Summary
在这里, 我们提出一个协议, 制造一个肾脏皮层胞外基质衍生的水凝胶保留原生肾脏细胞外基质 (ECM) 结构和生化成分。介绍了制造工艺及其应用。最后, 讨论了利用该水凝胶支持肾脏特异细胞和组织再生和生物工程的观点。
Abstract
细胞外基质 (ECM) 提供重要的生物物理和生化线索, 以维持组织稳态。目前的合成水凝胶为体外细胞培养提供了强有力的机械支撑, 但缺乏必要的蛋白质和配体成分, 从而引起细胞的生理行为。本手稿描述了一种肾脏皮质 ECM 衍生的水凝胶的制备方法, 具有适当的机械鲁棒性和辅助生化成分。水凝胶是由机械均匀化和增溶脱细胞人肾皮质 ECM 制备而成。基质保留了原生肾皮质 ECM 蛋白比值, 同时也使凝胶化对生理机械刚度。水凝胶作为基质, 可在生理条件下维持肾脏皮层衍生细胞。此外 , 水凝胶的组成可以纵 , 以建立一个病态的环境 , 使未来的肾脏疾病的研究。
Introduction
细胞外基质 (ECM) 提供重要的生物物理和生化线索, 以维持组织稳态。复杂的分子组成调节组织的结构和功能性质。结构蛋白为细胞提供了空间意识, 并允许粘附和迁移1。束缚配体与细胞表面受体相互作用以控制细胞行为2。肾脏 ECM 含有大量的分子, 其组成和结构根据解剖位置、发育阶段和疾病状态3,4而变化。综述的复杂性是研究肾源性细胞体外的一个关键方面。
以往复制 ECM 微环境的尝试都专注于 decellularizing 整个组织, 以创建能够 recellularization 的支架。去细胞已使用化学洗涤剂, 如烷基硫酸钠 (SDS) 或非离子洗涤剂进行, 它利用整个器官灌注或浸泡和搅拌方法5,6,7 ,8,9,10,11,12,13。这里提供的支架保存在本组织 ECM 中发现的结构和生化线索;此外, 与捐助者特定细胞的 recellularization 在重建手术中具有临床意义14、15、16、17、18、 19. 然而, 这些脚手架缺乏结构灵活性, 因此与用于体外研究的许多现有设备不相容。为了克服这一局限性, 许多集团已进一步处理脱细胞 ECM 到水凝胶20,21,22,23,24。这些水凝胶与注射成型和 bioink 兼容, 可绕过脱细胞支架放置在细胞上的微米尺度空间约束。此外, 在原生 ECM 中发现的分子组成和比值保持3,25。在这里, 我们演示了一种制备从肾脏皮层 ECM (kECM) 的水凝胶的方法。
本议定书的目的是产生一个水凝胶, 复制肾脏皮质区的微环境。肾皮质组织在 1% SDS 溶液中脱细胞, 在恒定搅动下去除细胞物质。SDS 通常用于 decellularize 组织, 因为它能够快速去除免疫细胞材料6,7,9,26。然后 kECM 的机械均质化和冻干5、6、9、11、26。在强酸与胃蛋白酶的增溶导致最终的水凝胶库存溶液20,27。对结构支持和信号传导非常重要的原生 kECM 蛋白保留3、25。水凝胶也可以在原生人肾皮质28、29、30的一级范围内胶体。该基质提供了一种生理环境, 用于维持肾脏特定细胞的平静与其他基质蛋白的水凝胶相比。此外 , 矩阵组合物可以纵 , 例如 , 通过添加胶原 I , 模型疾病环境的研究肾脏纤维化和其他肾脏疾病31,32。
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Protocol
在器官采购组织协会制定的道德准则的指导下, 贝洛奥里藏特西北隔离了人类肾脏。本议定书遵循华盛顿大学所概述的动物保育和细胞培养指南。
1. 人体肾脏组织的制备
- 去细胞溶液的制备
- 消毒5000毫升烧杯和 70 x 10 毫米搅拌棒。
- 混合 1:1000 (重量: 体积) 烷基硫酸钠 (SDS) 在蒸压去离子水在烧杯中。将溶液放在搅拌板上, 大约 200 rpm, 24 h 或直到 SDS 完全溶解。
注意: 通常, 2500 毫升 1% SDS 溶液足以 decellularize 单个人肾脏。 - 将溶液转移至500毫升无菌真空过滤器, 并将其过滤成灭菌密封容器。
- 肾脏组织的处理
- 清洗和高压灭菌一对镊子, 两个止血钳, 一副一般服务级剪刀, 两个手术刀刀柄, 一个1000毫升的烧杯覆盖铝箔, 和一个 36 x 9 毫米搅拌棒。
- 与垫的组织培养罩线。将烧杯、无菌组织培养皿 (150 x 25 毫米) 和整个肾脏器官放入遮光罩。用500毫升 1% SDS 溶液填充烧杯。
注意: 人类肾脏是从贝洛奥里藏特西北的冰上得到的。 - 将肾脏放在无菌组织培养皿中 (图 1A)。用手术刀在肾囊周围轻轻剃须去除所有肾周脂肪 (图 1B)。
- 用手术刀做一个浅8-10 厘米的切口, 只要深到足以打破肾囊, 而不损害基础皮层组织, 在肾脏的上级端。用两个止血夹将其从皮质组织剥离出来, 取出肾囊 (图 1C)。
- 通过在肾脏的侧边使用手术刀 (图 1D) 沿冠状平面一分为二肾脏。使用手术刀 (图 1E) 将骨髓区域与解剖刀分开, 将皮层组织分离开来, 并将皮质组织切成0.5 厘米3片 (图 1F)。取出任何大型可见容器。
- 细胞外基质的分离
- 在组织培养罩中, 用500毫升的 1% SDS 溶液填充1000毫升烧杯。将皮质切片组织和搅拌棒放入含有 SDS 溶液的烧杯中。用蒸压铝箔盖住烧杯, 将其放在搅拌板上, 在组织培养罩外约 400 rpm。
- 皮层组织在搅拌板上24小时后, 将烧杯带入组织培养罩, 并添加一个40µm 无菌细胞过滤器制成的尼龙网格。用200毫升漂白剂填充一个单独的1000毫升烧杯, 并将其放入组织培养罩中。
- 通过细胞过滤器将 SDS 溶液移出到含有漂白剂的烧杯中。移出所有 SDS 溶液, 直到只有脱细胞组织和细胞过滤器留在烧杯中。
注: 细胞过滤器应防止在溶液吸入过程中去除任何组织。 - 将细胞过滤器留在烧杯中, 用500毫升新鲜 SDS 溶液填充。用相同的铝箔盖住烧杯, 放在搅拌盘上, 速度与以前相同。
- 重复步骤 1.3. 1-1. 3.3 每24小时使用新鲜 SDS 解决方案共五天。
- 按照步骤 1.3. 1-1. 3.3 所述的技术, 每24小时用蒸压水冲洗脱细胞组织, 总共3天。
- 按照步骤 1.3. 1-1. 3.3 所述的技术, 每24小时冲洗一次细胞培养级水的脱细胞组织2天。
- 重复步骤 1.3. 1-1. 3.2。将脱细胞组织 (称为 kECM 从这一点上) 转移到一个30毫升自站立锥形管, 并填充它与细胞培养级水, 直到所有的组织被淹没。
2. 水凝胶库存溶液的制备
- 脱细胞组织的机械加工
- 在组织培养罩中, 用组织匀质机在锥形管内均匀地匀 kECM 2 分钟。
注意: 匀质 kECM 应类似于不透明的解决方案, 没有可见的 ECM。 - 将含有 kECM 的锥形管浸入液氮中, 直到管子周围的沸腾不再持续。将 kECM 存储在-4 ˚C 过夜。
- 在组织培养罩中, 用组织匀质机在锥形管内均匀地匀 kECM 2 分钟。
- 冷冻脱细胞组织的冻干
- 稍微松开锥形管帽, 以允许气体交换并将管放入干燥机中。Lyophilize kECM 三天, 或直到它类似于细白色粉末。存储在-4 ˚C。
- 凝胶的化学消解和增溶
- 热压罐一个20毫升闪烁的小瓶和盖子, 一个 15.9 x 7.9 毫米搅拌棒, 和一双细尖钳。
- 称量冻干 kECM, 计算溶解 kECM 到 3% (30 毫克/毫升) 溶液的盐酸和胃蛋白酶的体积, 其中m胃蛋白酶是胃蛋白酶的质量, m组织是质量的冻干组织和V盐酸是 0.01 N 盐酸的体积:
- 在组织培养罩, 添加猪胃胃蛋白酶, 0.01 N 盐酸, 和搅拌棒的闪烁小瓶, 并把它放在搅拌板约 500 rpm, 直到所有的胃蛋白酶溶解。将冻干 kECM 转移到闪烁小瓶, 并将溶液放在搅拌板上, 约 500 rpm, 三天。
3. 水凝胶凝胶
- 肾脏 ECM 凝胶制备
- 将 kECM 水凝胶库存溶液与 1 N 氢氧化钠、10x 培养基补充剂 (M199) 和细胞培养培养基混合, 凝胶水凝胶体。把所有的解决方案都放在冰上。
注: 最终凝胶浓度为7.5 毫克/毫升, 用于细胞培养。1毫升 kECM 凝胶是足够的细胞培养实验提出。 - 使用以下公式确定所需的有效 kECM 凝胶的体积和库存 kECM 水凝胶的体积, 其中v最终是凝胶的体积, vkECM 是 kECM 水凝胶所需的库存量,c股票 kECM 是 kECM 水凝胶的浓度, 而c最终是最终凝胶的浓度:
- 使用以下方程式确定所需中和试剂的体积, 其中v氢氧化钠是 1 N 氢氧化钠的体积, v10X 是 M199 10X 介质补充剂的体积, v1X 是细胞培养基体积:
- 在组织培养罩中, 将中和试剂 (氢氧化钠、M199 和细胞培养培养基) 移入无菌30毫升自站立锥形管中。将中和试剂溶液与 microspatula 混合。
- 使用无菌1毫升注射器将适当体积的库存 kECM 水凝胶转移到中和试剂溶液中。使用 microspatula 轻轻混合溶液, 直至获得均匀的色水凝胶溶液。
注意: 避免通过缓慢而轻柔的搅拌来引入气泡。 - 要将细胞并入 kECM 水凝胶中, 请从步骤3.1.1.3 中的中和溶液体积计算中减去10µL 细胞培养培养基 (V1X)。
- 将细胞悬浮成细胞培养培养基的10µL。使用以下公式确定要挂起的单元格数, 其中 #单元格表示要挂起的单元格数, Vfinal是创建的凝胶体积:
注: 30万细胞/毫升是 kECM 凝胶中使用的细胞浓度。 - 在 kECM 库存溶液与中和试剂溶液混合后, 将10µL 的细胞悬浮液移入最终 kECM 凝胶中。用 microspatula 搅拌溶液, 直到细胞均匀分布。
- 将细胞悬浮成细胞培养培养基的10µL。使用以下公式确定要挂起的单元格数, 其中 #单元格表示要挂起的单元格数, Vfinal是创建的凝胶体积:
- 将 kECM 水凝胶库存溶液与 1 N 氢氧化钠、10x 培养基补充剂 (M199) 和细胞培养培养基混合, 凝胶水凝胶体。把所有的解决方案都放在冰上。
- 使用1毫升注射器, 用 kECM 水凝胶填充所需的细胞培养装置。
- 在转移或电镀细胞之前, 允许凝胶在37˚C 1 小时。
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Representative Results
kECM 水凝胶为肾脏细胞培养提供了基质, 其化学成分与原生肾脏微环境相似。为了制造水凝胶, 肾脏皮层组织与整个肾脏器官和切块 (图 1) 机械隔离。去细胞使用化学洗涤剂 (图 2A1-3), 然后用水冲洗去除洗涤剂颗粒 (图 2A. 4-6) 产生孤立的肾脏皮质 ECM。组织学评估证实了典型的基底层状蛋白, 如胶原 IV 和层黏蛋白和结构蛋白, 如胶原蛋白-I 保留, 与 vitronectin 作为唯一注意到的例外 (图 2B)。此外, 在 ecm 中, 蛋白质组成 (包括亚型的保存) 与原生肾脏 ecm 中的观察值保持一致 (图 3)。ECM (图 4A) 是机械匀浆和冻干 (图 4B), 然后溶解生产最终 kECM 水凝胶 (图 4C)。kECM 水凝胶出现不透明的少量可见组织和不像传统的胶原 i 水凝胶粘性。在浓度为15毫克/毫升的凝胶 kECM 的流变测量显示了在应变值的线性范围内大约 800 Pa 的复杂弹性模量 (动态弹性模量), 显著大于7.5 毫克/毫升胶原蛋白 i (p = 1.602E-14)。人肾 peritubular 微血管内皮细胞 (HKMECs) 在胶原 i、kECM 和1:1 混合凝胶上的培养显示出表型差异, 特别是在细胞表面和结点周围的 CD31 表达 (图 5)。HKMECs 胶原蛋白培养-I 显示均匀 CD31 表达, 而 HKMECs 培养的两个凝胶含有 kECM 显示减少 CD31 表达不均匀分布。矩阵类型似乎不影响 HKMECs 中的高 PV1 和低 VWF 表达式。
图 1: 肾脏皮层组织的分离.整个肾脏器官的机械加工, 将皮层组织隔离为 kECM 水凝胶的基材。机械隔离始于 (A) 去除肾周脂肪组织。大块的脂肪组织可以从肾脏撕裂止血钳。剩余的脂肪组织可以通过在一个角度对肾脏胶囊运行手术刀来去除。(B) 通过在肾脏的上级端进行浅切口, (C) 将肾脏胶囊从底层组织剥离到止血夹, 最好切除肾囊。(D) 沿冠状轴平分肾脏, 使皮层和髓质区域可视化。(E) 通过用手术刀雕刻髓质组织, 最好是对皮层组织进行分离。皮质区域的颜色明显比骨髓区域深, 可用于区分两个解剖不同的组织。皮质组织的最终处理包括 (F) 将组织切成0.5 厘米3片, 以帮助后续去细胞。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 皮层组织的去细胞.脱细胞组织的视觉和组织学特征。(1) 在 1% SDS 溶液中浸入皮层组织, 导致细胞裂解和细胞材料的去除。(a. 2) 1 小时和 (a. 3) 24 小时后, 组织开始失去颜色, 表明细胞物质正在被移除。通过 (A. 4) 120 h 组织被漂白, 只有 ECM 保持。用水冲洗 (a. 5) 24 小时和 (6) 120 h 显示组织没有明显的变化。(B) 未经治疗和脱细胞皮层组织的免疫荧光染色揭示了细胞物质的完全清除和主要结构蛋白的保存 (胶原 iv = iv. 层粘连蛋白 = 林; 纤维连接蛋白 = FN; 肝素硫酸蛋白多糖= HSPG;和 vitronectin = VN)。比例 = 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 脱细胞组织的质谱.脱细胞皮层组织的质谱分析测定 ECM 蛋白组成。所有比率以质量百分比度量。(A) 与基底板相关的结构和其他蛋白质存在于胶原 IV 和-我是最具代表性的。(B. 1) 胶原 IV A1 和 A2 链, 无处不在的所有基底膜, 被保存。同时还检测了胶原 IV A3 和 A5 链, 仅存在于肾小球的基底膜中。(b. 2) laminins 的常见亚型和 (b. 3) 胶原蛋白-我也被检测到。这一数字转载于许可12。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: kECM 水凝胶的制备.脱细胞皮层组织的机械和化学处理产生一个可行的 kECM 水凝胶具有足够的机械性能与中和试剂凝胶后。(A) 脱细胞皮层组织与组织均质机进行机械匀质, 直到没有可见的 ECM 残留。(B) 在冻干3天后产生粗粉。(C) 在盐酸中增溶和在闪烁小瓶中使用胃蛋白酶进行化学消化, 导致 kECM 水凝胶可行。水凝胶不透明, 粘度低。(D) kECM 水凝胶与中和试剂凝胶后的物理表征。采用 30 mm 直径平行板系统进行流变实验。样品边缘采用矿物油保护, 加载平台设置为37˚C。在测试前, kECM 水凝胶被允许在1小时凝胶体。用0.01 至20% 之间的应变扫描测量了凝胶的粘弹性特性。三个样品的 kECM 和胶原蛋白-我被测试 (n = 3)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 5: 细胞生长表征.不同基质上生长的 HKMECs 形态学差异的表征。水凝胶与中和试剂混合, 在开放式硅油模具中设置为37˚C 45 分钟。HKMECs 被播种在凝胶的表面上, 保存在培养基上72小时, 然后被固定和染色。HKMECs 培养的免疫荧光图像 (A 和 D) 7.5 毫克/毫升胶原蛋白 I 凝胶;(B 和 E) 7.5 毫克/毫升 kECM 凝胶;和 (C 和 F) 7.5 毫克/毫升1:1 混合物凝胶。(C): 红色 = CD31;绿色 = VWF;蓝色 = 原子核;刻度条 = 50 µm (d-f): 红色 = f-肌动蛋白;绿色 = PV1;蓝色 = 原子核;缩放栏 = 50 µm。这一数字转载于许可12。请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
矩阵提供了控制细胞行为的重要机械和化学线索。合成水凝胶能够支持复杂的3维图形, 但未能提供生理基质微环境中发现的各种细胞外线索。源自原生 ECM 的水凝胶是体内和体外研究的理想材料。以前的研究使用脱细胞 ECM 水凝胶涂层合成生物材料, 以防止宿主免疫反应33,34, 区分干细胞35,36,37,38、作为2D 和软光刻细胞培养的基质39、40、41、42, 并在制备 bioinks 的3维印刷43,44,45,46. ECM 水凝胶为细胞提供适当的信号, 以启动附着力和控制进一步增殖和分化2,47。
ECM 的主要成分的比例和组成, 如胶原、laminins、弹性蛋白、纤维连接蛋白和氨基多糖, 高度依赖于组织的解剖位置和功能48,49, 50。很好地确定, 使用非特异性或外来 ECM 衍生的水凝胶将引起不正确的反应从细胞21,51,52,53,54。在肾脏中, ECM 组合物在解剖位置1、2之间有很大差异。因此, 在制备水凝胶进行实验使用之前, 区分皮层、髓质或乳乳等区域非常重要。
这里制造的 kECM 基质保留了去细胞后的原生肾皮质 ECM 蛋白比值, 同时也使凝胶化与生理上相关的机械刚度3、25、28、 29,30。血清白蛋白, 血浆蛋白, 检测在脱细胞皮层组织中的微量量, 可能由于结合肝素, 逃脱去细胞和冲洗55,56。尽管胃蛋白酶是一种非原生化学物质, 用于肾脏皮质 ECM, 但在股票 kECM 溶液中存在, 它只占最终胶体产品的 2.5% (w/v)。此外, 通过添加中和试剂溶液57, 胃蛋白酶成为停用。
kECM 水凝胶作为基质, 可在生理条件下维持肾脏皮层特异细胞。我们证明这个矩阵可以支持平面表面的 HKMEC 增长。这些 HKMECs 保持一个静止的生理状态, 通过功能测定, 表型表达和基因表达58确定。相比之下, 这些细胞成为激活时, 胶原蛋白 I, 与肾脏纤维化相关的基质成分, 被添加到 kECM 水凝胶在1:1 比59。相比之下, 当人脐静脉内皮细胞被培养在胶原蛋白 i, 它们是静止的, 当与 kECM 混合时, 它们成为激活12。因此, 胶原蛋白 I 被称为在脐带内基底膜组成的一个组成部分, 并在病理状态下减少, 如子痫前期38,60。这些结果突出了提供细胞组织特定的线索, 以保持平静的重要性, 以及如何操纵 ECM 环境可以影响稳态。
虽然所述程序中的所有步骤都很重要, 但在确保所制造的水凝胶的可行性方面, 有几个步骤至关重要。脱细胞皮层组织的均匀化程度将根据所使用的技术或设备而有所不同。重要的是要找到一种技术, 将最好的均匀组织。在增溶过程中, pH 值应保持在 3-4, 以确保胃蛋白酶活性。在将水凝胶与中和试剂混合时, 必须彻底混合凝胶, 而不引入气泡。如果一个均匀的混合物很难获得, 检查凝胶溶液的 pH 值, 以确保它是中性的。
该方法的代表性结果表明, 如何能实现肾细胞体外研究的生理相关基质。脱细胞肾脏皮质 ecm 提供了一个理想的基础材料, 以支持肾源细胞生长, 因为 ECM 蛋白比是保守的最终水凝胶产品3,25。胶体产品还可以实现生理上相关的机械性能28,29,30。kECM 水凝胶允许适当的细胞基质相互作用, 并显示出从肾脏细胞比胶原蛋白更大的生理行为, 当在平面表面培养。此外, 凝胶可在凝胶前与肾脏特异细胞一起播种, 以模拟更符合生理相关的3维环境。kECM 水凝胶的组成也可以很容易地操作。例如, 在凝胶之前, 将水凝胶与不同数量的胶原蛋白混合, 可以产生模拟肾脏纤维化31、32的累进状态的基质。这种 ecm 衍生的水凝胶的可调性, 以模拟已知的病态 ECM 成分, 值得进一步调查, 并将使未来的肾脏疾病研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望在干细胞与再生医学研究所和西北贝洛奥里藏特的加维成像实验室获得认可。他们还要承认国家卫生补助金研究所、UH2/UH3 TR000504 (h·) 和 DP2DK102258 (Y.Z.)、NIH T32 培训补助金 DK0007467 (R.J.N.) 的财政支助, 以及西北肾脏中心不受限制的礼物。肾脏研究所。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
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