Summary
Presenteren we een procedure voor het kweken van verschillende stammen van Magnetospirillum in twee verschillende soorten media groei. Magnetospirillum gryphiswaldense stam MSR-1 groeit zowel in vloeibare als in O2 concentratie verloop semi-vaste voedingsbodems terwijl M. magneticum stam AMB-1 en M. magnetotacticum stam MS-1 worden geteeld in vloeistof.
Abstract
Magnetotactic bacteriën zijn gram-negatieve, sporenvormende, hoofdzakelijk aquatische prokaryoten alomtegenwoordig in zoetwater- en mariene habitats. Ze worden gekenmerkt door hun vermogen om te biomineralize magnetosomes, die magnetische nanometer middelgrote kristallen van magnetiet (Fe3O4) of greigiet (Fe3S4 zijn) omgeven door een lipide dubbelgelaagde membraan, binnen hun cytoplasma. Voor de meeste bekende magnetotactic bacteriën, worden magnetosomes geassembleerd in ketens in het cytoplasma, waardoor verlenen een permanente magnetische dipoolmoment op de cellen, en waardoor ze passief uitlijnen met externe magneetvelden. Vanwege deze specifieke kenmerken hebben magnetotactic bacteriën een groot potentieel voor commerciële en medische toepassingen. Echter, de meeste soorten zijn microaerophilic en hebben specifieke O2 concentratie vereisten, waardoor ze moeilijker te groeien routinematig dan veel andere bacteriën zoals Escherichia coli. Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor het kweken van drie van de meest bestudeerde stammen van magnetotactic bacteriën, alle behorend tot het geslacht Magnetospirillum. Deze methoden toestaan voor een nauwkeurige besturing van de concentratie van O2 ter beschikking gesteld van de bacteriën, om ervoor te zorgen dat ze normaal groeien en synthetiseren van magnetosomes. Groeiende magnetotactic bacteriën voor verdere studies met behulp van deze procedures vereist geen het Vejle te worden een expert in de microbiologie. De algemene methoden gepresenteerd in dit artikel kunnen ook worden gebruikt om te isoleren en cultuur van de andere magnetotactic bacteriën, hoewel het is waarschijnlijk dat groei media chemische samenstelling zal moeten worden gewijzigd.
Introduction
Magnetotactic bacteriën (MTB) vertegenwoordigen een breed scala van gram-negatieve prokaryoten alomtegenwoordig in zoet water en mariene aquatische habitats1. Deze bacteriën delen het vermogen te produceren van magnetische kristallen gemaakt van magnetiet (Fe3O4) of greigiet (Fe3S4), die in de meeste gevallen geassembleerd in ketens in de cellen. Dit bijzondere structurele motief is te wijten aan de aanwezigheid van verschillende specifieke proteïnen die zowel in het cytoplasma van de bacteriën en op het lipide membraan dat elke crystal2 omringt. Elke individuele crystal en haar omringende membraan vesikel heet een magnetosome en is variërend in grootte van ongeveer 30 tot 50 nm in3soorten Magnetospirillum . Vanwege de rangschikking van de keten van magnetosomes bezitten deze bacteriën een permanente magnetische dipoolmoment dat maakt ze passief uitlijnen met extern toegepaste magnetische velden. Daarom deze bacteriën actief zwemmen langs de magnetische veldlijnen, handelend als zelfrijdende micro-kompassen vermoedelijk tot meer effectief de meest gunstige omstandigheden zoeken (bv., O2 concentratie) voor groei.
Een interessante eigenschap van MTB is hun vermogen om zowel de chemie en de kristallografie van hun magnetosome kristallen te regelen. De meeste stammen produceren relatief hoge zuiverheid kristallen van hetzij magnetiet hetzij greigiet, hoewel sommige biomineralize beide mineralen4. In alle gevallen kunnen de bacteriën exact bepalen de grootte en de vorm van hun één magnetische domein kristallen. Dit verklaart waarom een grote hoeveelheid onderzoek is begonnen met het ontwikkelen van een beter begrip van hoe MTB voeren dit biomineralization proces. Inzicht in dit proces mogelijk de onderzoekers te kleermaker-merk magnetisch nanokristallen voor veel commerciële en medische toepassingen.
Een aanzienlijke belemmering voor uitgebreid onderzoek op MTB is de moeilijkheid van het kweken van hen in het laboratorium. De meeste soorten, met inbegrip van de spanningen in dit werk gebruikt zijn obligately microaerophilic als volwassen met O2 als een accepteerder terminal elektron. Dit verklaart waarom deze bacteriën zijn meestal te vinden op het overgangsgebied tussen oxic en zuurstofvrije omstandigheden (de IME-zuurstofvrije interface, OAI). Dit toont duidelijk aan dat MTB hebben precieze O2 concentratie vereisten die natuurlijk moet rekening worden gehouden bij het opstellen van groei media voor deze organismen. Bovendien, de grote bestaande diversiteit aan MTB betekent dat verschillende soorten verschillende soorten chemische verlopen en voedingsstoffen om optimale groei te realiseren zal moeten.
In dit werk, beschrijven we de methoden voor de teelt van drie van de meest bestudeerde MTB: Magnetospirillum magneticum (stam AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) en M. gryphiswaldense (MSR-1). Deze soorten behoren tot de klasse van de Alphaproteobacteria in de stam van de Proteobacteria fylogenetisch, zijn spiraalvormige in morfologie en bezitten een polar flagellum aan elk uiteinde van de cel. Wij bieden de protocollen voor de groeiende stam MSR-1 in zowel vloeibare als O2 concentratie verloop semi-vaste voedingsbodems, gebaseerd op eerder gepubliceerde middellange recepten5,6. Ook presenteren we een gedetailleerd protocol voor de teelt van stammen AMB-1 en MS-1 in gewijzigde magnetische Spirillen groei Medium (MGSM)7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. installatie van de N-2 -Station
Opmerking: Kies de binnendiameter van de buis zodat het kan worden aangesloten op de gastank met minimale lekkage en zodat de cilinder van een kunststof spuit van 1 mL strak in deze buis past. Een illustratie van de volledige N2 vergassing station wordt gegeven in Figuur 1.
- Veilig installeren een N2 gastank dicht bij een bank waarop er is genoeg ruimte om in te stellen naar het station2 N (een lengte van ongeveer 50 cm).
- Verbinding maken met de tank een stukje slang lang genoeg om het gebied waar het station zal worden gebouwd te bereiken. Indien nodig, toepassing Teflon tape aan de uitgang van de tank om te voorkomen dat eventuele lekkage.
- Snijd om te bouwen een station borrelende vijf flessen van medium staat op hetzelfde moment, vier stukken buis van ongeveer 5 cm in lengte.
- Assembleren de stukken buis in een lijn met drie drie-weg T-vormig plastic hulpstukken. Sluit het ene uiteinde van deze lijn naar het stuk buis aan de uitgang van de N2 tank via een extra T-vormige montage. Het toevoegen van een 90° kniestuk passend aan de andere kant.
- Gebruik tape te koppelen van de structuur aan een horizontale metalen staaf heeft ca. 30 cm boven de Bank geplaatst.
- Verbinding maken met vijf stukken van buizen (ongeveer 20 cm in lengte) naar de gratis uitgangen van de fittingen geïnstalleerd in stap 1.4.
- Verwijder de zuigers van vijf 1,0 mL plastic spuiten en snijd van het grotere eind van deze spuiten (dwz., de tegenover kant aan de naald), houden van alleen de gegradueerde deel. Vul deze spuiten met katoen, niet te strak.
- Voeg de spuiten in de 20 cm lange verticale stukken buis en gebruik van zeepsop om ervoor te zorgen dat er geen lekkage is, wanneer N2 stroomt.
- Verwijder de doppen van vijf 25 G naalden (0.5 mm x 25 mm) en plaats van deze naalden in het 10 cm-stukken van dunne buizen. Zorg ervoor dat de naalden strak in de buis past.
Let op: Er dreigt een steekpartij tijdens deze stap. Doe het langzaam en zorgvuldig. - Bevestig de naalden in stap 1.9 willen het spuiten van het N-2 -station. Zorgen dat N2 door alle vijf lijnen stroomt en houd het station op stand-by.
2. groei middellange voorbereiding
Opmerking: Het is mogelijk om het bedrag van medium bereid, zoals uitgelegd in stap 2.1.2, 2.2.2 en 2.3.8. De hoeveelheid water en chemicaliën gebruikt gewoon behoeften worden proportioneel aangepast. De rol van alle middelgrote componenten wordt beschreven in de aanvullende tabel 1.
- Voorbereiding van vloeibare groeimedium voor MSR-1
- Bereid een 10 mM ijzer(III) citraatoplossing door 0.245 g van ijzer(III) citraat aan 100 mL gedestilleerd gedeïoniseerd water toe te voegen. Warmte en roer te ontbinden, tot een geel tot oranje duidelijke oplossing wordt verkregen. Autoclaaf de oplossing met behulp van een standaard cyclus (ten minste 15 min blootstelling bij 121 ° C) en sla deze stamoplossing bij kamertemperatuur in het donker.
Opmerking: Gooi de ijzer(III) citraatoplossing wanneer een neerslag duidelijk wordt. - In een bekerglas met 1 L gedestilleerd gedeïoniseerd water, voeg de volgende in volgorde al roerend: 1,0 mL van het trace minerale supplement oplossing 0,1 g van KH2PO4, 0.15 g van MgSO4.7 H2O, 2,38 g HEPES, 0,34 NaNO3 g , 0,1 g gist extract, 3,0 g soy bean pepton, 4.35 mL kalium lactaat (60% m/m oplossing) en 5 mL van de 10 mM Fe(III) citraat stamoplossing.
Opmerking: Pas de hoeveelheden proportioneel als een kleinere hoeveelheid groeimedium nodig is. Voor een N2 station staat van borrelende vijf flessen op hetzelfde moment, zoals in stap 1 van dit protocol, gebouwd door 300 mL medium te bereiden.
Let op: Trace minerale en Fe(III) citraat voorraad oplossingen moeten steriel worden gehouden. Om besmetting te voorkomen, gebruik standaard steriele techniek bij het gebruik daarvan (vlam open tops van flessen met behulp van een bunsenbrander) en steriele Pipetteer tips met betrekking tot aflevering. Winkel de minerale oplossing in een koelkast bij 4 ° C. - Breng de pH op 7.0 met 1 M NaOH oplossing na toevoeging van alle chemische stoffen. Afzien van het vers bereide medium tot 125 mL serum flessen. Giet 60 mL medium in elke fles.
- Bubble N2 in het medium voor 30 min de opgeloste O2te verwijderen, met behulp van de kleine buis verbonden met het N2 station beschreven in stap 1. Plaats een butyl-rubber stop op de top van elke fles, een kleine opening zodat de overtollige gas om af te sluiten van de fles te verlaten.
Let op: Schuim kan vormen terwijl borrelen met N2. De gasstroom dienovereenkomstig aanpassen om te voorkomen dat de productie van schuim. - Plooi seal elke fles met de bereid stop en een aluminium zegel. De aluminium-zegel zorgt ervoor dat de fles gesloten gedurende de rest van het protocol blijft.
- Haal de naalden en de dunne buis uit het N2 station en vervang ze met schone naalden (1 inch, ≤ 23 G). De kleppen van de N2 tank zodanig aanpassen dat een zachte constante stroom van gas de tank (ongeveer 50 mL/min verlaat).
Opmerking: Groter dan 23G permanente unsealable gaten in de stop verlaten mag van de naalden. - Voeg een van de naalden verbonden met de N2 tank in een fles van medium, door middel van de rubberstop. Onmiddellijk een andere schone naald in de dezelfde fles invoegen. Herhaal deze stap voor de andere flessen en laat N2 stroom voor ongeveer 30 min ter vervanging van de lucht in de flessen door N2.
- Één fles verbreken door de N-2 -station door het verwijderen van de bijbehorende naald. Wacht enkele seconden totdat de druk in de fles van medium tot luchtdruk afneemt en verwijder de tweede naald. Herhaal deze stap voor alle resterende flessen.
Let op: Om te verhinderen dat O2 opnieuw invoeren van de flessen van groeimedium na stap 2.1.4, stappen 2.1.4 - 2.1.8 snel achter elkaar. Als alle flessen kunnen niet worden verbonden met het station van N2 op hetzelfde moment, doorgaan met de stappen 2.1.4-2.1.8 voor de eerste reeks van flessen en herhaal vervolgens deze stappen voor de resterende flessen. - Autoclaaf de flessen. Laat ze afkoelen tot kamertemperatuur 's nachts en sla deze daarna op kamertemperatuur.
- Bereid een 10 mM ijzer(III) citraatoplossing door 0.245 g van ijzer(III) citraat aan 100 mL gedestilleerd gedeïoniseerd water toe te voegen. Warmte en roer te ontbinden, tot een geel tot oranje duidelijke oplossing wordt verkregen. Autoclaaf de oplossing met behulp van een standaard cyclus (ten minste 15 min blootstelling bij 121 ° C) en sla deze stamoplossing bij kamertemperatuur in het donker.
- Voorbereiding van vloeibare groeimedium AMB-1 en MS-1
- Bereid een 10 mM ijzer(III) quinate oplossing. Eerst los 0,19 g van quinic zuur in 100 mL gedestilleerd gedeïoniseerd water, voeg dan 0,27 g van FeCl3.6H2O. roer te ontbinden, totdat een donker rode, heldere oplossing wordt verkregen. Autoclaaf de oplossing met behulp van een standaard cyclus (ten minste 15 min blootstelling bij 121 ° C).
Opmerking: Slaan de ijzer(III) quinate oplossing bij kamertemperatuur in het donker als een steriele stamoplossing. Gooi de oplossing wanneer een neerslag duidelijk wordt. - In een bekerglas met 1 L gedestilleerd gedeïoniseerd water, voeg de volgende in volgorde al roerend: 10,0 mL van de vitamine supplement oplossing, 5,0 mL van het trace minerale supplement-oplossing, 0.68 g KH2PO4, 0.848 g natrium succinaat dibasische hexahydraat, 0.575 g di-natrium tartraat dihydraat, 0.083g natrium acetaat Trihydraat, 0,45 milliliters 0,1% waterige Resazurin, 0,17 g NaNO3, 0,04 g ascorbinezuur en 3,0 mL van de 10 mM Fe(III) quinate stamoplossing.
Opmerking: Pas de hoeveelheden proportioneel als een kleinere hoeveelheid groeimedium nodig is. Voor een N2 station staat van borrelende vijf flessen op hetzelfde moment, zoals in stap 1 van dit protocol, gebouwd door 300 mL medium te bereiden.
Let op: Vitamine, trace minerale en Fe(III) quinate stamoplossingen moeten steriel worden gehouden. Om besmetting te voorkomen, gebruiken standaard steriele techniek en steriele Pipetteer tips wanneer verstrekking. Opslaan van de mineralen en vitamine oplossingen in een koelkast bij 4 ° C. - Breng de pH op 6,75 met behulp van de 1 M NaOH oplossing na toevoeging van alle chemische stoffen.
- Verwijzen naar de stappen 2.1.3-2.1.9 voor de rest van het protocol.
- Bereid een 10 mM ijzer(III) quinate oplossing. Eerst los 0,19 g van quinic zuur in 100 mL gedestilleerd gedeïoniseerd water, voeg dan 0,27 g van FeCl3.6H2O. roer te ontbinden, totdat een donker rode, heldere oplossing wordt verkregen. Autoclaaf de oplossing met behulp van een standaard cyclus (ten minste 15 min blootstelling bij 121 ° C).
- Bereiding van semi-solide groeimedium voor MSR-1
- Bereid een 0.5 M fosfaatbuffer oplossing pH 7.0 door ontbinding van 3.362 g K2HPO4 en 4.178 g. van KH2PO4 in 100 mL gedestilleerd gedeïoniseerd water. Controleer als de pH 7.0 en breng de pH lichtjes met KH2PO4 of NaOH indien nodig. Bewaar de oplossing in een gesloten glazen fles (voorkeur aan plastic teneinde de uitwisseling van zuurstof).
- 100 mL van een oplossing van 0,02 M zoutzuur bereiden. Voeg 0.2 g FeCl2.4H2O voor deze oplossing en roer om op te lossen met het oog op een 10 mM ijzer chloride oplossing. Bewaar de oplossing in het donker in een gesloten glazen fles.
- Bereid een 0,8 M natriumbicarbonaat oplossing door ontbinding 6,72 gram NaHCO3 in 100 mL gedestilleerd gedeïoniseerd water. Bewaar de oplossing in een gesloten glazen fles.
- Autoclaaf de oplossingen bereid in stappen 2.2.1 - 2.2.3 met behulp van een standaard cyclus (ten minste 15 min blootstelling bij 121 ° C). Opslaan als steriele voorraadoplossingen in het donker.
- In een bekerglas met 1 L gedestilleerd gedeïoniseerd water, voeg de volgende in volgorde al roerend: 5 mL van de trace mineral solution oplossing, 0.2 mL 1% waterige resazurin oplossing, 0.4 g NaCl, 0,3 g van NH4Cl, 0,1 g van MgSO4.7H2 O, 0,05 g CaCl2.2H2O, 1 g van natrium succinaat, 0,5 g natriumacetaat, 0.2 g gist extract en 1.6 g. agar.
- Dek het bekerglas af met aluminiumfolie en autoclaaf de oplossing bereid in stap 2.3.5.
- Vlak voor het einde van de cyclus van de autoclaaf, bereiden een vers 4% L-cysteine· HCl· H2O-oplossing door het oplossen van 0.8 g L-cysteine· HCl· H2O in 20 mL gedestilleerd gedeïoniseerd water. Neutraliseer de oplossing op pH 7,0 met 5 M NaOH oplossing.
Let op: het is belangrijk dat de cysteïne-oplossing vers bereid is om te voorkomen dat de oxidatie van het cysteïne. Winkel de minerale oplossing in een koelkast bij 4 ° C. - Na autoclaaf, laat de middellange afkoelen tot 50 – 60 ° C en breng het bekerglas onder de vlam van een brander van Bunsen. Verwijder de aluminiumfolie en snel toevoegen de volgende in volgorde terwijl zachtjes roeren: 0,5 mL van de vitamine-oplossing, 2,8 mL steriele voorraad fosfaatbuffer, 3 mL steriele ijzer chloride stockoplossing, 1.8 mL van de steriele natrium bicarbonaat voorraad en 10 mL van cysteïne filter-gesteriliseerde oplossing.
Opmerking: Pas de hoeveelheden proportioneel als een kleinere hoeveelheid groeimedium nodig is. Het is meestal handig ter voorbereiding van een partij van 120 mL medium.
Let op: Alle oplossingen moeten blijven steriele voor toekomstig gebruik. Stap uitvoeren met behulp van standaard steriele techniek en steriele Pipetteer 2.3.8 tips bij verstrekking. - Na de toevoeging van alle chemicaliën, breng het warme medium in 16 mL steriele buizen schroefdop Hungate. Pipetteer 12 mL van het medium in elk buisje en verzegel de buizen.
Let op: Om besmetting te voorkomen, stap 2.3.9 onder de vlam van een bunsenbrander uitvoeren. Voer het uit voordat de agar stolt, terwijl het medium bij 40 ° C of hoger is. - Laat de buizen ongestoord gedurende enkele uren tot de agar stolt en de OAI blijkt, zijn materialiseren als een roze kleurloze interface, ongeveer 1 tot 3 cm onder het oppervlak van het medium.
Opmerking: Het medium moet langzaam wenden kleurloze in de buis. De hoeveelheid tijd die nodig is voor deze overgang is variabel en hangt af van de hoeveelheid O2 in eerste instantie opgelost in het medium.
3. enten van MTB
Opmerking: De culturen van stammen AMB-1, MS-1 en de MSR-1 commercieel kunnen worden verkregen (Tabel van materialen).
Let op: Voer alle volgende stappen onder steriele omstandigheden, onder de vlam van een bunsenbrander.
- Inoculatie van stammen MSR-1, AMB-1 en MS-1 in vloeistof
- Sluit een lege 125 mL serum fles met een butyl-rubber stop en een aluminium crimp zegel. Invoegen van twee naalden in de fles door de stop en sluit een injectiespuit bereid zoals in stap 1.7 aan één van hen. Een cilinder met O2 tot en met hetzelfde type buis als die wordt gebruikt voor de N2 station verbinden met de spuit.
- Laat O2 stroom door de fles voor ongeveer 30 min, om ervoor te zorgen dat alle lucht in de fles is vervangen door O2. Verwijder beide naalden, waardoor een lichte overdruk in de fles en vervolgens autoclaaf. Laat de fles om af te koelen tot kamertemperatuur vóór gebruik.
Opmerking: Om tijd te besparen, stappen 3.1.1 en 3.1.2 bij de middellange voorbereiding en autoclaaf de fles samen met het medium of de stamoplossingen. - De toppen van de stoppen van zowel het verse medium flesje en de O2 fles steriliseren door toepassing van een paar druppels van 70% ethanol-oplossing op de top van hen en hen te passeren van de vlam van een brander van Bunsen.
- Met behulp van een steriele injectiespuit en een naald, pak van 1 mL O2 uit de fles O2 en breng dit in de verse middellange fles. Zorg ervoor dat de naald strak op de spuit tijdens deze stap past om te voorkomen dat eventuele lucht in de spuit.
- Als met behulp van het entmateriaal uit een andere cultuur geteeld in een glazen fles, steriliseren de stoppen van zowel het verse medium flesje en de oudere cultuur fles door toepassing van een paar druppels van 70% ethanol-oplossing op de top van hen en hen te passeren van de vlam van een brander van Bunsen. Als het entmateriaal uit een buis van bevroren cultuur gebruikt, laat het warme tot kamertemperatuur met de buis onder de vlam van een bunsenbrander verzegeld.
- Als met behulp van het entmateriaal uit een andere cultuur geteeld in een glazen fles, beënten 1 mL van de oudere cultuur in het verse medium. Als met behulp van de inoculate uit een bevroren voorraad, beënten slechts 0,1 mL om te verdunnen de glycerol of dimethyl sulfoxide (DMSO) gebruikt in het vriesproces. In beide gevallen moet u een steriele naald en een steriele injectiespuit gebruiken.
- Incubeer de cultuur bij 32 ° C en het enten tot verse medium na 4 tot 7 dagen.
- Inoculatie van de MSR-1 in O2 kleurovergang semi-solide medium
- Controleer of dat de buis van vers medium worden weergegeven op een welomschreven OAI, gematerialiseerd door een roze kleurloze interface.
- Indien het entmateriaal is afkomstig van een andere O2 concentratie verloop Halfmassief cultuur, oogsten de bacteriën door pipetting 50 µL van de cultuur met een steriele Pipetteer tip geplaatst op de band gevormd door de bacteriën. Langzaam beënten deze bacteriën op de OAI in het verse medium (roze/kleurloze interface), het vermijden van verstoring van de interface. Als het entmateriaal is afkomstig van een bevroren cultuur, gaat u verder op dezelfde manier met 100 µL van entmateriaal in plaats daarvan.
- Zegel van de buis en laat die de bacteriën tussen 25 ° C en 30 ° C. groeien Pipetteer in verse medium gebruik van dezelfde procedure voordat van de band van bacteriën op het oppervlak van het medium.
4. waarneming van de bacteriën
- Steriliseren de stop van de fles cultuur in 70% ethanol oplossing op de top van het toe te passen en het passeren van de vlam van een brander van Bunsen. Voor semi-solide medium, opent u de buis onder de vlam van een brander van Bunsen. Gebruik een steriele naald en een steriele injectiespuit om Extraheer de bacteriën.
- Gebruik de opknoping drop methode8 om ervoor te zorgen dat de bacteriën zowel magnetische als motile zijn.
Opmerking: Fase contrast microscopie geeft goede resultaten maar is niet verplicht. Variërend van 10 X tot 60 X vergrotingen zijn geschikt. - Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) te observeren de celstructuur en de magnetosomes in detail8gebruiken
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle voorbereiding van de groei-media kan als volgt worden beoordeeld. Aan het einde van het proces, duidelijke oplossingen (dwz., vrij van een eventueel neerslag) moeten worden verkregen (dit geldt voor zowel de vloeibare media en het O2 kleurovergang semi-solide medium). Een afbeelding weergeven het verwachte aspect van de MSR-1 opgietvloeistof voordat inoculatie kan worden gezien in Figuur 2a. Een succesvolle O2 concentratie verloop semi-solide medium wordt gesignaleerd door de vorming van een OAI na een paar uur, aangegeven door de aanwezigheid van 1-3 cm van roze medium aan de bovenkant van de buis (Figuur 3, tube A). De rest van het medium moet kleurloos. Een all-roze medium voordat inoculatie een teken van volledige oxidatie van de resazurin is en dus van een mislukte voorbereiding van het O2 concentratie verloop.
Succesvolle groei in vloeistof kan worden gecontroleerd ongeveer 48u na inoculatie (of na een paar dagen als het entmateriaal is afkomstig van een bevroren cultuur) gewoon door het onderzoek van de culturen voor troebelheid met behulp van een lichtbron of een spectrofotometer. Succesvolle groei wordt bevestigd door de troebelheid waaruit blijkt dat de bacteriën eigenlijk (Figuur 2b groeide). Als het medium duidelijk na 48u blijft, hebben de bacteriën niet gegroeid. Voor een vloeibaar medium cultuur normaal groeit, kan de aanwezigheid van bacteriën die magnetosomes synthetiseren na 48u worden gecontroleerd door de fles van medium op een magnetische roer plaat te plaatsen en door het verlichten met een zaklamp. Bij een lage snelheid van roeren, moet het medium "flash", op zoek naar afwisselend donkere en helderder is afhankelijk van de oriëntatie van de roeren magneet met betrekking tot de positie van het Vejle. Voor een niet-magnetische cultuur, zal de intensiteit van de lichtverstrooiing door cellen naar het Vejle constant blijven.
Succesvolle groei in semi-solide medium wordt aangegeven door de vorming van een band van de microaerophilic van bacteriën op de roze/kleurloze interface. Als gevolg van de consumptie van O2 door de bacteriën en de veranderingen in het verloop van de2 O, zal de band langzaam migreren om te volgen de OAI (Figuur 3, buis B).
De opknoping drop methode maakt het mogelijk de waarnemer om te controleren dat de bacteriën zowel magnetische als motile zijn. Na een paar minuten, MTB moet zich concentreren op de rand van de daling van de hangende, waaruit blijkt dat zij actief langs de magnetische veldlijnen (figuur 4a zwemmen). Spiegelen om ervoor te zorgen dat de cellen magnetisch zijn, de oriëntatie van de magneet zit naast de daling. De bacteriën beginnen zwemmen naar de tegenoverliggende rand (figuur 4b). Tot slot, de vorm van de magnetosomes kan worden gecontroleerd met TEM. Cuboctahedral kristallen van ongeveer 30 – 45 nm in diameter moet worden geobserveerd9. Deze kristallen zijn normaal gerangschikt in één lange keten of meerdere kortere ketens in de soorten studeerde hier (Figuur 5).
Figuur 1 : Illustratie van de N-2 station vergassing. (een) Schematische weergave. (b) foto van de setup. Een succesvolle station zal de passende lengte van grote en dunne slang hebben zodat het einde van de dunne buis beschreven in stap 1.9 van het protocol ondergedompeld in het medium tijdens de borrelende stap van gas blijft. De stroom van gas moet ook verstelbaar te allen tijde, om ervoor te zorgen dat alle O2 wordt verwijderd en dat de medium betekent niet morsen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Flessen van vloeibaar groeimedium vóór en na inoculatie. (een) duidelijk MSR-1 medium voor inenting. (b) troebel MSR-1 medium na 3 dagen van succesvolle groei. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Buizen van O2 verloop semi-solide medium voordat (buis A) en 10 dagen na inoculatie (buis B). De band van bacteriën in buis B wordt aangeduid met een rode pijl.
Figuur 4 : Typische resultaten van een daling van de hangende experimenteren op 20 X vergroting met fase contrast microscopie. (een) MTB zwemmen naar de Zuidpool van een magneet en zich ophopen op de vloeistof/lucht-interface. (b) 1 min na het spiegelen van de magneet, de meeste cellen hebben verlaten het gezichtsveld.
Figuur 5 : TEM observatie van een cel AMB-1. Magnetosome kettingen worden aangegeven door rode pijlen. De twee flagellen zijn aangegeven door zwarte pijlen.
Aanvullende tabel 1. Klik hier om te downloaden van deze tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De specifieke O2 concentratie vereisten van MTB maken hen niet-triviaal om te groeien in het laboratorium. Een belangrijke stap van het protocol voor opgietvloeistof is de eerste verwijdering van alle O2 van het middel om de uiteindelijke concentratie door het toevoegen van een bepaald volume van O2, vlak voor de inenting. Het is gebleken dat MSR-1 groeit onder bijna volledig aërobe omstandigheden, echter het magnetisme van de cellen wordt drastisch verminderd. Uit hetzelfde onderzoek bleek dat stammen AMB-1 en MS-1 niet onder volledig aërobe omstandigheden6 groeien. Voor de semi-solide cultuur voor MSR-1, alle O2 eerst met de cysteïne-oplossing wordt verminderd en het O2 concentratie verloop verschijnt, wat leidt tot de vorming van de OAI. Als een cultuur niet goed groeit of niet magnetisch is, moet de concentratie van de2 O het eerste ding om te controleren.
Halfmassief groeimedium is een interessante keuze voor het isoleren van onbekende MTB of uitbreiden van de soorten die zeer gevoelig voor beide O2 en redox verlopen, zijn zoals het garandeert het bestaan van stabiele verlopen en kan de bacteriën zich op de locatie biedt de beste voorwaarden voor groei. Opgietvloeistof is handiger om mee te werken wanneer hogere volumes nodig zijn (bijv., voor DNA-extractie), of wanneer verdere analyse moet worden uitgevoerd op de cellen (bv., magnetosome studies) omdat het zorgt voor een eenvoudiger scheiding van de cellen van het groeimedium. De agar in semi-solide medium kan inderdaad interfereren met de cel techniek oogsten.
In sommige culturen, de cellen worden soms niet-sporenvormende, waarschijnlijk als gevolg van spontane mutaties. Niet-sporenvormende cellen overleven en groeien in het groeimedium, aangezien zij niet hoeven om te zwemmen om te zoeken naar voedingsstoffen nodig om te overleven. De standaard circuit-methode10 kan vervolgens worden gebruikt om te herstellen van een motile cultuur aangezien alleen motile cellen naar beneden van het circuit zwemmen kunnen. Het verlies van de magnetische fenotype kan ook gebeuren in de cultuur, zelfs als de concentratie van de2 O optimaal, opnieuw als gevolg van spontane mutaties11 is. De beste oplossing is in dat geval om te beginnen met een nieuwe cultuur door het enten van de voorraden van de wild-type bacteriën bevroren tot verse medium. De racebaan techniek kunnen anderzijds ook het herstel van een magnetische cultuur.
Het is essentieel om besmetting te voorkomen van de cultuur door andere organismen en daarom de meeste van het protocol moeten worden uitgevoerd met behulp van steriele technieken. Meestal onder de vlam van een bunsenbrander manipuleren geeft bevredigende resultaten bij de aseptische condities te houden. Echter, als de cultuur wordt gekweekt in een besmetting gevoelig voor milieu, extra voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals werken in een laminaire flow-kap, bij de voorbereiding van het medium en enten van de bacteriën. Opgemerkt moet worden dat het risico van besmetting hoger in semi-solide medium is als de buizen moeten worden geopend telkens als de cellen worden verwijderd.
Deze protocollen inschakelen de groei van genoeg bacteriën voor het uitvoeren van vele verschillende types van experimenten, zoals fysieke studies op basis van optische microscopie12,13, elektronenmicroscopie imaging14,15, X-Ray spectromicroscopy analyses16, genomic en eiwit studies17,18. Indien nodig, kunnen hogere concentraties van bacteriën in suspensie worden bereikt door middel van centrifugeren. Daarnaast kan magnetosomes worden gewonnen en gezuiverd voor verdere toepassingen van cel pellets of dichte cel schorsingen verkregen door centrifugeren19.
Groei media formuleringen zijn meestal gebaseerd op dezelfde bestuur principes (Zie aanvullende tabel 1 voor een overzicht van de lijst van de rol van elk onderdeel in de groei-media hier beschreven). Een koolstofbron moet beschikbaar zijn voor de bacteriën, via organische zuren (bv., succinaat, acetaat, tartraat, lactaat) of anorganische verbindingen, zoals bicarbonaat. De keuze van een geschikte koolstofbron hangt af van het metabolisme van de bacteriën. Stikstof aanwezig in DNA en proteïnen, en fosfor (DNA, membranen) zijn eveneens vereist en geleverd door NaNO3, NH4Cl en KH2PO4 in de recepten hier beschreven. Een buffer (HEPES, fosfaatbuffer) is noodzakelijk om te weerstaan pH-veranderingen. Het trace minerale supplement oplossing bevat cofactoren van enzymen, en de vitaminen kunnen worden gebruikt door de bacteriën als coënzymen of als functionele groepen voor bepaalde enzymen. Gist extract en soy bean pepton bieden een bron van aminozuren en zouten die zijn gebruikt voor de productie van eiwitten. Aangezien MTB redox gevoelig zijn, één of meerdere reductiemiddelen vaak aan het medium moet worden toegevoegd (bv., cysteïne, ascorbinezuur, lactaat). Een belangrijke bron van ijzer (bv., ijzer(III) citraat, ijzer(III) quinate, ijzer chloride) is nodig in het medium voor biomineralization. Tot slot is een kleine hoeveelheid O2 vereist voor microaerophilic bacteriën als terminal elektron acceptor. Obligate anaërobe MTB gebruik andere verbindingen, zoals nitraat of distikstofoxide (lachgas) in plaats daarvan.
De belangrijkste beperking van deze protocollen is dat er is geen garantie dat ze voor andere soorten MTB werken zullen. Stammen AMB-1, MS-1 en de MSR-1 zijn alle zoetwater MTB en daarom de recepten in dit artikel beschreven niet worden gebruikt om te groeien van mariene magnetospirilla zoals Magnetospira thiophila stam MMS-1, Magnetospira stam QH-2 of andere mariene MTB, die vereisen hogere concentraties van zout. Echter, om te groeien van andere stammen van MTB, en voor de isolatie van nieuwe stammen, de algemene methoden in dit artikel voor zowel vloeibare als semi-vaste media gepresenteerd kunnen worden gebruikt ter voorbereiding van media met verschillende recepten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij Richard B. Frankel bedanken voor zijn hulp met MTB culturen, Adam P. Hitchcock Xiaohui Zhu voor hun steun bij het opzetten van de MTB-culturen op McMaster University en Marcia Reid voor opleiding en toegang tot de faciliteit van elektronenmicroscopie (McMaster University, Faculteit der medische wetenschappen). Dit werk werd gesteund door de natuurwetenschappen, Engineering onderzoek Raad van Canada (NSERC) en de ons National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
References
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
- Uebe, R., Schüler, D.
- Faivre, D., Schuler, D.
- Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
- Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
- Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
- Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
- Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
- Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
- Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
- Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
- Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
- Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
- Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
- Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
- Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
- Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
- Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
- Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
- Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).
