Summary
Här beskriver vi ett protokoll för generering av katjoniska nanoliposomes, som bygger på metoden torr-film och kan användas för säker och effektiv leverans av in vitro- transkriberas budbärar-RNA.
Abstract
Utvecklingen av budbärar-RNA (mRNA)-baserade läkemedel för behandling av olika sjukdomar blir viktigare på grund av positiva egenskaperna för in vitro- transkriberas (IVT) mRNA. Med hjälp av IVT mRNA, kan de novo syntesen av en önskad protein induceras utan att ändra det fysiologiska tillståndet av målcellen. Dessutom kan proteinbiosynthesisen kontrolleras just på grund av den övergående effekten IVT mRNA.
För den effektiva transfection celler, kan nanoliposomes (NLps) representera en säker och effektiv leveransfordon för terapeutiska mRNA. Denna studie beskriver ett protokoll för att generera säkra och effektiva katjoniska NLps bestående av DC-kolesterol och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (knark) som en leverans vektor för IVT mRNA. NLps med en definierad storlek, en homogen fördelning och en hög komplexering kapacitet, och kan produceras med hjälp av metoden torr-film. Dessutom presenterar vi olika testsystem för att analysera deras komplexering och transfection efficacies använder syntetiska enhanced grönt fluorescerande protein (andra) mRNA, liksom deras effekt på cellernas viabilitet. Sammantaget ger presenterade protokollet en effektiv och säker metod för mRNA komplexering, vilket kan främja och förbättra förvaltningen av terapeutiska mRNA.
Introduction
Användning av modifierade mRNA för terapeutiska tillämpningar har visat stor potential i de senaste två åren. I hjärt-, inflammatoriska och monogenetic sjukdomar, liksom utveckla vacciner, är mRNA en lovande terapeutisk agent1.
Protein ersättningsbehandling med mRNA erbjuder flera fördelar jämfört med den klassiska genterapi, som är baserat på DNA transfection in i målet cellerna2. Funktionen mRNA initierar direkt i cytosolen. Även om plasmiden DNA (pDNA), en konstruktion av dubbelsträngat, cirkulär kan DNA som innehåller en promotor regionen och en gensekvens som kodning av terapeutiska protein3, även handlingar i cytosolen, det bara införlivas i celler som genomgår Mitos vid tidpunkten för transfection. Detta minskar antalet transfekterade celler vävnad1,4. Specifikt är transfection av vävnader med svag Mitos aktivitet, till exempel hjärtats celler, svår5. I motsats till pDNA förekommer den transfection och översättning av mRNA i mitotiska och icke-mitotiska celler i vävnad1,6. Viral integrering av DNA i värd genomet kan komma med mutagena effekter eller immuna reaktioner7,8, men efter transfection av celler med en protein-encoding mRNA, de novo syntesen av proteinet önskad börjar självständigt9,10. Proteinsyntesen kan dessutom justeras exakt till patientens behov genom individuella doser, utan stör genomet och riskera mutagena effekter11. Immun-aktiverande potential av syntetiskt genererade mRNA kan sänkas dramatiskt med hjälp av pseudo uridin och 5'-methylcytidine istället för uridin och cytidin12. Pseudo uridin modifierade mRNA har också visat sig ha en ökad biologisk stabilitet och en betydligt högre translationell kapacitet13.
För att kunna dra nytta av de lovande egenskaperna av mRNA-baserad terapi i kliniska tillämpningar, är det viktigt att skapa ett lämpligt fordon för transport av mRNA in i cellen. Detta fordon bör bära icke-toxiska egenskaper in vitro- och in-vivo, skydda mRNA mot nuclease-nedbrytning och ge tillräcklig cellernas upptag för en långvarig tillgänglighet och översättning av mRNA14.
Bland alla möjliga bärare typer för i vivo drogen leverans, såsom kolnanorör, kvantprickar och liposomer, den senare har studerat de15,16. Liposomer är blåsor bestående av en lipid lipidens10. De är amfifila med en hydrofob och en hydrofil avsnitt, och genom egen arrangemanget av dessa molekyler, är en sfärisk dubbla lager bildas17. Inuti liposomer, kan terapeutiska medel eller läkemedel vara inkapslade och således skyddas från enzymatisk nedbrytning18. Liposomer innehållande N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium klorid (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propan] (DOTAP)20, och dioctadecylamidoglycylspermine (hundar)21, eller DC-kolesterol22, är väl karakteriserade och ofta används för cellulära transfection med DNA eller RNA.
Katjoniska liposomer består av en positivt laddad lipid och en oladdad fosfolipid23. Transfection via katjoniska liposomer är en av de vanligaste metoderna för transport av nukleinsyror in celler24,25. Katjoniska lipid partiklarna bildar komplex med de negativt laddade fosfatgrupper i ryggraden i nukleinsyra molekyler26. Dessa så kallade lipoplexes fäster på ytan av cellmembranet och in i cellen via endocytos eller endocytos-liknande-mekanismer27.
I 1989, Malone et al. framgångsrikt beskrivs katjoniska lipid-medierad mRNA transfection28. Dock fann använder en blandning av DOTMA och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (knark), gruppen att DOTMA manifesterade cytotoxiska effekter28. Zohra et al. visade dessutom att DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-trimetylammoniumformiat-propan klorid) kan användas som en mRNA transfection reagens29. Dock för den effektiva transfection celler, bör DOTAP användas i kombination med andra reagens, såsom Fibronektin29 eller knark30. Hittills, var DOTMA den första katjoniska lipid på marknaden används för gen leverans31. Andra lipider används som terapeutiska bärare eller har testats i olika stadier av kliniska prövningar (t.ex. EndoTAG-I, innehållande DOTAP som lipid bärare), undersöks för närvarande i en fas-II klinisk prövning32.
Detta arbete beskriver ett protokoll för generering av NLps innehållande DC-kolesterol och knark. Denna metod är enkel att utföra och tillåter generering av NLps olika storlekar. Det generella målet för NLp generation med torr-film-metoden är att skapa liposomer för mRNA komplexering, vilket möjliggör effektiv och biokompatibla cell transfection in vitro-14,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generering av katjoniska Nanoliposomes (figur 1)
- Lös lipider DC-kolesterol (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] kolesterol hydroklorid) och knark (dioleoyl fosfatidyletanolamin), levereras som ett pulver, i kloroform att uppnå en slutlig koncentration av 25 mg/mL.
Obs: Förvara de upplösta lipider vid-20 ° C. - Arbeta med 25 mg/mL stamlösning av både lipider. Mix 40 µL av den upplösta DC-kolesterolhalt och 80 µL av den upplöst knark i en glas-kolv.
Obs: Det totala lipid beloppet är 3 mg. För att undvika snabb avdunstning i kloroform, placera lipider på isen under pipettering. - Förångas kloroform i 15 min under en argon gasflöde. Därefter fylla Exsickator med kiselgel, placera öppen glas kolven inuti och tillämpa ett vakuum över natten för att se till att de återstående kloroform indunstas och en lipid film bildas inuti glas kolven.
Obs: Arbeta snabbt och Undvik onödiga O2 kontakt. - Rehydrera bildade lipid filmen med 1 mL nuclease-gratis vatten och vortex suspensionen för 15 min (figur 2A). Efteråt, placera suspensionen i en ultraljudsbehandling bad för 1 h (figur 2B).
Obs: Fjädringen blir lätt grumlig. - Montera mini extrudern enligt tillverkarens instruktioner, fyller en spruta med lipid fjädring och placera den fyllda sprutan och en tom spruta på båda sidor av extruder. Tryck på lipid suspensionen genom membranet från en spruta till den andra, 20 x – 25 x, att pressa upphängningen (figur 2 c).
Obs: Storleken på NLps bestäms av porstorlek av membranet används. - Lagra NLps i en glas kolv vid 4 ° C tills vidare användning.
Obs: Efter långvarig lagringstid, NLps bör placeras i ultraljudsbehandling badet igen för 15 min av 35 kHz att kringgå komplexa bildande.
2. in Vitro transkription av syntetiska mRNA
- Förbereda andra-kodning mRNA efter protokollet publicerats tidigare34.
- Förstärka den andra sekvensen från plasmiden med 0,7 µM av framåt (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') och bakåt (5'-T120 CTT CTT lag CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') primers och polymerasen kit med PCR.
- Blanda 20 µL av en kommersiell buffertlösning som ändrar beteendet smältande av DNA (Tabell för material), samt 20 µL av 5 x mixen från polymeras kit. Tillsätt 7 µL av varje (framåt och bakåt) primer.
- Lägg till 25 ng av andra plasmiden till blandningen och 2 µL av polymeras från polymeras kit.
Obs: Håll polymerasen på is före pipettering det till lösningen. - Lägg till nuclease-fri H2O till blandningen, upp till en volym av 100 µL.
- Köra PCR cykler i den termocyklern efter protokollet i tabell 1.
- Rena andra-encoding DNA-sekvensen med PCR rening kit.
- Därför blanda PCR-lösningen med 500 µL av bindande buffert från kit och använda den för att fylla rening kolumner.
- Centrifugera kolumnerna med maximal hastighet för 1 min och släng filtratet.
- Tillsätt 750 µL tvättlösning I till kolumnen, Centrifugera igen vid maximal hastighet för 1 min och kassera filtratet.
- Upprepa centrifug 1 x ta bort bufferten från filtret kolumn.
- Överföra kolumnen till en fräsch 1,5 mL tub.
- Tillsätt 20 µL av nuclease-fri H2O till kolumnen, inkubera i 1 min och Centrifugera i 1 min med maximal hastighet. Upprepa detta steg.
- Mätning av koncentrationen av DNA med en fotometer och lagra den på-20 ° C.
- Utföra DNA kvalitet analyser med hjälp av gelelektrofores. Tillsätt 0,5 g agaros i Tris-Borat-EDTA (TBE) buffert och Värm upp i mikrovågsugn på hög värme tills Agarens är helt upplöst.
- Tillsätt 5 µL gel-färgning lösning till den flytande agarosen, fylla lösningen in i gel-kammaren och vänta tills gelen är polymeriseras.
- Blanda 200 ng DNA med 2 µL av 6 x laddar färgämne och fylla den upp till en slutet volym av 12 µL. Pipettera en DNA-stege, samt DNA-provet, i gel brunnar och köra elektrofores för 1 h vid 100 V.
- Analysera gelen med en gel-analysera station under UV-ljus.
- Kör in vitro- transkriptionen för att generera mRNA från DNA-sekvensen med en in vitro- transkription kit innehållande T7-polymeras och ersätta de modifierade nukleotiderna UTP och CTP med Ψ-UTP och metyl-CTP.
- För in vitro- transkription, blanda ingredienserna efter tabell 2.
Obs: Byt ut 1,5 µL av metyl-CTP med 1:10 Cy3-CTP utspätt i nuclease-fri H2O under in vitro- transkriptionen av andra mRNA att uppnå Cy3-märkning av mRNA. - Inkubera IVT reaktion mixen i 4 timmar vid 37 ° C.
- Tillsätt 1 µL av DNAS jag från T7 polymerasen kit och inkubera det 15 min av 37 ° C att smälta den DNA-mallen.
- För in vitro- transkription, blanda ingredienserna efter tabell 2.
- För att rena mRNA, använda RNA clean-up kit.
- Fylla upp IVT mixen till volymen av 100 µL med nuclease-fri H2O.
- Lägga till 350 μl lyseringsbuffert och blanda genom pipettering upp och ner.
- Tillsätt 250 µL av 100% etanol och blanda igen. Pipettera blandningen i kolumnerna rensning.
- Centrifug för 15 s vid 8 000 x g och kassera filtratet.
- Tillsätt 500 µL av tvätt bufferten i en kolumn, Centrifugera igen för 15 s vid 8 000 x goch ta bort filtratet.
- Tvätta kolonnen 1 x med 500 µL tvättlösning och Centrifugera i 2 min vid 8000 x g.
- Flytta kolumnen till en fräsch 1,5 mL reaktionsröret. Eluera mRNA 2 x genom en 1-minuters inkubation av 20 µL av nuclease-fri H2O på kolumnen membranet, följt av en 1-min centrifugering med maximal hastighet.
- Ta bort fosfatgrupper från mRNA använder ett Defosforylering kit. Lägga till 4,5 µL 10 x fosfatas buffert och 1 µL av fosfatas i mRNA och inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
- Rena mRNA igen, följande steg 2.5.1 - 2.5.7.
- Mät den mRNA samordningen med en fotometer.
- Använda gelelektrofores för att analysera renhet och storleken på mRNA. Därför förbereda en agarosgel enligt beskrivningen i steg 2.3.9 - 2.3.10.
- Blanda 3.3 µL av formamid, 1 µL 37% formaldehyd, 1 µL 10 x män och 1.7 µL av 6 x laddar färgämne med 200 ng mRNA och fylla den upp till 10 µL med nuclease-fri H2O för varje prov och RNA markör.
- Inkubera mixen i 10 min vid 65 ° C i mRNA denaturering. Fyll brunnarna av gelen med mRNA och RNA markör och kör gelen för 1 h vid 100 V.
- Analysera gelen med en gel doc station med UV-ljus.
3. komplexering av syntetiska mRNA
- Tina den syntetiska mRNA på is, vortex den och centrifugera kort innan du öppnar tuben.
- Blanda 10 µL av syntetiska mRNA (mRNA koncentration är 100 ng/µL) med 1 µL, 2,5 µL, 5 µL, 10 µL eller 20 µL av NLp suspension (NLp koncentration är 3 mg/mL). Centrifugera kort och inkubera i 20 min i rumstemperatur (RT) i nanolipoplex formation.
Obs: Blanda inte genom pipettering. Detta kan leda till förlust av volym. Virvel strax för en omsorgsfull blandning. - Tillsätt 1 mL av regelbunden cell medium till nanolipoplexes och blanda dem genom pipettering upp och ner.
4. analys av inkapsling effektiviteten av Nanoliposomes
- För att utföra inkapsling experimenten, använda RNA kvantifiering kit.
- Förbereda arbetslösning genom att späda ut den fluorescerande färg 1: 200 för en hög räckvidd och 1:2,000 för en lägsta analys.
Obs: Tina den fluorescerande färgen på is. Förbereda den fungerande lösningen direkt före användning. - Förbereda hög räckvidd och lägsta standard kurvorna med 1 mL av en 2 µg/mL stamlösning av andra mRNA i nuclease-fri H2O.
Obs: För standard kurvorna, använda mRNA som kommer att användas i inkapsling experiment. - Använd tabell 3 för beredning av hög räckvidd standard (20 ng/mL - 1 µg/mL).
- För den lägsta standarden, späd den 2 µg/mL andra mRNA stamlösning 1:20 för att uppnå en slutlig koncentration på 100 ng/mL. Förbereda en lägsta standard (1 ng/mL - 50 ng/mL) som beskrivs i tabell 4.
- Kombinera 1 µg av andra mRNA (10 µL) och 7,5 µg NLps (2,5 µL) och inkubera i 20 min på RT.
Obs: Håll mRNA på is för att undvika nedbrytning. - Tillsätt 1 mL nuclease-fri H2O form nanolipoplexes och mix av pipettering upp och ner.
- Tillsätt 1 mL av 1: 200 eller 1:2,000 RNA fluorescerande färgämne fungerande lösning till inkapslade prover och standarder och inkubera i 5 min på RT i mörkret.
- Pipettera de standarder och prover i dubbletter i en svart plattan med 96 brunnar och mäta fluorescensen på 530 nm på en microplate reader (figur 3).
5. beredning av cellerna för Transfection
- Plattan 1,5 x 105 A549 celler per brunn 12-well platta 1 d före transfection.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 i regelbunden cell medium (DMEM/hög glukos med 10% fetalt bovint serum [FBS], 2 mM L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin) i 24 h innan transfection.
6. transfection celler
- Tvätta det beredda celler 1 x med 1 mL per brunn PBS (utan Ca2 +/Mg2 +).
- Tillsätt 1 mL beredd nanolipoplex blandning, innehållande 1 µg av andra mRNA inkapslade i 1-µL, 2.5-µL, 5-µL, 10-µL eller 20-µL NLps, till en brunn av beredda plattan med A549 celler.
- Tillsätt nanolipoplex suspensionen till cellerna och inkubera vid vanliga villkor för 24 h att analysera transfection effekt eller för 24 h och 72 h att analysera cellviabiliteten efter transfection.
Obs: Transfection med NLps kräver inte en medellång förändring.
7. analys av Cell Transfection effekt med hjälp av flödescytometri och fluorescensmikroskopi
- Avlägsna supernatanten och tvätta cellerna med 1 mL/väl PBS (utan Ca2 +/Mg2 +) ta bort den återstående NLps.
- Förbereda cellerna för flödescytometri.
- Trypsinize cellerna med 500 µL per brunn trypsin/EDTA (0,05%) vid 37 ° C i 3 min. stoppa processen och inaktivera trypsin genom att lägga till samma mängd (500 µL per brunn) regelbundna FBS-innehållande medium.
- Centrifugera cellerna för 5 min vid 400 x g och ta försiktigt bort supernatanten utan att vidröra cellpelleten.
- Tvätta cellerna med 1 mL PBS (utan Ca2 +/Mg2 +).
- Att resuspendera cellerna i 300 µL 1 x fixering lösning och överföra cellerna in flödet flödescytometri rören.
- Analysera cellerna på 488 nm i en flödescytometer (figur 4A).
Obs: Vortex cellerna 1 x direkt innan du mäter.
- Förbereda cellerna för fluorescensmikroskopi.
- Fixa cellerna med 1 mL per brunn 100% metanol, som tidigare var förvaras vid-20 ° C.
- Tillsätt 500 µL per brunn 300 nM DAPI (4, 6-diamidin-2-fenylindol) löses i PBS (utan Ca2 +/Mg2 +) och inkubera i 5 min i mörker.
- Ta bort DAPI lösningen och tvätta cellerna igen med 100% metanol förvaras vid-20 ° C.
- Analysera cellerna med fluorescens Mikroskop (figur 4B).
Obs: Använd följande excitation/utsläpp våglängder: andra 488/509 nm, DAPI 358/461 nm och Cy3 550/570 nm.
8. cell livskraft Assay
- Lös 5 mg MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) i 1 mL RPMI (utan fenolrött).
Observera: Den upplösta MTT skall ytterligare utspädd 1:10 (slutlig koncentration: 0,5 mg/mL) i RPMI före användning. - Tvätta de transfekterade cellerna 3 x med 1 mL per brunn PBS (utan Ca2 +/Mg2).
Obs: Resterna av regelbunden cell medium bör tas bort helt. - Tillsätt 500 µL per brunn 1:10 utspädd MTT lösning till cellerna och inkubera i 4 timmar vid 37 ° C.
- Ta bort MTT lösningen från cellerna efter inkubation och tillsätt 500 µL per brunn DMSO (dimetyl sulfoxid). Inkubera igen i 10 minuter vid 37 ° C.
- Pipettera DMSO lösningen i trillingar i en tydlig-bottenplatta med 96 brunnar och mäta adsorption vid 540 nm med en microplate reader.
- Livskraften hos obehandlade cellen på 100% och beräkna cellen livskraften i de andra grupperna i jämförelse med kontrollgrupp cellerna (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använder protokollet som beskrivs, var NLps bestående av lipider DC-kolesterol och knark förberedda med metoden torr-film (figur 1). Under förberedelsen visar nanoliposome lösningen olika skeden i grumlighet (figur 2).
Inkapsling effekten av NLps kan sedan analyseras efter inkapsling av 1 µg andra-encoding mRNA genom att analysera gratis mängden mRNA, som inte var inkapslade, med hjälp av RNA kvantifiering kit (figur 3).
Efter inkapsling av andra mRNA i olika mängder NLps, den bildade nanolipoplexes kan inkuberas med celler kan in vitro- och andelen andra-uttryckande celler analyseras med hjälp av flödet flödescytometri 24 h posttransfection (figur 4A) . Även 1 µL av nanoliposome lösningen är tillräckligt för att uppnå en hög transfection av celler in vitro. När cellerna är transfekterade med NLps innehållande Cy3-märkt andra mRNA, förekomsten av den andra mRNA i cytoplasman (röd fluorescens), liksom det redan producerade andra proteinet (grön fluorescens) kan visualiseras (figur 4B).
Eftersom transfection av celler med hjälp av nanolipoplexes kan ha negativa effekter på celler, livskraften hos cellerna testades 24 h (figur 5A) och 72 h (figur 5B) posttransfection. Inga effekter på cellernas viabilitet kunde upptäckas när cellerna behandlades med 2,5 eller 5 µL NLps eller nanolipoplexes, respektive.
Figur 1: Schematisk översikt över tillverkningsprocessen för katjoniska nanoliposomes. Först, de upplösta lipider DC-kolesterol och knark ska blandas ihop i en glas-kolv. Andra synliga kloroform vätskan ska förångas under argon eller kväve gasflödet och kloroform resterna bör tillåtas avdunsta under natten i vakuum. Tredje, bildade lipid filmen på botten av glas kolven skall vara rehydrerad med nuclease-fri H2O, följt av vortexa att bilda multilamellar liposomer. Genom ultraljudsbehandling och extrudering av Liposom lösningen, den färdiga att använda unilamellar NLps produceras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: nanoliposome lösningen i olika skeden under tillverkningen. (A) denna siffra visar Liposom lösningen direkt efter rehydrering av lipid filmen och vortexa för 15 min, samt (B) efter 1 h i en ultraljudsbehandling bad (C) följt av 25 cykler av extrudering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: inkapsling effekten av nanoliposomes. I denna panel visas kvantifiering av gratis andra mRNA efter inkapsling i NLps. Resultaten presenteras som betyder ± SEM (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Transfection effekten av nanolipoplexes. (A) denna panel visar bestämning av förhållandet bästa mRNA/nanoliposome för transfection använder olika mängder NLps att kapsla in 1 µg av andra mRNA 24 h posttransfection. (B) i denna panel visas detektion av Cy3-märkt syntetiska mRNA inkapslade i 2,5 µL NLps och det andra uttrycket i de celler 24 h posttransfection (skalstapeln = 50 µm). Resultaten presenteras som betyder ± SEM (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: cellviabilitet efter transfection med nanoliposomes och inkapslade mRNA. I denna panel visas mätning av cellernas viabilitet använder en MTT assay (A) 24 h och (B), 72 h posttransfection. Resultaten presenteras som betyder ± SEM (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Steg | Temperatur i ° C | Varaktighet |
| 1 | 95 | 5 min |
| 2 | 94 | 15 s |
| 3 | 55 | 1 min |
| 4 | 72 | 1 min |
| 5 | Gå till 2 30 x | |
| 6 | 72 | 10 min |
| 7 | 4 | Håll |
Tabell 1: PCR cykel protokoll för DNA förstärkning.
| Koncentration | Belopp | |
| ATP | 7,5 mM | 4 ΜL |
| GTP | 1 875 mM | 1 ΜL |
| 5'-Methylcytidin | 7,5 mM | 3 ΜL |
| Ψ | 7,5 mM | 3 ΜL |
| ARCA | 2,5 mM | 10 ΜL |
| DNA-mall | 1,5 µg | |
| Buffert mix | 1 x | 4 ΜL |
| T7 enzym mix | 4ΜL | |
| RNase-hämmare | 1 ΜL | |
| Nuclease-gratis vatten | Fyll upp till 40 µL | |
Tabell 2: Mix för den in vitro- transkription av DNA till mRNA.
| Volymen av nuclease-fri H2O (µL) | Volym av andra mRNA hög räckvidd stamlösning (µL) | Volym 1: 200 fluorescerande färgämne (µL) | Slutlig koncentration (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 1000 |
| 50 | 50 | 100 | 500 |
| 90 | 10 | 100 | 100 |
| 98 | 2 | 100 | 20 |
| 100 | 0 | 100 | tomt |
Tabell 3: Protokoll för en hög räckvidd standardkurva.
| Volymen av nuclease-fri H2O (µL) | Volym av andra mRNA lägsta stamlösning (µL) | Volym 1: 2000 fluorescerande färgämne (µL) | Slutlig koncentration (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 50 |
| 50 | 50 | 100 | 25 |
| 90 | 10 | 100 | 5 |
| 98 | 2 | 100 | 1 |
| 100 | 0 | 100 | tomt |
Tabell 4: Protokoll för en lägsta standardkurva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Presenterade protokollet beskriver generationen NLps med hög inkapsling effekt för syntetiskt modifierade mRNA, liksom den pålitliga transfection av celler in vitro. Dessutom garanterar NLps frisläppandet av mRNA, som i sin tur översätts till ett funktionellt protein inne i cellerna. Dessutom de transfections som använder NLps kan utföras i regelbunden cell medium, vilket resulterar i hög cell förmåga under transfection, och pågå upp till tre dagar efter transfection.
För att använda mRNA som en terapeutisk, är självmonterande system för dess leverans Rekommenderad. De vanligaste transfection reagenserna innehåller katjoniska lipider, inklusive liposomer. Som liposomer är positivt laddade, kan negativt laddade nucleic syror vara inkapslade i dem, vilket gör att den elektrostatisk repulsion av cellmembran ska övervinna35. De katjoniska lipid DC-kolesterol har redan beskrivits i tidigare studier som en stabil och biokompatibla fordonet36. Tillägg av den neutrala lipid DOPE leder till en förbättrad transfection effekt37. Med tanke på fördelarna som beskrivs ovan, dessa lipider valdes för beredning av NLps. Tidigare studier har dessutom visat att användningen av dessa två lipider är att föredra framför andra på grund av en ökad cellulär transfection takt med negativt laddade nukleinsyror38.
För framgångsrik generation NLps och nanolipoplexes är det viktigt att ägna extra uppmärksamhet åt några av stegen. Tillvägagångssättet av nanoliposome generation bör utföras under O2-gratis villkor. Förekomsten av O2 under den NLp generationen kan leda till nedbrytning av fosfolipider och minskad reproducerbarhet39. Dessutom, trots ändringar, mRNA är mycket känslig när det gäller nedbrytning genom nukleaser. För rehydrering av lipid filmen rekommenderas användning av RNase-fri H2O starkt därför att förhindra mRNA nedbrytning under komplexering. RNase-fria villkor bör dessutom säkerställas för lagring av nanolipoplexes.
Dessutom kan NLps bilda aggregat över tiden på grund av instabil termodynamiska systemet. Inflytande parametrarna inkluderar lagringstemperatur och ytladdning av liposomer40. NLp aggregation kan resultera i en destabilisering av Liposom membranet och risken för oönskade mRNA släppa41, leder till dålig transfection effekt och mRNA nedbrytning i det extracellulära utrymmet. Dock som tidigare visat, nanolipoplexes kan lagras vid 4 ° C i upp till sex månader utan aggregering eller förlust av transfection effekt35.
Genom att använda liposomer som drog bärare system, kan två av de centrala problemen av drogen leverans lösas. Liposomer skydda inkapslade drogen från nedbrytning och kan passivt målvävnader som har en diskontinuerlig endotel, såsom lever- eller benmärgen16. För leverans av terapeutiska nukleinsyror, parametrar såsom partikelstorlek och inkapsling kapacitet är avgörande för utvärdering och cellulära upptaget av liposomalt fordon. Särskilt, storleken på liposomer i nanometerskalan tillåter en interaktion med cellmembranet42 och är därmed viktigt för den in-vivo användningen senare. Först, liposomer bör vara tillräckligt liten för att undvika clearance genom njur- och leverfunktion system43. För det andra, Liposom storlek bör bidra till att övervinna blodkärlen barriär för att rikta cellerna i önskad orgeln. Det rapporterades att liposomer i storleksintervallet 100-300 nm kunde effektivt transfect hepatocyter44; dock stora liposomer (t.ex.400 nm) inte kunde övervinna den endoteliala barriär45.
Även om den beskrivna metoden har fastställts för mRNA leverans, kan den också genomföras för andra nukleinsyra therapeutics, såsom mikroRNA. I en färsk studie visat vi att mikroRNA 126 kan riktas selektivt och därför utvecklingen av bukaortaaneurysm kunde vara effektivt hindrade46. Eftersom DNA/RNA therapeutics kan orsaka biverkningar, såsom trombocytaktivering, när de kommer i direkt kontakt med celler, kan förpackningar i liposomer undvika detta, vilket gör det ytterligare fördelaktiga47. Därför, den metod som presenteras här är mycket mångsidig och kan användas för att utforma drogen leverans för många sjukdomar. Etablerade protokollet tillåter inte bara snabb och kostnadseffektiv generering av en effektiv mRNA bärare med en definierad storlek men erbjuder också möjligheten att anpassa lipid formuleringen enligt behoven i ett visst program: (1) storleken på den liposomer kan enkelt ändras genom att ändra filtren; (2) ytan av positivt laddade liposomer kan ändras, till exempel med, polyetylenglykol, för att öka stabilitet och dröjsmål blod clearance under in-vivo -ansökan-48. Bindningen av specifika antikroppar mot liposomer tillåter riktade leveransen av de inkapslade drog49. Med vidare undersökning och en mer detaljerad inblick i de fysiska egenskaperna, kan protokollet fortfarande förbättras.
För generering av liposomer, det finns tre vanliga metoder: torr-filmen, etanol injektionen och omvänd-fas avdunstningen. I den Yang et al. studie, dessa tre tillverkningsteknik var jämfört35. Det konstaterades att liposomer med en definierad storlek och en jämn fördelning i lösningen kan genereras med hjälp av metoden torr-film. Dessutom torr-film förfarandet genomfördes i denna studie resulterade i produktionen av NLps med en definierad storlek 200 nm, en homogen fördelning och en hög inkapsling kapacitet.
Å ena sidan, den positiva laddningen av liposomer leder till en ökad inkapsling kapacitet och bättre cell surface fusion50,51,52, men å andra sidan, det kan destabilisera cellmembranet och aktivera olika immunsystemets aktivering vägar och cell död27,53. Dock kan apoptotiska egenskaperna för katjoniska lipider minimeras genom att använda den helper lipid DOPE54,55. I studien av Zhang et al.konstaterades det att förhållandet 1:2 DC-kolesterol och knark under Liposom generation leder till den mest effektiva cellulära transfection använder nukleinsyror38. I metoden genomförs i den aktuella studien användes lipid förhållandet 1:2 DC-kolesterol och knark i blandade lipid avstängning under lipid film beredning och beredda liposomer ledde till höga transfection effekt och, samtidigt, hög cell lönsamhet. Liknande resultat hittades också av andra forskare, till exempel Ciani56 och Cecilias37.
Sammantaget har liposomer använts i åratal i kliniska prövningar visar utmärkt biokompatibilitet och låg toxicitet i vivo. I kombination med mRNA, kunde NLps användas för effektiv leverans av mRNA till celler eller organ in vitro- och in-vivo, för att framkalla de novo syntesen av en önskad protein. När det gäller terapeutiska tillämpningar, skulle nanolipoplexes kunna användas, exempelvis i såret läka fläckar för transdermal mRNA leverans57 att aktivera cellförnyelsen, eller som en spray för nebulisering av mRNA58 för att bota lungcancer sjukdomar59,60 såsom cystisk fibros.
Presenterade protokollet garanterar ett enkelt och lättillgängligt sätt för generering av NLps metoden torr-film, som sedan kan användas för effektiv inkapsling av in vitro- transkriberat mRNA och den säkra transfection av celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
| 4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
| BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
| Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
| Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
| Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
| RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
| Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
| Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
| peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |
References
- Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
- Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
- Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
- Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
- Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8 (2014).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
- Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
- Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
- Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
- Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
- Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
- Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
- Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
- Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
- Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
- Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
- Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
- Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
- Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
- Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497 (2011).
- Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
- Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943 (2014).
- Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
- Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
- Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
- Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
- Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
- Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
- Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
- Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H.
- Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
- Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
- Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
- Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
- Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
- Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
- Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
- Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
- Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
- Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
- Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
- Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
- Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
- Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504 (2015).
- Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
