعريف "الضعيفة" لويحات المعرضة للتمزق وتتميز بزيادة تسلل الكريات البيضاء برو التحريضية، ونواة نخرية، و كاب ليفية رقيقة2. في العقود الماضية، وقد أوضحت الدراسات السريرية والتجريبية الفسيولوجيا المرضية المعقدة للمرض. وتستخدم عدة نماذج حيوانية للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تشارك في تنظيم دورات تعريفية لتصلّب الشرايين3. حاليا، هو الماوس الأنواع الأكثر استخداماً لدراسة تصلب الشرايين وعلى الرغم من بعض الاختلافات إبلاغها الموجودة في الفيزيولوجيا المرضية، بالمقارنة مع البشر. على وجه الخصوص، تعميم الكولسترول يتكون أساسا من البروتينات الدهنية الكثافة (مع خصائص أنتياثيروجينيك) في نماذج الماوس، بينما البشر تعميم الكولسترول أساسا هو نقل ك low-density البروتينات الدهنية (LDL)، ربما تمثل السبب الرئيسي لماذا لا تتطور الفئران البرية من نوع تصلب الشرايين عفوية4. وعلاوة على ذلك، الفئران نوع البرية عموما مقاومة لامتصاص الكولسترول من الغذاء، بينما البشر تستوعب حوالي 50% من الكولسترول الغذائي4. للتغلب على هذه القيود، تم إنشاؤها عدة نماذج الماوس المعدلة وراثيا. وتستخدم على نطاق واسع الابوليبوبروتين ه – نقص الماوس (الذين−/−) والماوس – تفتقر إلى مستقبلات LDL (لدلر−/−). على حمية عالية الدهون ارتفاع الكولسترول، الفئران− −/الذين وضع اللوحة أكثر سرعة بالمقارنة مع الفئران−−/لدلر، ومن لهذا السبب، يتم استخدام الفئران− −/الذين أكثر انتشارا من أن لدلر−/−الفئران5،6. الفئران− −/الذين وضع الآفات في أي مرحلة من تصلب الشرايين، وهي مماثلة لتلك التي لوحظت في البشر، وعلى الرغم من أن لا تظهر لويحات الماوس النمط الظاهري غير مستقرة7. عموما، الذين−/− الفئران عفويا تطوير تصلب الشرايين وهو التعجيل بهذه العملية مع النظام غذائي غربي3. ويمكن تقييم شدة تصلب الشرايين على مستوى الشريان براتشيوسيفاليك، السباتي، الرئتين، والفخذ و جذر الاورطي6. على وجه الخصوص، يمثل جذر الاورطي موقع تشريحي عرضه لتطوير الآفات تصلب الشرايين في الفئران. ولهذا السبب، ممارسة شائعة لتقييم تشكيل لويحات تصلب الشرايين في هذه المنطقة.
لقد بينت دراسات عديدة أن الدوستيرون المتورطة في تطوير تصلب الشرايين8،،من910. ضخ الدوستيرون في الفئران− −/الذين تغذت atherogenic يسرع تطوير جذر الاورطي آفات تصلب الشرايين الذي يحفز تشكيل اللوحة ملتهبة والغنية بالدهون10.
وباختصار، نحن وصف بروتوكول بما في ذلك ضخ الدوستيرون، atherogenic حمية تغذية، والتضمين من أنسجة القلب، والتقدير الكمي وتوصيف للآفات تصلب الشرايين في الفئران الذين-/ . هذا الإجراء يعزز تشكيل لويحات تصلب الشرايين الملتهبة، والغنية بالدهون كفاءة، ويمثل نموذجا قيماً لدراسة أثيروجينيسيس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الدراسة بالمعاهد الوطنية الإيطالية للرعاية الصحية واستخدام اللجان، إذن رقم 493/2016-العلاقات العامة. وقد أجريت جميع الإجراءات للمبادئ التوجيهية "الاتحاد الأوروبي" لاستخدام الحيوانات التجريبية (التوجيه الأوروبي، 2010/63/رق).
ملاحظة: غرس تحت الجلد من ناضح مينيبومب التي تحتوي على المركبات (الإيثانول في المحلول الملحي) أو الدوستيرون (240 ميكروغرام · كجم-1 · د-1) في الأسبوع 8-10-الفئران الذكور القديمة قاصرة للجينات الذين . في العام، 8-10 الأسبوع-القديمة الذكور الذين−/− الفئران تزن حوالي 25-26 ز.
1-تذويب الدوستيرون
- حل 5 ملغ مسحوق الدوستيرون في 1 مل إيثانول المطلقة.
- إضافة 56.7 ميليلتر من الدوستيرون (الذائبة في الإيثانول) إلى 68.3 ميليلتر من المحلول الملحي بغية الحصول على تركيز 2.27 ميكروغرام/ميليلتر. ملء مينيبومبس ناضح كامل تماما مع 125 ميليلتر لهذا الحل (السعة القصوى لكل مينيبومب هو 125 ميليلتر).
- استخدم معدل تدفق مينيبومب 0.11 ميليلتر/ساعة؛ ولذلك ميليلتر 2.64 الحل هو الإفراج عن كل حاء 24 إعطاء كل الفأر حوالي 6 ميكروغرام · د-1 من الدوستيرون لمدة 28 يوما.
2. ملء المضخة ناضح وغرس
ملاحظة: يتم توفير مضخات في جزأين منفصلين: الهيئة الرئيسية للمضخة ومنظم التدفق.
- ملء والتعامل مع مينيبومبس استخدام القفازات الجراحية.
ملاحظة: زيوت الجلد قد تتداخل مع أداء مينيبومبس. يجب تنفيذ الخطوات التالية في غطاء الاندفاق الصفحي عقيمة. - إرفاق أنبوب الملء (المتوفرة مع مينيبومبس) بحقنه 1 مل ووضع الحل الدوستيرون أو مركبة.
ملاحظة: من المهم تجنب ترك الهواء داخل المحاقن بينما يسفط الحلول من أنبوب لمنع تكوين فقاعات الهواء إلى المضخة. - إدراج أنبوب الملء من خلال الثقب في الجزء العلوي من مينيبومب حتى يمكن أن تذهب أي مكان آخر (الشكل 1A-1B). ملء المضخة ببطء مع الدوستيرون أو مركبة. لاحظ الظل الظلام داخل المضخة التي تشير إلى مستوى السائل. مشاهدة هذا ارتفاع مستوى جنبا إلى جنب مع ملء المضخة.
- وقف ملء المضخة عندما ترتفع حبة سوائل خارج الجسم المضخة.
- بعناية إزالة أنبوب الملء وإدراج منظم التدفق في جسم مينيبومب (الشكل 1). تأكد من أن الجهة المنظمة ليجلس مشددة ضد الجسم المضخة. اترك المضخات ناضح شغلها في كوب يحتوي على المحلول الملحي المعقم في 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل غرس في الماوس (الإجراء فتيلة).
- إجراء عملية جراحية في منطقة تطهيرها مع الإيثانول 70% يعزز أسيبسيس.
- ضع قطرات 1-3 في موقع شق من 0.25% bupivacaine وتخدير الحيوان مع إيسوفلوراني 3%. بدوره على إمدادات الغاز وتعيين مقياس التدفق إلى 500-1000 مل/دقيقة مكان الحيوان في قاعة توجيهي وختم الأعلى. قم بتشغيل المرذاذ إلى إيسوفلوراني 5% ورصد الماوس حتى راقد.
- تبديل نظام بالتدفق إلى نوسيكوني. إزالة الحيوان من الدائرة والموقف في نوسيكوني. في 2-3 دقائق، يبدأ الماوس توقظ. استئناف تدفق الغاز مع مقياس التدفق في 100-200 مل/دقيقة والمبخر في إيسوفلوراني 3%.
- ضمان العمق الكافي للتخدير قبل تنفيذ الإجراءات عن طريق اختبار سحب دواسة وردود الفعل بالبيبرال. مراقبة التنفس واستجابة للتحفيز أثناء الإجراء وضبط المبخر حسب الحاجة.
- حماية القرنيات من الجفاف عن طريق تطبيق مرهم العيون.
- إعداد الحيوان عن طريق إزالة الشعر من الموقع الجراحي باستخدام الشفرة (الشكل 1). الموقع المعتاد لغرس مضخة تحت الجلد على ظهره.
- إعداد موقع الجراحية مع لوحة غير المنسوجة مواد مشبعة بكحول الأيزوبروبيل 70%.
- استخدام مساحة نظيفة ومخصصة (تطهيرها مع الإيثانول 70 في المائة) ومغطاة ثني عقيمة. ضع تلميح الأدوات في معقم حبة زجاج. تبدأ عملية جراحية بأدوات معقمة والتعامل مع الصكوك أسيبتيكالي.
- استخدام مقص الجراحية جعل من 0.8-1 شق سم (حوالي 2 سم قريبة من الذيل)، كما هو مبين في أرقام 1E 1F. الحفاظ على العقم بعدم لمس أي شيء خارج مساحة مخصصة الجراحية مع قفازات معقمة أو تلميحات الأدوات.
- العناية بقطع الجلد فقط ولكن ليس الأنسجة الكامنة. استخدام يدا واحدة للاحتفاظ بالملقط لفتح الشق. استخدام اليد الأخرى لعقد تروكار ينتشر الجلد من أجل إنشاء جيب للمضخة من الخلف صعودا إلى الكتف (على الجانب الأيمن أو الأيسر للماوس).
- إدراج المضخة في الشق. بلطف دفع المضخة تماما إلى الجيب (الشكل 1 ح). ينبغي أن يكون هناك ما يكفي الجلد مجاني لإغلاق الجرح بأي توتر أو تمتد من الجلد بحاجة. بمجرد تم إدراج المضخة، خياطة الشق مع سلك الجراحة (بوليجلاكتين 910 مع خياطة الحجم 6-0)
ملاحظة: يجب أن يكون رئيس الجهة المنظمة للتوجه نحو الجزء الأمامي الماوس (الشكل 1). - تطبيق 10% البوفيدون/اليود مرهم موضعي مع مسحه نظيفة (رقم 1I) وإبقاء الحيوان في مرحلة الاحترار. لا تترك الفئران غير المراقب حتى أنهم استرداد ريكومبينسي القصية. تقييم وضع الماء وإدارة 0.5 مل محلول الملحي 0.9% تحت الجلد إذا لزم الأمر. العودة الحيوان السكن الروتينية.
- اتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية للوثائق (مثلاً، ملء استمارة جراحية مع معلومات من المنطوق وبعد العمليات الجراحية، تحديث بطاقة القفص مع الإجراء والتاريخ) وتوفير المسكنات (البوبرينورفين، 0.05 مغ/كغ) تقليل الألم بعد الجراحة و المضادات الحيوية (انروفلوكساسين 85 مغ/كغ) لتجنب العدوى بعد الجراحة.
- مواصلة الرصد اليومي ودراسة لعلامات ألم. انتبه أن الجرح مغلق تماما وهو الحفاظ على مينيبومب في جيب تحت الجلد. وقد فتح الجرح وقد تفقد الماوس مينيبومب.
3-تشريح القلب
- وقت التضحية، الفئران أنيستيثيزي مع 80-100 مغ/كغ زوليتيل التي تديرها عضليا. زوليتيل يستحث التخدير العميق. ملاحظة: تحقق من أن الفئران في عمق كاف للتخدير قبل تنفيذ الإجراءات عن طريق اختبار دواسة وردود الفعل بالبيبرال؛ وسوف perfused الفئران بينما تخديره من عميق. فتح تجويف الصدر، باستخدام المقص والملقط، بقطع الأضلاع أفقياً للقص، مع القص ويجري سحب نحو الرأس.
- نتخلل الماوس عبر البطين الأيسر بخطورة نظام التروية مع 10-15 مل المحلول الملحي الفوسفات مخزنة المثلج دولبيكو (PBS)، ومن ثم مع 40-50 مل من 10% فورمالين مخزنة محايدة لإصلاح المفرج. تتم الإشارة إلى التثبيت عند الفئران يحمل تقلصات عضلة قوية وتصبح جامدة.
ملاحظة: تجري عملية إصلاح في 10-20 دقيقة. فمن الممكن لاستخدام الأجهزة الثابتة والأنسجة لإجراء الفلورة أو التحليلات إيمونوهيستوتشيميستري. الأهم من ذلك، لا يمكن استخدام هذه الأنسجة الثابتة للتعبير الجيني والتحليلات الغربية النشاف. - فصل في القلب من الشريان الاورطي بعقد القلب مع الملقط وقطع مقص أو شفرة المبضع، أما عمودياً على المحور من الشريان الاورطي، أقرب ما يمكن إلى القلب دون التسبب في أضرار (الشكل 2A). استخدام شفرة المبضع لخفض العرض على طول خط مستقيم يربط النقاط السفلي من الاذين الأيمن والأيسر (الشكل 2).
- ملء الجزء العلوي من قلب مقطعة (من خلال تجويف القلب) مع قطع الأمثل المجمع (OCT) (الشكل 2D--2E). وضع الأنسجة داخل قالب بلاستيك كريوسيكشن مع المحور من الشريان الاورطي توضع عمودياً لقاعدة العفن مستطيلة وتغطي مع أكتوبر (الشكل 2 واو). ينبغي أن يكون هناك لا فقاعة هواء المحاصرين. في حالة وجود أي فقاعة، محاولة لتحل محل ذلك إلى الحافة.
- وضع لوحة معدنية على الثلج الجاف ومن ثم وضع بعناية العفن في (الشكل 2). عندما يصبح OCT أبيض، التفاف القالب برقائق الفضة ومن ثم تخزين في –80 درجة مئوية.
4-قطع المقاطع من "جذر الابهر"
- تعيين الجهاز كريوستات إلى –20 درجة مئوية. قبل قطع، ضع الأنسجة جزءا لا يتجزأ واتركه هناك لمدة حوالي 15 دقيقة لضبط درجة الحرارة هذه. ضبط درجة حرارة العينة حامل إلى-17 درجة مئوية (الشكل 3A).
- وضع كتلة القلب المجمدة داخل الجهاز كريوستات بتوازن درجة حرارة الكتلة إلى كريوستات (الشكل 3B) وتأخذ بها كتلة القلب المجمدة من العفن (الشكل 3). قص OCT الزائدة من كتلة المجمدة التكيف على نحو أفضل أبعاد كتلة لصاحب العينة (3D الشكل).
- جبل كتلة القلب المجمدة على صاحب العينة المنحى مع تواجه البطين إلى الخارج (الشكل 3 أي-3I) وإدراج صاحب العينة العينة توجيه رئيس (3J الشكل). ضبط اتجاه صاحب العينة للسماح بخفض كتلة بغية جعل جذر الاورطي عمودي على الشفرة (الشكل 3 K).
- قص الكتلة وتجاهل الشرائح حتى يتم الوصول إلى جذر الاورطي (الشكل 3 L-3N). جمع الأجزاء المسلسل ووضعها على الشرائح الزجاجية (3O الشكل). رصد الشخصية جذر الاورطي تشريحي تحت المجهر حتى تظهر جميع الصمامات الابهري 3 (الشكل 3 ف-3Q).
- تجميع المقاطع في 10 ميكرون/قسم "النفط س الأحمر" وتلطيخ "بيكرو سيريوس الأحمر"، وفي 6 ميكرومتر/قسم MAC3 لتلطيخ (3R الشكل). تجمع حولها شرائح 6-8 (لكل قلب) حتى واحد من ثلاث صمامات يختفي أو غير سليمة بعد الآن.
5-إيمونوهيستوتشيميستري
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات المصبوغة عنها في البروتوكولات التالية في الزجاج كوبلين المصبوغة الجرار.
-
النفط يا أحمر وصمة عار للدهون محايدة
- إصلاح أبواب في 70 مل 37% فورمالدهيد للحد الأدنى 5 يغسل جيدا بماء الصنبور ولطخة خارج المياه الزائدة.
- تمييع 48 مل من "الزيت الأحمر يا" (0.5% في الايزوبروبانول) في 32 مل ماء المقطر للحصول على "النفط الأحمر يا" 0.3 في المائة.
- وصمة عار المقاطع في 70 مل من "الزيت الأحمر يا" 0.3% لأقسام الغسيل 10 دقيقة في الاستفادة من المياه لمدة 10 دقائق.
- وصمة عار لمدة 1 دقيقة في 70 مل لتوضع في ماير. أغسل المقاطع في مياه الحنفية لمدة 1 دقيقة.
- تزج المقاطع في 70 مل من كربونات الليثيوم 0.5%. تغسل بماء الصنبور لمدة 1 دقيقة.
- جبل المقاطع مع تصاعد مائية المتوسطة والتقاط صور باستخدام كاميرا رقمية التي شنت على مجهر ضوء.
-
الأحمر سيريوس بيكرو وصمة عار للكولاجين
- قطع 10 ميكرون تجميد الأجزاء وجبل في الجزء السفلي من الشريحة.
- إصلاح أبواب في 70 مل من الأسيتون لمدة 5 دقائق والهواء الجاف والشطف بإيجاز في الماء المقطر.
- وضع المقاطع في 70 مل حمض فوسفوموليبديك 0.2% لأدنى 5 شطف بإيجاز في الماء المقطر.
- وضع المقاطع في 70 مل من 0.1% سيريوس بيكرو حل ل 90 دقيقة يشطف مرة واحدة مع 70 مل من 0.01 N HCl. تجاهل الحل.
- مكان في 70 مل من 0.01 N HCl للحد الأدنى 2 الشطف بإيجاز في ماء مقطر. الهواء الجاف.
- مكان بإيجاز في 70 مل إيثانول 70%.
- عندما يجف تماما، في 70 مل من مسح عامل أصل تربين وتحميل المقاطع باستخدام بولي (بيوتيل ميثاكريلات-co-ميثاكريلات الميثيل) على أساس تصاعد المتوسطة والتقاط الصور باستخدام كاميرا رقمية التي شنت على مجهر خفيفة.
ملاحظة: واحد من المزايا لتلطيخ "بيكرو سيريوس الأحمر" أنه من الممكن التمييز بين النوع الأول (ألياف سميكة، وانكسار مزدوج الأصفر-البرتقالي) وشبكات الألياف الكولاجين "النوع الثالث" (ألياف رقيقة، وانكسار مزدوج الخضراء) بالاستقطاب مجهرية الخفيفة11 .
-
Mac3 وصمة عار لتلطيخ بلعم
- قص 6 ميكرومتر تجميد الأجزاء وجبل في الجزء السفلي من الشريحة.
- إصلاح أبواب في 70 مل من الأسيتون البارد لأدنى 5 تزج في 70 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة.
- استخدام ماصة، أقسام الغطاء مع 1% الصوديوم دوديسيل كبريتات الحل (الحزب الديمقراطي الصربي) واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) لاسترجاع مستضد. تزج في 70 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- استخدام ماصة، تغطي الشرائح مع بيروكسيد الهيدروجين 0.3% عن 20 دقيقة أغسل في 70 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق.
- استخدام مجمعات عبدين-البيوتين (ABC)-"طقم برنامج الصحة الإنجابية" للخطوات التالية.
- استخدام ماصة، كتلة الأقسام في المصل "الأرنب العادي" في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. لا شطف.
- وصمة عار مع MAC3 (رافعة) ل 90 دقيقة في غسل الرايت في 70 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق.
- وصمة عار مع الثانوية-بيوتينيلاتيد "مفتش" مكافحة الفئران (1: 200) لمدة 45 دقيقة في شطف الرايت مع 70 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق.
- وتشمل الفروع مع أرنب مفتش ABC مدة 30 دقيقة في شطف الرايت مع 30 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق.
- تغطية المقاطع مع 3-أمينو-9-اثيلكاربازولي (AEC) 10 دقيقة شطف مع 70 مل من الماء المقطر لعشر مرات.
- وصمة عار لمدة 1 دقيقة في 70 مل لتوضع في ماير. أغسل المقاطع في مياه الحنفية لمدة 1 دقيقة.
- تزج المقاطع في 70 مل من 0.5% كربونات الليثيوم. تغسل بماء الصنبور لمدة 1 دقيقة.
- جبل المقاطع مع تصاعد مائية المتوسطة والتقاط صور باستخدام كاميرا رقمية التي شنت على مجهر ضوء.
6-صورة التحليل الآفات تصلب الشرايين في الأقسام الجذر الابهري
ملاحظة: يمكن تحليل المقاطع جذر الاورطي ملطخة بالزيت الأحمر س أو MAC3 أو جسم مضاد لمصلحة استخدام البرمجيات المناسبة (المشار إليها في الجدول للمواد). مجموع بكسل تلطيخ إيجابية لعنصر المصلحة هو تطبيع إلى منطقة البلاك عموما. الصور تم جمعها وتحليلها من قبل محقق أعمى من العلاج.
-
معايرة
- افتح البرنامج وثم حدد الصورة (في جي بي جي) يتم تحليلها.
- حدد في الصفحة الرئيسية | إنشاء | معايرة سريع.
- إعداد معايرة الصورة عن طريق رسم خط على طول شريط مقياس الصورة.
- حفظ الإعداد للمعايرة.
-
تحليل الصور
- حدد معايرة الإعداد المحفوظ من قائمة خيارات | خيار معايرة المكانية.
- حدد المعايرة | تطبيق.
- حدد أداة المضلع في القائمة تحديد ورسم محيط على امتداد جميع الآفات تصلب الشرايين.
- تحديد عدد مرات وحجمه | أنواع. من القائمة، أضف في المائةو منطقة .
- من العد/حجم القائمة، سيتم فتح نافذة جديدة وتحديد دليل .
- من هذه النافذة انقر على أداة اختيار الألوان في الصورة وحدد وضع الجمعيتان .
- أشر مؤشر الماوس في بكسل إيجابية علامة الاهتمام لإنشاء مجموعة من الألوان.
- انقر فوق عدد والقيمة المبلغ، لوحظ في جدول القياس، يشير إلى النسبة المئوية لمنطقة علامة (معبراً عنه أيضا ميكرومتر2) فيما يتعلق بالمساحة الكلية لآفات تصلب الشرايين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في 8-10 أسابيع Apo-/-- الفئران، تم زرعها مينيبومبس لبث مع السيارة أو الدوستيرون (1E الرقم-1I) وتغذية نظام غذائي atherogenic (42 في المائة من الدهون حمية السعرات الحرارية المعدلة) لمدة 4 أسابيع. في نهاية العلاج، كانت الفئران euthanized و perfused مع برنامج تلفزيوني والفورمالين 10% كما هو موضح أعلاه. تم فصلها عن الجزء قمي من القلب جذر الاورطي وكان جزءا لا يتجزأ من أكتوبر (الشكل 2). المقاطع العرضية لجذور الابهر أعدت لتلطيخ مختلفة باستخدام جهاز كريوستات (الشكل 3).
ويمكن وصف تكوين لوحة تصلب الشرايين عن طريق تلطيخ لمكونات محددة، وتحديد مراحل تطور البلاك. النفط تلطيخ "س الأحمر" يستخدم لتحديد محتوى الدهون من آفات تصلب الشرايين كما هو موضح في الخطوة 5، 1 وتلطيخ "بيكرو سيريوس الأحمر" يستخدم لتحديد محتوى الكولاجين كما هو موضح في الخطوة 5، 2، وتلطيخ Mac3 يستخدم لقياس محتوى بلعم وصف في الخطوة 5، 3. بعد 4 أسابيع من العلاج مع الدوستيرون، عرض الفئران زيادة كبيرة في الدهون (الشكل 4A-4 ج) ومحتوى بلعم (الشكل 4-4F) في لويحات تصلب الشرايين على مستوى جذر الاورطي، ولكن كانت لا توجد فروقات لوحظت في محتوى الكولاجين (الشكل 4-4I) بالمقارنة مع الفئران التي تعامل مع السيارة. والواقع أن تسارع الدوستيرون atherogenesis في هذا النموذج، الذي يحفز التهاب الأوعية الدموية ولكن ليس التليف (الشكل 4).
رقم 1. إعداد وغرس مينيبومب ناضح بالسيارة أو الدوستيرون. A-B) خطوات لملء مينيبومبس ناضح بالسيارة أو الدوستيرون. ج) خطوات لإغلاق جسم المضخة بمنظم تدفق. د-F) خطوات لإنشاء شق لغرس مضخة في الجزء الخلفي الماوس. ز--أنا) زرع مينيبومب ناضح وخياطة الشق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. إعداد القلب وجذر الاورطي للتضمين وتمزيقها. A-B) القلب هو خفض العرض على طول خط مستقيم يربط النقاط السفلي من الاذين الأيمن والأيسر. تتم معالجة الجزء قمي من القلب لتحديد تكوين تصلب الشرايين الآفات في جذر الابهر. ج) جذر الاورطي من داخل القلب. د-ه) ملء تجويف القلب مع أكتوبر و) التوجه لتشريح القلب في العفن مليئة قبل أكتوبر (مع تجويف القلب في اتجاه الجزء السفلي من العفن) ز) تجميد تشريح القلب باكتوبر في القالب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. تقطيع لجذر الاورطي باستخدام مبضع كريوستات. A) باردة قبل كريوستات وضبط درجة الحرارة المناسبة للجهاز وتشاك. ب-د) يتم فصل الصلبة أكتوبر كتلة من العفن والقضاء OCT الزائدة حول القلب باستخدام شفرة. ه--أنا) كتلة أكتوبر ثابتة، استخدام OCT السائل، على الدعم. ي-ك) الدعم إدراج في تشاك والمنحى مع تواجه البطين إلى الخارج. لم) قسم الكتلة حتى يتم كشف تشريح القلب تماما. N-O) تعيين السمك إلى 10 و/أو 6 ميكرومتر وجمع الشرائح على الزجاج. فس) التحقق من وجود جميع الصمامات الثلاثة تحت المجهر. R) تجمع شرائح اللاحقة، كما هو موضح، حتى لا تراعي الصمامات واحد أو أكثر بعد الآن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. التحديد الكمي لتكوين لوحة تصلب الشرايين في الدوستيرون-أو مركبة-يعامل الذين-/-. A-B) "س النفط الأحمر الممثل" الملون المقاطع العرضية لجذر الاورطي في الأسبوع 8-10-تعامل مع السيارة (أ) أو (ب) الدوستيرون القديمة الذين--/-- الفئران وتغذت أثيروجينيك لمدة 4 أسابيع. ج) الكمي لمحتوى الدهون كنسبة مئوية من ناحية إيجابية/إجمالي تلوين اللوحة. د-ه) Mac3 الممثل الملون المقاطع العرضية لجذر الاورطي. و) الكمي لمحتوى بلعم كنسبة مئوية من ناحية إيجابية/إجمالي تلوين اللوحة. ز-ح) الممثل بيكرو سيريوس الأحمر الملون المقاطع العرضية لجذر الاورطي. أنا) الكمي لمحتوى الكولاجين كنسبة مئوية من المساحة الإيجابية/إجمالي تلوين اللوحة. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± "يعني الخطأ القياسي" (وزارة شؤون المرأة؛ n = 6 لكل مجموعة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصلب الشرايين اضطراب التهابات مزمنة المرتبطة بالسفن الكبيرة والمتوسطة الحجم التي تنطوي على تفاعلات بين العديد من أنواع الخلايا، مثل الضامة اللمفاويات T وخلايا بطانية و خلايا العضلات الملساء1. على الرغم من محدودية موريني نماذج atherogenic، تتوفر مجموعة كبيرة من الأدلة على أن عملية تصلب الشرايين. تتميز هذه النماذج بسرعة توليد الأفواج تجريبية محددة العمر ونوع الجنس. كما تظهر الفئران خلفية وراثية محددة ومتجانسة.
تطوير لويحات تصلب الشرايين، ولاحظ في نماذج الماوس عرضه لتصلّب الشرايين، يشبه جزئيا التي لوحظت في البشر، باستثناء تشكيل لويحات غير مستقرة4. ويلاحظ تمزق اللوحة وبعد ذلك تجلط الدم، السبب الرئيسي لاحتشاء عضلة القلب في البشر، ولا في نماذج atherogenic موريني. في الورقات الأخيرة لدينا، نحن أظهرت أن ضخ الدوستيرون قادرة على حمل، بعد 4 أسابيع، يتغذى النمط الظاهري لوحة غير مستقرة في الفئران-/-الذين HFD10. وفي الواقع، أن هذا العلاج قادرة على زيادة مساحة اللوحة ومحتوى الدهون والمنطقة الملتهبة على مستوى جذر الاورطي، مع لا يوجد فرق كبير في المضمون الكولاجين مقارنة بالفئران غير المعالجة10. من المذكرة، تظهر هذه الفئران زيادة تنمية مستقلة عن ارتفاع ضغط الدم تصلب الشرايين، نظراً لأن ضغط الدم لم يتم تغييرها إلى حد كبير ب العلاج الدوستيرون10.
في هذه المخطوطة، نحن توضح بالتفصيل الإجراءات التقنية لتضمين أنسجة القلب في أكتوبر، فضلا عن خطوات متسلسلة، أي جذر الاورطي تحليل تمزيقها واللوحة. بالمقارنة مع البارافين، أكتوبر يسمح إعداد القسم مع طائفة كبيرة من سمك (1-100 ميكرومتر) مع مبضع كريوستات وتجهيز الأنسجة الحد الأدنى. القيود تشمل نوعية الأنسجة المجمدة، والتي يحتمل أن تتأثر بتشكيل بلورات الثلج ويمكن أن يغير تفاصيل سوبسيلولار وتوليد النتائج الملموسة القابلة للاكتشاف عن طريق تلطيخ إيمونوهيستولوجيكال. وفي الواقع، يعتقد نعد أفضل الحفاظ على antigen وأنتيجينيسيتي. وفي الواقع، الأنسجة المجمدة الحفاظ على هيكل المستضدات. وعلاوة على ذلك، تسمح الأنسجة المجمدة التجهيز ل immunohistochemistry لتجنب استخدام الفورمالين، ومجمع السامة والمسببة للسرطان.
جذر الاورطي موقع بسيط نسبيا لتحديد لتجهيز غذائها. هذا الموقع التشريحية معيار الذهب لدراسة التنمية الآفة تصلب الشرايين في الفئران المعرضة إلى تصلب الشرايين. البيانات التي تم الحصول عليها من تحليل هذه المنطقة محددة تسمح بإجراء مقارنات بين الفئران التي تنتمي إلى نفس المجموعة أو مجموعات تجريبية مختلفة. وفي الواقع، خلال تمزيقها من جذر الاورطي، فمن السهل الاعتراف بمنطقة محددة تتميز بوجود جميع الصمامات الثلاثة. بغية الحصول على منطقة محددة، يوصي بدقة إيلاء اهتمام خاص للعديد من الخطوات الحاسمة خلال التضمين وتمزيقها. من المهم لملء تجويف الجزء العلوي من قلب مقطعة مع أكتوبر لتجنب تكوين فقاعات الهواء في الأنسجة التي يمكن أن تعرض للخطر سلامة المقاطع. وعلاوة على ذلك، التأكد من أن زاوية القطع عمودي بالضبط إلى الشريان الاورطي تصاعدي خلال تمزيقها، من الضروري توجيه القلب مقطعة العلوي عمودياً على السطح السفلي للعفن الأنسجة بشكل صحيح. من أجل الحصول على شرائح سليمة، ينبغي أن تكون درجة حرارة كريوستات الضبط عند-20 درجة مئوية. في الواقع، قد يضر بدرجة حرارة أقل جودة المقاطع (يمكن أن تنهارأي الشفرة المقاطع يجعلها غير قابلة للاستخدام).
من المذكرة، عندما تظهر الصمامات الثلاثة، من المستحسن قطع الأنسجة مع سمك مختلفة، تبعاً لنوع التحليل الذي سيتم تنفيذه. في الواقع، سيتم استخدام بعض الشرائح لتحديد تطور اللوحة، بينما يمكن استخدام الشرائح المتبقية لمختلف ستاينينجس (أي.، سيريوس بيكرو، Mac3، إلخ.).
تظهر آفات تصلب الشرايين في الفئران تعامل مع الدوستيرون الغنية بالدهون والضامة التي تتميز باستخدام النفط الأحمر س (لتلطيخ الدهني) أو Mac3 (لتلطيخ بلعم)، سيريوس الأحمر (لتلطيخ الكولاجين) أو أجسام أخرى محددة البروتينات ذات الاهتمام. من المهم تسليط الضوء على أن تضمين OCT، خلافا لتضمين البارافين، يتجنب استخدام المذيبات العضوية أن إزالة المحتوى الدهني للآفات. ولذلك، الممكن الدهن تلطيخ مع "النفط الأحمر يا" في أقسام جزءا لا يتجزأ من أكتوبر والمحتوى الدهني لويحات تصلب الشرايين يمكن قياسها كمياً تحديداً.
في هذه المخطوطة أظهرنا أن ضخ الدوستيرون وسيلة قيمة لتعزيز تصلب الشرايين في الفئران الذين-/ . In fact، قادرة على ضخ الدوستيرون في الفئران الذين-/- : 1) زيادة تنشيط خلايا بطانية، كما يتضح من زيادة التعبير عن جزيئات يشاركون في الالتصاق والهجرة من وحيدات في المراحل المبكرة من البلاك تصلب الشرايين تشكيل12،13؛ و 2) زيادة الدهن ومحتوى الضامة برو-التهاب في جذر الاورطي مستوى10،13. هذه الآثار لا بسبب الآثار الفسيولوجية الدوستيرون10. وفي الختام، البروتوكول المقترح يمثل أسلوباً صالحاً لتوليد وتميز تصلب الشرايين في الفئران؛ وهذا يمكن أن يساعد رصد المراحل الأولى من المرض ونتائج التدخل العلاجي والتأهيل في تصلب الشرايين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من وزارة الصحة الإيطالية (كورينتي ريشيركا وغرام-2009-1594563 بي-2011-02347070 لمولودية)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
References
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
- Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease? Current Opinion in Lipidology. 21 (5), 434-440 (2010).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Do the Apoe-/- and Ldlr-/- Mice Yield the Same Insight on Atherogenesis? Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1734-1741 (2016).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Schwartz, S. M., Galis, Z. S., Rosenfeld, M. E., Falk, E. Plaque rupture in humans and mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 705-713 (2007).
- de Rita, O., Hackam, D. G., Spence, J. D. Effects of aldosterone on human atherosclerosis: plasma aldosterone and progression of carotid plaque. Canadian Journal of Cardiology. 28 (6), 706-711 (2012).
- Ivanes, F., et al. Aldosterone, mortality, and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure. European Heart Journal. 33 (2), 191-202 (2012).
- McGraw, A. P., et al. Aldosterone increases early atherosclerosis and promotes plaque inflammation through a placental growth factor-dependent mechanism. Journal of the American Heart Association. 2 (1), e000018 (2013).
- Rittie, L. Method for Picrosirius Red-Polarization Detection of Collagen Fibers in Tissue Sections. Methods in Molecular Biology. 1627, 395-407 (2017).
- Caprio, M., et al. Functional mineralocorticoid receptors in human vascular endothelial cells regulate intercellular adhesion molecule-1 expression and promote leukocyte adhesion. Circulation Research. 102 (11), 1359-1367 (2008).
- Marzolla, V., et al. Essential role of ICAM-1 in aldosterone-induced atherosclerosis. International Journal of Cardiology. 232, 233-242 (2017).
