アポ E 欠損マウスにおける鉱質コルチコイド受容体の活性化を介して動脈硬化性プラークの誘導
Summary
アルドステロンの連続リリースで、動脈硬化の食事と飼育アポ-/-マウスの大動脈における動脈硬化を誘発するプロトコルについて述べる。プラークの組成の同定手法について述べる。
Abstract
動脈硬化は、血管内皮細胞に影響を与える慢性的な炎症反応によるもので、高血圧、高脂血症、糖尿病などいくつかの要因によって促進されます。日には、心血管疾患の開発のための危険因子としてのアルドステロンを循環させるための役割を支持する証拠があります。トランスジェニック マウス モデルは、動脈硬化につながる細胞および分子プロセスの研究に生成されています。本稿では、アポ-/-マウスでアルドステロンの連続的な注入の利点を受け取り、治療の 4 週間後大動脈で動脈硬化性プラークを生成するプロトコルについて述べる。我々 は、したがって、定量化及び大動脈レベルでアテローム性動脈硬化病変の評価のための方法を示しています。アルドステロン注入の付加価値は、脂質や炎症性細胞の豊富な動脈硬化病変の治療の 4 週間後の世代で表されます。我々 は詳細にプラークの中で脂質とマクロファージの含量を定量化する染色の手順を説明します。特に、このプロトコルでは、心臓組織の抗原性を保持し、興味の抗原の検出を容易にするために 10 月に組織埋め込む心を実行します。プラーク表現型の分析は、動脈硬化の進展の病態を検討し、抗動脈硬化薬の開発のための新しい薬理学的ターゲットを識別するために有効なアプローチを表します。
Introduction
動脈硬化症は、死亡率と罹患率世界1の主要な原因の一つです。それは、血管が脂質と動脈硬化性プラークの形成を決定する白血球で潜入している慢性炎症状態が特徴です。急性の心臓イベントの大半は、プラークの破裂による血栓性イベントに関連付けられます。破裂しやすいプラークは、「傷つきやすい」定義され、プロ炎症性白血球、壊死性コアと薄い線維性被膜2の高められた浸透によって特徴付けられます。最後の十年では、臨床的および実験的研究は、病気の複雑な病態を明らかにしました。いくつかの動物モデルは、アテローム性動脈硬化3の誘導に関与する分子メカニズム解明のために使用されます。現在、マウスは人間と比較してその病態における既存のいくつかの種特異的な違いにもかかわらずアテローム性動脈硬化を勉強する最も頻繁に使用される種であります。特に、コレステロールを循環主にで構成される高密度リポタンパク質 (antiatherogenic プロパティ) を持つマウス モデルで人間を主に低密度リポタンパク質 (LDL) として運ばれるコレステロールを循環しながらおそらくなぜ、野生型マウスの自発性動脈硬化4を開発しない主な理由を表します。さらに、野生型マウスが約食餌療法のコレステロール4の 50% を吸収する人間に対し一般的に食事からのコレステロールの吸収に耐性。これらの制限を克服するためにいくつかの遺伝子組み換えマウス モデルが生成されています。アポ E-欠損マウス (アポ−/−) と LDL 受容体-欠損マウス (来す−/−) が活躍しています。高脂肪高コレステロール食、アポ e−/−マウス開発プラークより多くを来す−/−マウスに比べて急速にアポ−/−マウスの使用は、この理由のため、来す−/−マウス5,6のそれよりもより広範です。アポ−/−マウスは、アテローム性動脈硬化のあらゆる段階で病変を開発し、マウスのプラクは不安定な表現型7を表示しないが、人間で観察に匹敵します。一般的に、アポ e−/−マウスは自発的にアテローム性動脈硬化を開発し、このプロセスは西部の食事療法3加速します。頚動脈、肺、大腿や腕頭動脈、大動脈のルート6のレベルでは、アテローム性動脈硬化の重症度を評価できます。特に、大動脈の根は、マウスにおける動脈硬化病変を開発する傾向が解剖学的サイトを表します。このため、この地域の動脈硬化性プラークの形成を評価する方法が一般的です。
いくつかの研究は、アルドステロン、アテローム性動脈硬化8,9,10の開発に関与しているを示しています。アポ−/−マウス動脈硬化飼料におけるアルドステロン輸液は、炎症や脂質に富むプラーク形成10を誘導する大動脈の動脈硬化病変の開発を加速します。
要約すると、アルドステロン注入、動脈硬化食事供給、アポ-/-マウスの動脈硬化病変の評価・定量化心臓組織の埋め込みを含むプロトコルについて述べる。この手順では、炎症を起こして、脂質の豊富な動脈硬化性プラークの効率的な形成を促進して、粥状動脈硬化の研究の貴重なモデルを表します。
Protocol
Representative Results
Discussion
動脈硬化は、マクロファージ、T リンパ球、血管内皮細胞、平滑筋細胞1など、複数のセル型の間の相互作用を含む大型と中型の血管に関連する慢性炎症性疾患です。マウスの動脈硬化モデルの制限にもかかわらずアテローム性動脈硬化の過程に関する証拠の大きいボディがあり。これらのモデルには、特定の年齢や性別の実験的コホートを急速に生成する利点があります。?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、イタリア保健省 (Ricerca グラーヴェ、GR-2009-1594563、司会に PE-2011-02347070) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
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