Summary
Aquí se describe un protocolo para la generación de nanoliposomas catiónicos, que se basan en el método de película seca y pueden ser utilizado para la caja fuerte y una entrega eficiente de in vitro transcribe ARN mensajero.
Abstract
El desarrollo de RNA mensajero (mRNA)-base terapéutica para el tratamiento de diversas enfermedades, se convierte cada vez más importante debido a la positiva propiedades de in vitro transcripción mRNA (IVT). Con la ayuda de mRNA IVT, puede inducirse la síntesis de novo de una proteína deseada sin necesidad de cambiar el estado fisiológico de la célula diana. Por otra parte, biosíntesis de la proteína pueden ser precisamente controlada debido al efecto transitorio del mRNA IVT.
Para la transfección eficiente de células, nanoliposomas (NLps) pueden representar un vehículo de entrega segura y eficiente para el mRNA terapéutico. Este estudio describe un protocolo para generar seguro y eficiente catiónico NLps compuesto de colesterol DC y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga) como un vector de la entrega para IVT mRNA. NLps tener definido el tamaño, una distribución homogénea y una capacidad de complejación alta y puede ser producidos utilizando el método de película seca. Por otra parte, presentamos sistemas de prueba diferentes para analizar la complejación y eficacias de transfección con sintético mejorado proteína verde fluorescente (eGFP) mRNA, así como su efecto en la viabilidad celular. En general, el protocolo presentado proporciona un acercamiento eficaz y seguro para la complejación de mRNA, que puede avanzar y mejorar la administración de terapéutica mRNA.
Introduction
El uso de ARNm modificado para aplicaciones terapéuticas ha mostrado gran potencial en los últimos años. En enfermedades cardiovasculares, inflamatorias y monogenéticos, así como en el desarrollo de vacunas, el mRNA es un prometedor agente terapéutico1.
Terapia de reemplazo de la proteína con el mRNA ofrece varias ventajas sobre la terapia del gene clásico, basado en la transfección de la DNA en las células de destino2. La función de mRNA se inicia directamente en el citosol. Aunque el plásmido ADN (pDNA), una construcción de doble cadena, circular ADN que contiene una región promotora y una secuencia del gen que codifican la proteína terapéutica3, también actúa en el citosol, puede sólo ser incorporado en células que van a través de la mitosis en el momento de la transfección. Esto reduce el número de células transfected en el tejido1,4. Específicamente, la transfección de los tejidos con actividad de mitosis débiles, tales como células cardíacas, es difícil5. En contraste con pDNA, la transfección y traducción de mRNA ocurren en las células mitotic y no mitótica del tejido1,6. La integración viral de la DNA en el genoma del anfitrión puede venir con efectos mutagénicos o reacciones inmunes7,8, pero después de la transfección de células con una codificación de la proteína ARNm, la síntesis de novo de la proteína deseada inicia autónomamente9,10. Por otra parte, la síntesis de proteínas puede ajustarse precisamente a la necesidad del paciente a través de dosis individuales, sin interferir en el genoma y correr el riesgo de efectos mutagénicos11. El potencial de activación inmune de mRNA sintético generado podría reducirse drásticamente mediante pseudo uridina y 5'-methylcytidine en lugar de uridina y citidina12. Pseudo uridina mRNA modificada también se ha demostrado tener una mayor estabilidad biológica y una significativamente mayor capacidad traslacional13.
Para poder beneficiarse de las prometedoras propiedades de tratamiento basado en el mRNA en aplicaciones clínicas, es esencial para crear un vehículo adecuado para el transporte de ARNm en la célula. Este vehículo debe tener propiedades no tóxico en vitro e in vivo, proteger el mRNA contra degradación nucleasas y proporcionar suficiente absorción celular para una prolongada disponibilidad y traducción de los mRNA de14.
Entre todos los tipos de portador posible para en vivo entrega de la droga, tales como nanotubos de carbono puntos cuánticos y liposomas, estos últimos han sido estudiados más de15,16. Liposomas son vesículas que consiste en una bicapa de lípidos10. Son anfifílicas con una hidrofóbica y una hidrofílica sección, y a través de la propia disposición de estas moléculas, una doble capa esférica es formado17. Dentro de los liposomas, agentes terapéuticos o medicamentos pueden ser encapsulados y, así, protegidos de la degradación enzimática18. Liposomas que contienen N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium cloruro (DOTMA)19, [1, 2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propano] (DOTAP)20y21de dioctadecylamidoglycylspermine (perros), o DC-colesterol22, están bien caracterizadas y utilizado con frecuencia para transfección celular con ADN o ARN.
Liposomas catiónicos comprenden un lípido positivamente cargado y un fosfolípido23. Través de catiónicos liposomas de transfección es uno de los métodos más comunes para el transporte de los ácidos nucleicos en células24,25. Las partículas de lípidos catiónicos forman complejos con los grupos fosfato cargados negativamente en la columna vertebral de las moléculas de ácido nucleico26. Estos supuestos lipoplexes fije a la superficie de la membrana celular y entrar en la célula mediante endocitosis o mecanismos de endocitosis como27.
En 1989, Malone et al. con éxito se describe catiónico mediada por lípidos mRNA transfección28. Sin embargo, usando una mezcla de DOTMA y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga), el grupo encontró que DOTMA manifiesta efectos citotóxicos28. Además, Zohra et al demostró que DOTAP (cloruro de 1, 2-dioleoyloxy-3-trimetilamonio-propano) puede utilizarse como un mRNA de la transfección reactivos29. Sin embargo, para la transfección eficiente de células, DOTAP debe utilizarse en combinación con otros reactivos, tales como fibronectina29 o30de la droga. Hasta ahora, DOTMA era el lípido catiónico primero en el mercado para el gen entrega31. Otros lípidos son utilizados como portadores de la terapéuticos o se están probando en diferentes etapas de ensayos clínicos (p. ej., EndoTAG-I, que contiene DOTAP como portador lípido), actualmente está siendo investigada en un ensayo clínico de fase II32.
Este trabajo describe un protocolo para la generación de NLps que contiene colesterol DC y la droga. Este método es fácil de realizar y permite la generación de NLps de diferentes tamaños. El objetivo general de generación de PNL mediante el método de película seca es crear liposomas para la complejación de mRNA, así permitiendo la transfección eficiente y biocompatibles de la célula en vitro14,33.
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Protocol
1. generación de nanoliposomas catiónico (figura 1)
- Disolver los lípidos colesterol DC (3β-[-(N′,N′-dimethylaminoethane) de N-Carbamoil] colesterol clorhidrato) y DOPE (dioleoyl fosfatidiletanolamina), entregado en forma de polvo, en cloroformo para obtener una concentración final de 25 mg/mL.
Nota: Almacenar los lípidos disueltos a-20 ° C. - Trabajar con 25 mg/mL de solución stock de ambos lípidos. Mix 40 μl de la DC-colesterol disuelto y 80 μl de la droga disuelta en un frasco de vidrio.
Nota: La cantidad total de lípidos es de 3 mg. Para evitar la evaporación rápida del cloroformo, coloque los lípidos en hielo durante el pipeteo. - Evaporar el cloroformo durante 15 min bajo un flujo de gas argón. Posteriormente, llene un desecador con gel de silicona, coloque el frasco de cristal abierto dentro y aplicar un vacío durante la noche para asegurarse de que se evapora el cloroformo restante, y una película lipídica está formada dentro del frasco de vidrio.
Nota: Trabajo rápido y evitar el contacto innecesario de2 O. - Rehidratar la película lipídica formada con 1 mL de agua libre de nucleasas y agitar la suspensión durante 15 min (figura 2A). Después, coloque la suspensión en un baño de sonicación durante 1 hora (figura 2B).
Nota: La suspensión estará ligeramente nublada. - Montar el mini extrusora según las instrucciones del fabricante, llene una jeringa con la suspensión de lípidos y coloque la jeringa llena y una jeringuilla vacía en ambos lados de la extrusora. Presione la suspensión lipídica a través de la membrana de una jeringa a la otra, 20 x, 25 x, para sacar la suspensión (figura 2).
Nota: El tamaño de la NLps es determinado por el tamaño de los poros de la membrana utilizada. - Almacenar el NLps en un frasco de vidrio a 4 ° C hasta su uso posterior.
Nota: Después de tiempo de almacenamiento prolongado, la NLps debe colocarse en el baño de sonicación nuevamente durante 15 minutos por 35 kHz para evitar la formación de complejos.
2. in Vitro de la transcripción de mRNA sintético
- Preparar la codificación eGFP ARNm siguiendo el protocolo publicado anterior34.
- Amplificar la secuencia de eGFP desde el plásmido con el μm 0.7 del forward (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') y reversa (5'-T120 CTT CTT ley CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') kit de cartillas y la polimerasa con PCR.
- Mezclar 20 μl de solución amortiguadora comercial que cambia el comportamiento de fusión del DNA (Tabla de materiales), así como de 20 μl de la mezcla 5 x desde el kit de la polimerasa. Añadir 7 μl de cada cebador (adelante y atrás).
- Agregue 25 ng de plásmido eGFP a la mezcla y 2 μl de polimerasa del kit de la polimerasa.
Nota: Mantenga la polimerasa en el hielo antes de pipetear la solución. - Añadir libre de nucleasa H2O a la mezcla, hasta un volumen de 100 μl.
- Ejecute los ciclos PCR en termociclador siguiendo el protocolo en la tabla 1.
- Purificar la secuencia de ADN de codificación eGFP con el kit de purificación de la polimerización en cadena.
- Por lo tanto, mezclar la solución PCR con 500 μl de tampón de unión del kit y utilizarlo para rellenar columnas de purificación.
- Centrifugue las columnas a la máxima velocidad durante 1 min y descartar el filtrado.
- Añadir 750 μl de tampón de lavado I de la columna, centrifugar nuevamente a la máxima velocidad durante 1 min y descartar el filtrado.
- Repita el paso de centrífuga 1 x para quitar el tampón desde el filtro de la columna.
- Transfiera la columna a un tubo de 1,5 mL fresco.
- Añadir 20 μl de H libre de nucleasa2O a la columna, incubar durante 1 minuto y centrifugar durante 1 min a velocidad máxima. Repita este paso.
- Medir la concentración de la DNA con un fotómetro y almacenar a-20 ° C.
- Realizar los análisis de calidad de ADN mediante electroforesis en gel. Añadir 0,5 g de agarosa en buffer borato-Tris-EDTA (TBE) y calentarlo en el microondas a fuego alto hasta que la agarosa se disuelva completamente.
- Añadir 5 μl de solución de tinción de gel de la agarosa líquida, llenar la solución en la cámara de gel y esperar hasta que el gel se polimeriza.
- Mezcla 200 ng de ADN con 2 μl de 6 x tinte y llenar hasta un volumen final de 12 μl. Pipetear una escalera de ADN, así como la muestra de ADN en los pocillos del gel y correr la electroforesis durante 1 h a 100 V de carga.
- Analizar el gel utilizando una estación de análisis de gel bajo luz UV.
- Ejecutar la transcripción en vitro para generar ARNm de la secuencia de ADN con un kit de transcripción en vitro contiene polimerasa T7 y sustituir los nucleótidos modificados de UTP y CTP con Ψ-UTP y CTP de metilo.
- Para la transcripción en vitro , mezclar los ingredientes siguiendo la tabla 2.
Nota: Reemplazar 1.5 μl de metil-CTP con 1:10 Cy3-CTP diluida en libre de nucleasa H2O durante la transcripción en vitro de eGFP mRNA para lograr Cy3-etiquetado del mRNA. - Incubar la mezcla de reacción de IVT de 4 h a 37 ° C.
- Añadir 1 μl de DNasa I de la polimerasa T7 kit e incubar durante 15 min por 37 ° C para digerir la plantilla de la DNA.
- Para la transcripción en vitro , mezclar los ingredientes siguiendo la tabla 2.
- Para purificar el mRNA, utilice el kit de limpieza de RNA.
- Llenar la mezcla IVT al volumen de 100 μl con libre de nucleasa H2O.
- Añadir 350 μl de tampón de lisis y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
- Añadir 250 μl de etanol al 100% y mezclar otra vez. Pipetear la mezcla en las columnas de limpieza.
- Centrifugar durante 15 s en 8.000 x g y descartar el filtrado.
- Añadir 500 μl del buffer de lavado en una columna, centrifugar nuevamente por 15 s en 8.000 x gy eliminar el filtrado.
- Lavar la columna 1 x con 500 μl de tampón de lavado y centrifugar durante 2 min a 8.000 x g.
- Mover la columna en un tubo de reacción de 1,5 mL fresco. Procederá a la elución del mRNA 2 x por una incubación de 1-min de 20 μl de H libre de nucleasa2O en la membrana de la columna, seguido de una centrifugación de 1 min a velocidad máxima.
- Retire los grupos fosfato de los mRNA usando un kit de desfosforilación. Agregar 4.5 μl de tampón de fosfatasa de x 10 y 1 μl de la fosfatasa en el mRNA e incubar durante 1 h a 37 ° C.
- Purificar el ARNm una vez más, siguiendo los pasos 2.5.1 - 2.5.7.
- Medir la concertación de mRNA con un fotómetro.
- Utilizar gel de electroforesis para analizar la pureza y el tamaño del mRNA. Por lo tanto, preparar un gel de agarosa como se describe en pasos 2.3.9 - 2.3.10.
- 3.3 mezcla μl de formamida, 1 μl de formaldehído al 37%, 1 μl de 10 x hombres y 1,7 μl de 6 x carga tinta 200 ng de mRNA y llénela hasta 10 μl de H libre de nucleasa2O para cada muestra y marcador de RNA.
- Incubar la mezcla por 10 min a 65 ° C para la desnaturalización del mRNA. Los pozos del gel con el mRNA y RNA marcador de cargar y ejecutar el gel durante 1 h a 100 V.
- Analizar el gel utilizando una estación de doc de gel con luz UV.
3. complejación del mRNA sintético
- Descongelar el mRNA sintético en hielo, vortex y centrifugar poco antes de abrir el tubo.
- Mezclar 10 μl de mRNA sintético (concentración de mRNA es 100 ng/μL) con 1 μl, 2.5 μl, 5 μl, 10 μl y 20 μl de la suspensión de PNL (NLp concentración es 3 mg/mL). Centrifugar brevemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente (RT) para la formación de nanolipoplex.
Nota: No mezclar mediante pipeteo. Esto puede conducir a la pérdida de volumen. Vórtice poco para una mezcla completa. - Añadir 1 mL de medio celular regular a los nanolipoplexes y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
4. Análisis de la eficiencia de encapsulación de nanoliposomas
- Para realizar los experimentos de encapsulación, utilice el kit de cuantificación de RNA.
- Preparar la solución de trabajo diluyendo el colorante fluorescente 1: 200 para una gama alta y 1:2,000 para un ensayo de gama baja.
Nota: Descongelar el tinte fluorescente en el hielo. Preparar la solución de trabajo directamente antes de su uso. - Preparar las curvas estándar de gama alta y gama baja con 1 mL de una solución stock de 2 μg/mL de eGFP mRNA en libre de nucleasa H2O.
Nota: Para las curvas estándar, utilice el mRNA que se utilizarán en los experimentos de encapsulación. - Utilice la tabla 3 para la preparación del estándar de gama alta (20 ng/mL - 1 μg/mL).
- Para el estándar de gama baja, diluir la eGFP de 2 μg/mL mRNA solución madre 1:20 para lograr una concentración final de 100 ng/mL. Preparar un estándar de gama baja (1 ng/mL - 50 ng/mL) como se describe en la tabla 4.
- Combinar 1 μg de eGFP mRNA (10 μl) y 7,5 μg de NLps (2,5 μl) e incubar por 20 min a TA.
Nota: Mantenga el mRNA en el hielo para evitar la degradación. - Añadir 1 mL de H libre de nucleasa2O nanolipoplexes forma y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
- Añadir 1 mL de solución de trabajo de colorante fluorescente de RNA de 1: 200 o 1:2,000 a los estándares y las muestras encapsuladas e incubar 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Pipetear los estándares y las muestras por duplicado en una placa de 96 pocillos negra y medir la fluorescencia a 530 nm en un lector de microplacas (figura 3).
5. preparación de las células para transfección
- Placa 1.5 x 105 células A549/pozo de una placa de 12 pozos 1 d antes de transfección.
- Incube las células a 37 ° C y 5% de CO2 en medio regular de la célula (glucosa alta DMEM con 10% suero fetal bovino [SBF], 2 mM L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina) durante 24 h antes de transfección.
6. transfección de las células
- Lavar el preparado células 1 x con 1 mL/pocillo de PBS (sin Ca2 +Mg2 +).
- Añadir 1 mL de la mezcla de preparados nanolipoplex, que contenga 1 μg de eGFP que mRNA encapsulado en 1 μl, 2.5 μl, 5 μl, 10 μl o NLps 20 μl, en un pocillo de la placa preparada con células A549.
- Añadir la suspensión de nanolipoplex a las células e incubar en condiciones regulares de 24 horas para analizar la eficacia de transfección, o 24 h y 72 h para analizar la viabilidad de las células después de transfección.
Nota: Transfección con NLps no requiere un cambio de medio.
7. Análisis de la eficacia de transfección celular mediante citometría de flujo y microscopía de fluorescencia
- Quite el sobrenadante y lavar las células con 1 mL/bien PBS (sin Ca2 +/Mg2 +) para quitar el restante NLps.
- Preparar las células para citometría de flujo.
- Trypsinize las células con 500 μL/pocillo tripsina/EDTA (0,05%) a 37 ° C por 3 min parada del proceso y desactivar la tripsina añadiendo la misma cantidad (500 μL/pocillo) de medio regular que contiene FBS.
- Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g y retire con cuidado el sobrenadante sin tocar el precipitado de células.
- Lavar las células con 1 mL de PBS (sin Ca2 +Mg2 +).
- Resuspender las células en 300 μL de solución de fijación x 1 y las células de transferencia en tubos de citómetro de flujo.
- Analizar las células en 488 nm en un citómetro de flujo (Figura 4A).
Nota: Vórtice las células 1 x directamente antes de medir.
- Preparar las células para la microscopía de fluorescencia.
- Fijar las células con 1 mL/pozo 100% metanol, que previamente se almacenó a-20 ° C.
- Añadir 500 μL/pocillo 300 nM DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole) disuelta en PBS (sin Ca2 +/Mg2 +) e incubar por 5 min en la oscuridad.
- Retirar la solución DAPI y lave las células otra vez con 100% metanol almacenado a-20 ° C.
- Analizar las células utilizando un microscopio de fluorescencia (Figura 4B).
Nota: Use las siguientes longitudes de onda de excitación/emisión: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461 nm y Cy3 550/570 nm.
8. ensayo de viabilidad celular
- Disolver 5 mg de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) en 1 mL de RPMI (sin rojo de fenol).
Nota: El MTT disuelta debe ser más diluida 1:10 (concentración final: 0.5 mg/mL) en RPMI antes de su uso. - Lavar las células transfected 3 x con 1 mL/pozo PBS (sin Ca2 +/Mg2).
Nota: Los restos del medio celular regular deben retirarse completamente. - Añadir 500 μL/pocillo de 1:10 diluido solución MTT a las células e incubar durante 4 h a 37 ° C.
- Retirar la solución MTT de las células después de la incubación y agregar 500 μL/pocillo de DMSO (dimetil sulfóxido). Otra vez incubar 10 min a 37 ° C.
- Pipetear la solución de DMSO en tríos en una placa de 96 pocillos de fondo claro y medir la absorción a 540 nm utilizando un lector de microplacas.
- Establecer la viabilidad de la célula no tratada en el 100% y calcular la viabilidad de las células de los otros grupos en comparación con las células control sin tratar (figura 5).
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Representative Results
Utilizando el protocolo como se describe, NLps consisten en los lípidos colesterol DC y la droga fueron preparados utilizando el método de película seca (figura 1). Durante la preparación, la solución nanoliposoma muestra diferentes etapas en turbidez (figura 2).
La eficacia de la encapsulación de la NLps luego puede ser analizada después de la encapsulación de 1 μg de mRNA codificación eGFP mediante el análisis de la cantidad libre de mRNA, que no estaba encapsulado, utilizando el kit de cuantificación de RNA (figura 3).
Después de la encapsulación de eGFP que mRNA en diferentes cantidades de NLps, nanolipoplexes formado puede incubarse con células in vitro y el porcentaje de células expresaban eGFP pueden analizarse mediante posttransfection de 24 h de citometría de flujo (Figura 4A) . Incluso 1 μl de la solución nanoliposoma es suficiente para lograr una alto de la transfección de las células in vitro. Cuando las células son transfectadas con NLps con eGFP marcado con Cy3 mRNA, la presencia de la eGFP mRNA en el citoplasma (fluorescencia roja), así como la proteína eGFP ya producido (fluorescencia verde) puede ser visualizado (Figura 4B).
Ya que la transfección de células mediante nanolipoplexes puede tener efectos adversos sobre las células, la viabilidad de las células fue probada 24 h (figura 5A) y a posttransfection de 72 h (figura 5B). No se pudo detectar ningún efecto sobre la viabilidad celular cuando las células fueron tratadas con 2,5 o 5 μl de NLps o nanolipoplexes, respectivamente.
Figura 1: Descripción esquemática del proceso de fabricación de nanoliposomas catiónicos. En primer lugar, los lípidos disueltos DC-colesterol y la droga deben ser mezclados en un frasco de vidrio. En segundo lugar, el líquido cloroformo visible debe ser evaporado bajo argón o nitrógeno gas flujo y las sobras de cloroformo se debe evaporar durante la noche en el vacío. En tercer lugar, la película de lípidos formados en la parte inferior de la botella de vidrio debe ser rehidratada con H libre de nucleasa2O, seguido con un vórtex para formar liposomas multilamellar. A través de la sonicación y extrusión de la solución liposomada, se producen las propiedades de lista-para-usar NLps. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: la solución nanoliposoma en diferentes etapas durante la fabricación. (A) esta figura se muestra la solución liposomada directamente después de la rehidratación de la película lipídica y de Vortex por 15 min, así como (B) después de 1 h en un baño de ultrasonidos (C) del baño seguida de 25 ciclos de extrusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: eficacia de la encapsulación de los nanoliposomas. Este panel muestra la cuantificación de eGFP gratis mRNA después de la encapsulación en NLps. Los resultados se presentan como medios ± SEM (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: eficacia de la transfección de la nanolipoplexes. (A) este panel muestra la determinación de la mejor relación de mRNA/nanoliposoma para transfección usando diferentes cantidades de NLps encapsular 1 μg de posttransfection de 24 h de mRNA de eGFP. (B) este panel muestra la detección de mRNA sintético marcado con Cy3 encapsulado en 2,5 μl NLps y la expresión de eGFP en lo posttransfection de 24 h de las células (la barra de escala = 50 μm). Los resultados se presentan como medios ± SEM (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: viabilidad celular después de la transfección con nanoliposomas y encapsulado mRNA. Este panel muestra la medición de la viabilidad celular mediante un ensayo MTT (A) 24 h y posttransfection (B) 72 h. Los resultados se presentan como medios ± SEM (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Paso | Temperatura en ° C | Duración |
| 1 | 95 | 5 min |
| 2 | 94 | 15 s |
| 3 | 55 | 1 min |
| 4 | 72 | 1 min |
| 5 | Ir a 2 30 x | |
| 6 | 72 | 10 min |
| 7 | 4 | Mantenga |
Tabla 1: Ciclo de PCR protocolo de amplificación de DNA.
| Concentración | Cantidad | |
| ATP | 7,5 mM | 4 ΜL |
| GTP | 1.875 mM | 1 ΜL |
| 5'-Methylcytidin | 7,5 mM | 3 ΜL |
| Ψ | 7,5 mM | 3 ΜL |
| ARCA | 2,5 mM | 10 ΜL |
| Plantilla de la DNA | 1,5 μg | |
| Mezcla de tampón | 1 x | 4 ΜL |
| Mezcla de enzima T7 | 4ΜL | |
| Inhibidor de Rnasa | 1 ΜL | |
| Agua libre de nucleasas | llenar hasta 40 μl | |
Tabla 2: La mezcla para el en vitro transcripción del ADN a ARNm.
| Volumen libre de nucleasa h2O (μL) | Volumen de solución madre de una alta gama de mRNA eGFP (μL) | Volumen de colorante fluorescente de 1: 200 (μL) | Final concentración (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 1000 |
| 50 | 50 | 100 | 500 |
| 90 | 10 | 100 | 100 |
| 98 | 2 | 100 | 20 |
| 100 | 0 | 100 | en blanco |
Tabla 3: Protocolo de una curva estándar de gama alta.
| Volumen libre de nucleasa h2O (μL) | Volumen de solución madre de una gama baja de mRNA eGFP (μL) | Volumen de colorante fluorescente de 1: 2000 (μL) | Final concentración (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 50 |
| 50 | 50 | 100 | 25 |
| 90 | 10 | 100 | 5 |
| 98 | 2 | 100 | 1 |
| 100 | 0 | 100 | en blanco |
Tabla 4: Protocolo de una curva estándar de rango bajo.
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Discussion
El protocolo presentado describe la generación de NLps con eficacia alta encapsulación de mRNA sintético modificado, así como la fiable transfección de células en vitro. Por otra parte, las NLps garantiza la liberación de ARNm, que a su vez, se traduce en una proteína funcional dentro de las células. Además, las transfecciones con NLps puede realizarse en medio celular regular, dando por resultado alta viabilidades de la célula durante la transfección, y durar hasta tres días después de la transfección.
Para utilizar mRNA como una terapéutica, uno mismo-montaje de sistema para su entrega es preferido. Los reactivos de transfección más comunes incluyen los lípidos catiónicos, como liposomas. Como liposomas están cargados positivamente, negativamente cargados ácidos nucleicos puede encapsulados en ellos, permitiendo así la repulsión electrostática de las membranas celulares que superar35. El lípido catiónico DC-colesterol ya se ha descrito en estudios anteriores como un vehículo estable y biocompatible36. La adición de lípidos neutros droga conduce a una eficacia de transfección mayor37. Teniendo en cuenta las ventajas que se mencionó anteriormente, estos lípidos fueron elegidos para la preparación de NLps. Además, estudios anteriores han demostrado que el uso de estos dos lípidos es preferible sobre otros debido a una tasa mayor de transfección celular con carga negativa los ácidos nucleicos38.
Para la exitosa generación de NLps y nanolipoplexes, es fundamental prestar atención extra a algunos de los pasos. El procedimiento de generación nanoliposoma debe realizarse en O2-gratuito. La presencia de O2 durante la generación de la PNL puede conducir a la degradación de los fosfolípidos y reducida reproducibilidad39. Por otra parte, a pesar de modificaciones, mRNA es muy sensible con respecto a la degradación por nucleasas. Por lo tanto, para la rehidratación de la película de lípidos, de libre de Rnasa H2O se recomienda encarecidamente el uso para evitar la degradación del mRNA durante la complejación. Además, deben garantizarse condiciones libres de Rnasa para el almacenamiento de nanolipoplexes.
Además, NLps pueden formar agregados con el tiempo debido al inestable sistema termodinámico. Los parámetros de influencia incluyen la temperatura de almacenamiento y carga de superficie de los liposomas40. Agregación de PNL puede provocar la desestabilización de la membrana de liposomas y el riesgo de indeseables mRNA liberar41, conduce a la degradación de la eficacia y mRNA de la transfección deficiente en el espacio extracelular. Sin embargo, como se ha demostrado, nanolipoplexes pueden almacenarse a 4 ° C por hasta seis meses sin agregación o pérdida de eficacia de transfección35.
Mediante el uso de liposomas como un sistema de transportador de droga, dos de los principales problemas de la administración de fármacos pueden ser resuelto. Liposomas protegen la droga encapsulada de la degradación y son capaces de pasivamente los tejidos diana que tienen un endotelio discontinuo, como el hígado o la médula ósea16. Para la entrega de los ácidos nucleicos terapéuticos, parámetros tales como tamaño de partícula y encapsulación capacidad son cruciales para la absorción celular y evaluación de vehículos liposómicos. Particularmente, el tamaño de los liposomas en la escala de nanómetros permite una interacción con la membrana de la célula42 y por lo tanto, es importante para el uso de en vivo más adelante. En primer lugar, los liposomas deben ser lo suficientemente pequeños para evitar la separación a través del sistema renal y hepático43. En segundo lugar, el tamaño de los liposomas debe ayudar a superar la barrera de los vasos sanguíneos para llegar a las células del órgano deseado. Se informó que liposomas en el rango de tamaño de 100 a 300 nm fueron capaces de transfectar eficientemente hepatocitos44; sin embargo, de gran tamaño liposomas (p. ej., 400 nm) no fueron capaces de superar la barrera endotelial45.
Aunque el método descrito se ha establecido para la entrega de mRNA, también pueden ser implementado para otros terapéutica de ácido nucleico, como microARN. En un estudio reciente, hemos demostrado que microRNA 126 puede orientarse selectivamente y, por lo tanto, el desarrollo de aneurismas de la aorta abdominales puede ser prevenido efectivamente46. Como terapéutica de ADN/ARN puede causar efectos secundarios, como la activación plaquetaria, cuando entran en contacto directo con las células, empaquetado dentro de liposomas puede evitarlo, así haciéndola más ventajosa47. Por lo tanto, el método presentado aquí es muy versátil y puede utilizarse para el diseño de administración de fármacos para muchas enfermedades. El protocolo establecido no sólo permite la generación rápida y rentable de un eficaz portador de mRNA con un tamaño definido pero también ofrece la posibilidad de personalizar la formulación lipídica según las necesidades de una aplicación en particular: (1) el tamaño de la liposomas pueden modificarse fácilmente cambiando los filtros; (2) la superficie de los liposomas cargados positivamente podría modificarse usando, por ejemplo, glicol de polietileno, para aumentar la estabilidad y demora despacho de sangre durante en vivo uso48. La Unión de los anticuerpos específicos a los liposomas permite la entrega específica de la droga encapsulada49. Con la examinación adicional y una visión más detallada de las propiedades físicas, el protocolo puede aún mejorarse.
Para la generación de liposomas, existen tres métodos comunes: la película seca, la inyección de etanol y la evaporación de la reverso-fase. En el Yang et al. estudio, fueron estas tres técnicas de fabricación en comparación con35. Se encontró que los liposomas con un tamaño definido y una distribución equitativa en la solución pueden ser generados utilizando el método de película seca. Además, el procedimiento de la película seca llevada a cabo en este estudio dio lugar a la producción de NLps con un tamaño definido de 200 nm, una distribución homogénea y una capacidad de alta encapsulación.
Por un lado, la carga positiva de los liposomas conduce a un encapsulado de mayor capacidad y mejor celular fusión superficial50,51,52, pero por otro lado, puede desestabilizar la membrana de la célula y activar vías distintas de activación inmune y celular muerte27,53. Sin embargo, las propiedades de apoptotic de lípidos catiónicos pueden minimizarse usando el ayudante lípidos droga54,55. En el estudio realizado por Zhang et al., se encontró que una proporción de 1:2 de DC-colesterol y la droga durante la generación de liposomas conduce a la transfección celular más eficiente usando ácidos nucleicos38. En el método implementado en el presente estudio, la proporción de lípidos de colesterol DC 1:2 y la droga fue utilizada en la suspensión de la mezcla lipídica durante la preparación de la película lipídica y los liposomas preparados condujeron a eficacia de transfección alta y, al mismo tiempo, alto celular viabilidad. Resultados similares fueron también encontrados por otros investigadores, como Ciani56 y Farhood37.
En general, liposomas se han utilizado durante años en los ensayos clínicos, mostrando gran biocompatibilidad y toxicidad baja en vivo. En combinación con el mRNA, NLps podría ser utilizado para la entrega eficiente de mRNA de células u órganos en vitro y en vivo, para inducir la síntesis de novo de una proteína deseada. En cuanto a aplicaciones terapéuticas, nanolipoplexes podría utilizarse, por ejemplo, en la herida curativa parches transdérmicos MARN entrega57 activar la regeneración celular, o como un spray para la nebulización de mRNA58 para la curación del pulmón enfermedades59,60 como la fibrosis quística.
El protocolo presentado garantiza una manera fácil y accesible para la generación de NLps mediante el método de película seca, que luego puede ser utilizado para la encapsulación eficiente de in vitro transcrito mRNA y el segura transfección de las células.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Ninguno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
| 4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
| BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
| Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
| Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
| Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
| RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
| Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
| Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
| peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |
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