Summary
פרוטוקול זה מפרט את המתודולוגיה לכימות תנועת התנהגות גינקולוגיות ולישון ב cavefish מקסיקני. ניתוחים קודמים מורחבות כדי למדוד ההתנהגויות בדגים שוכנו מבחינה חברתית. מערכת זו ניתן להחיל באופן נרחב כדי ללמוד שינה ופעילות מינים דגים אחרים.
Abstract
מעבר phyla, שינה מאופיין על ידי מאפיינים התנהגותיים מאוד שנשמרת כוללות סף גירוי גבוה ריבאונד בעקבות מניעת שינה, המאוחדים תקופות של פקקת התנהגותית. Cavefish מקסיקני, Astyanax mexicanus (mexicanus א), הוא מודל לימוד האבולוציה תכונה בתגובה ההפרעות סביבתיים. Mexicanus א קיים כמו צורות השטח-דיור עיניים אוכלוסיות מרובות עיוור המערה-דיור שיש הבדלים מורפולוגיים והתנהגותיים חזקים. אובדן שינה אירעה באוכלוסיות מרובות, cavefish התפתחו באופן עצמאי. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לכימות שינה ופעילות גינקולוגיות מערת mexicanus א ודגים משטח. מערכת ניטור וידאו חסכוני מאפשר הדמיה התנהגותית של המלון שוכן באופן אינדיבידואלי זחל או למבוגרים דגים לתקופות של שבוע או יותר. המערכת ניתן להחיל לדוג בגילאי 4 ימים הפריה פוסט דרך לבגרות. ניתן גם להתאים את הגישה מודדים את ההשפעות של אינטראקציות חברתיות על שינה על ידי רישום מרובים דגים בזירה יחיד. בעקבות הקלטות התנהגותית, ניתוח המידע באמצעות כלים אוטומטיים תוכנת מעקב, ניתוח שינה מעובד באמצעות קבצי script מותאמים אישית זה לכמת משתנים שינה מרובים כולל משך הזמן, מה דעתך על אורך ומספר מה דעתך. מערכת זו ניתן ליישם מידה שינה, התנהגות היממה, ופעילות גינקולוגיות כמעט כל מיני דגים כולל דג זברה, sticklebacks.
Introduction
שינה מאוד כולו בכל רחבי ממלכת החי-2,1,3רמות פיזיולוגיים, פונקציונלי, התנהגותיים. בזמן שינה בחיות מעבדה יונקים מוערך בדרך כלל באמצעות electroencephalograms, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות הם פחות מעשית במערכות קטנות דגם גנטית קלה, ובכך שינה בדרך כלל נמדד בהתבסס על התנהגות3 , 4. ובמאפיינים התנהגותיים הקשורים שינה מאוד נשמרים בכל רחבי ממלכת החי, כוללים עוררות מוגברת הסף, הפיכות עם גירוי, תרדמה ממושכת התנהגותית5. אמצעים אלה ניתן לאפיין שינה בבעלי חיים החל התולעת נמטודות, C. elegans, בני6.
השימוש של תרדמה התנהגותית לאפיין שינה דורש תוכנת מעקב אוטומטי. עם תוכנת מעקב, תקופות של פעילות של פקקת נקבעים על פני מספר ימים, תקופות ארוכות של חוסר פעילות מסווגים כמו לישון7,8. בשנים האחרונות פותחו מספר מערכות מעקב לרכישת פעילות נתונים בין מגוון של מערכות קטן דגם גנטית קלה; כולל תולעים, זבובי פירות, דגים9,10,11. תוכניות אלה מלווים על ידי תוכנה המאפשרת למעקב אוטומטי של התנהגות בעלי חיים, כולל קוד פתוח freeware והן תוכנה זמינים מסחרית7,12,13,14 . מערכות אלו נבדלים הגמישות שלהם ויאפשרו הקרנה יעילים ואפיון של שינה פנוטיפים במודלים גנטית amendable רבים.
החקירה גנטי שינה דג זברה, רזבורה rerio, הוביל הזיהוי של מספר גנים של המעגלים העצביים המסדירים שינה15,16. בזמן זה סיפק מערכת חזקה על חקירת הבסיס העצבי של שינה בכל חיית מעבדה חוליות, היא הרבה פחות ידוע על איך מתפתח שינה וטבעי איך וריאציה תורם לישון רגולציה. Cavefish מקסיקני, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), התפתחו הבדלים דרמטיים שינה, פעילות גינקולוגיות, השעון הביולוגי17,18. דגים אלה קיימים כמו דגים משטח עיניים המאכלסים הנהרות של מקסיקו, דרום טקסס, לפחות 29 מערת אוכלוסיות האזור בסיירה דל אברה של מקסיקו הצפון19,20,21. למרבה הפלא, הבדלים התנהגותיים רבים, כולל אובדן שינה, להופיע הופיעו באופן עצמאי מספר cavefish אוכלוסיות14,22. לכן, cavefish מספקות מודל של חוקר את התפתחות מתכנסת שינה, היממה, והתנהגויות חברתיות.
פרוטוקול זה מתאר מערכת למדידת שינה והתנהגות גינקולוגיות א'. הזחלים mexicanus ומבוגרים. מערכת הקלטה מבוססי אינפרא אדום לפי הזמנה מאפשר הקלטת וידאו של בעלי חיים בתנאים כהים ובהירים. ניתן להשתמש בתוכנה זמינים מסחרית כדי למדוד פעילות, להשתמש בפקודות מאקרו מותאם אישית כדי לכמת את מספר היבטים של חוסר פעילות, לקבוע תקופות של שינה. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר שינויים ניסיוני לצורך מעקב אחר הפעילות של חיות מרובות בתוך טנק, מתן היכולת לבדוק אינטראקציות בין שינה והתנהגויות חברתיות. מערכות אלה ניתן ליישם מידה שינה, התנהגות היממה, ופעילות גינקולוגיות זני דגים נוספים כולל דג זברה, sticklebacks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: להגדיר מערכות למעקב התנהגותיות אצל הזחלים ומבוגרים.
1. לבנות את מערכת השינה עבור הזחלים
הערה: מערכת ניטור לצורך מעקב זחל דרך דגים לנוער בגילאי 4 ימים פוסט הפריה (dpf) דרך dpf 30 mexicanus א דורש מספר חלקי ציוד כולל תאורה אינפרא-אדום (IR), רשתות ומפזרים אור אקריליק IR, אוטומטי אור פקדים (טיימרים), מחשבים, מצלמות, ועוד חומרים משניים כגון חיווט בקרי עוצמה (איור 1 א'). ההוראות הבאות יודיע כיצד לבנות מערכת לעקוב בצורה מדויקת אחר התנהגות גינקולוגיות ללמוד שינה ומקצבים השעון הביולוגי של זחל mexicanus א.
- לבנות מערכת תאורה המורכב IR ואור לבן דיודות (LED): למקם את שלושת אורות אינפרא-אדום המשולש כ 7.62 ס"מ אחד מהשני על הקירור פלטפורמה מתכת דק 30.5 ס מ x 30.5 ס מ. חוט נוריות בסדרה עם חוט חשמל, להתחבר למקור חשמל.
- במקום אור לבן יחיד LED במרכז האורות IR שלושה וחבר אותם למקור הכוח.
- חבר מקור הכוח של ה-LED כדי טיימר אור אל תקופה היממה סטנדרטי.
- לבנות פלטפורמה עבור מערכת מעקב זחל. השתמש 0.33 ס מ עבה השלט הלבן אקריליק עבור כל הרכיבים של הפלטפורמה.
- במקום פלטפורמת הקלטה על גבי הקירור ריבוע מואר על איזה ארנס המכיל דגים ישכון במהלך המעקב התנהגותית.
-
המקום אקריליק השני בתוך הקופסה בין האורות החיות לנטרל את IR עבור תאורה אופטימלית והחדות.
הערה: הממדים עבור תיבת אור הזחל הוא כדלקמן: שני 18 ס"מ 8.5 ס"מ, שני 17 ס"מ 8.5 ס"מ נוריות אשר מבחינה כימית מודבקת יחדיו לצורה 18 ס"מ 18 ס"מ מרובע גבוה זה 8.5 ס"מ. בנוסף, אקריליק ייתכן בקלות לחתוך או מסועף באמצעות כלים מתאימים עבור גודל מותאם אישית.- מקם את הבמה כולה מעקב זחל וההתקנה תאורה בתוך שפופרת פלסטיק סגורה ולאחר מכן מקם את המצלמה על גבי הצינור.
הערה: חשוב להשאיר תאורה השתקפויות להופיע בסרטון מעקב, כמו זה יפגום ביכולת הדיוק מעקב. הצבת מצלמות על גבי צינור המקיף פלטפורמה משפר את התאורה וחדות למצלמות המשמשים עבור ניסויים אלה.
- מקם את הבמה כולה מעקב זחל וההתקנה תאורה בתוך שפופרת פלסטיק סגורה ולאחר מכן מקם את המצלמה על גבי הצינור.
- לתמרן מצלמת אינטרנט (ראה טבלה של חומרים) עבור הקלטה מבוססי IR. הסר את העדשה יצרן בעזרת כלי סיבוביים (ראה טבלה של חומרים).
- הסר את הברגים כסף קטן על הצד האחורי של המצלמה כדי להסיר את המארז הפנימי.
- הסר את הברגים שחור קטן בתוך הגוף של המצלמה כדי לשחרר את השארית של העדשה. השתמש למברג קטן כדי להסיר כל חלקים של הדיור עדשה שנותר לאחר חיתוך העדשה.
- הסר הכחול הוביל על החלק העליון טעון מצמידים התקן (CCD) דיור.
- להרכיב את המצלמה חזרה על ידי הצבת הדיור הפנימי חזרה לכיוון המקורי שלו ולדפוק את שני הברגים כסף בחזרה למיקום המקורי שלהם.
- המסלול הפנימי של המצלמה באמצעות קטן ראיתי כדי להתאים עם מעט ניתוב פלסטיק מעוגל. חלק למטה פלסטיק נוספת עד זה יכול להתאים מתאם עדשה.
- התקן של מסנן האינפרא-אדום לעבור בתוך המצלמה הקרוב ה-CCD ככל האפשר מבלי ליצור קשר ישיר עם המצלמה.
הערה: . שמור על עצמך שלא יגרמו נזק שבב CCD בתוך הדיור של המצלמה. הקפד לשמור את החתך כמו רמת ככל האפשר. חותם כל מקום פנוי בין החלק החיצוני של המסנן IR לגוף של המצלמה כדי לשמור על אור מלהגיע CCD ללא סינון. - לצרף את המצלמה עדשה 35 מ מ קבוע (ראה טבלה של חומרים) על ידי לדפוק את המתאם מול המצלמה לחלק האחורי של העדשה.
- מקם את המצלמה ואת העדשה לתוך החור תרגלנו את המכסה על גבי הצינור בתים על הבמה ואורות וצרף ה-USB למחשב שהחיות יירשמו מ.
הערה: הדג ומניחים בחדר התנהגות כי הוא נפרד מן שבו דגים מניות שוכנות כדי להבטיח מינימלי שיבושים במהלך הקלטות התנהגותית. לטפל כדי למזער את תנודות טמפרטורה ואוורור אשר יכול לבלבל ניסויים התנהגותיים.
2. ישנה את מערכת למבוגרים
- לבנות מערכת תאורה אינפרא-אדום עבור מעקב אחר דגים למבוגרים על ידי חיתוך רצועות IR כדי כ 46 ס"מ במרווחים. רצועה 46 ס מ אחת מספיקה בכל אקווריום התנהגות 10 L.
- תיל כל רצועת יחד בסדרה, הלחמה כל רצועה לכבל חשמל DC וצרף למקור מתח V 9.
- לצרף רצועת IR כל פיסת 51 ס מ x 5.1 ס מ אלומיניום זה ישמש מפזר החום.
- במקום 46 ס מ x 5 ס מ, 0.32 ס מ בעובי 9% השלט הלבן פס אור אקריליק גיליון ישירות מול כל רצועת אור IR כדי לפזר IR אור.
- במקום כל הטנקים על מתלה התומך האחורי רכוב תאורת IR.
- השתמש חוצצים פלסטיק אטום או במיכל זכוכית 10 L ליצירת ארנאס בודדים.
הערה: גודל ארנה יכולים להיות מגוונים בהתאם את מספר החוצצים בשימוש ואת גודל המיכל. גודל ארנה משפיעה על פעילות גינקולוגיות ולישון המערה והן דגים משטח23. - הר מצלמות כ 4-6 מ' טנקים. כל מצלמה יכול להקליט בדרך כלל מטנקים 3 במועד כדי לספק רזולוציה מספיק לצורך מעקב.
הערה: הקלטות התנהגותית מבוגרים בדרך כלל אינם דורשים מערכת תאורה לבנה נפרד כדי לשלוט יום לילה שינויים. פשוט ניצול סטנדרטי תקורה האורות בחדר התנהגותית קשור טיימר סביר להספיק.
3. הקלטת פעילות גינקולוגיות
הערה: כל ההקלטות התנהגותי נעשים באמצעות מחשב נייד רגיל או שולחן עבודה עם מקור סוללת גיבוי. בשל גודל קובץ גדול 24 שעות הקלטה (60-100 GB), שמור כל ההקלטות על כוננים קשיחים חיצוניים.
- חבל דגים dpf בגילאי 4-30 עבור 18-24 שעןת לפני ייזום הקלטות. להאכיל דגים זחל עם שרימפסים חיים כאשר מניחים תחילה בבית הבליעה הקלטה, ו h 1 לפני תחילת ההקלטות. חבל דגים בוגרים 4-5 ימים לפני הקלטה התנהגות ולהאכיל פעם ביום עם האוכל פתית או עם blackworms בשידור חי.
הערה: הקפד למקם את הזחל דגים במים מתוקים לפני הקלטה, כמו שאריות של שרימפסים יגרום בעיות מעקב במהלך ניתוח מאוחר יותר. Culturing במשותף עם rotifers מספק אפשרות חלופית, כמו גודלם הקטן לא מפריע מעקב. - המקום דגים מגיל 4-6 dpf בתרביות רקמה. ובכן 24 צלחות. דג הבית בגילאי 20-30 dpf ב 12-ובכן תרביות רקמה לוחות עבור הקלטה.
- להקליט מבוגרים במיכלים 10 L מתאים עם חוצצים כדי להכיל את הדג מאוכסנים חמש או ללא חוצצים כדי להקליט שינה ופעילות בקביעה חברתית.
הערה: לטפל כדי למקד את המצלמה לפני ליזום את ההקלטה על מנת למקסם את דיוק מעקב. אל תפתח את הקשתית של עדשת המצלמה רחוק מדי, כמו זה יהיה להפחית באופן דרסטי חדות התמונה. יש איזון, עם זאת; אם הקשתית סגורה מדי, קצב המסגרות של הווידאו יפלו מתחת 15.00 fps. זה חיוני לניתוח בשלב מאוחר יותר קצב המסגרות נותרת 15.00 מסגרות s לשימוש עם קצת שינה שכתוב מותאמת אישית script23,24. - הגדר תאורה/בהירות הרקע תאורות.
- למטב את התאורה עד לתחילת ההקלטה. תמיד לשמור את הניגוד ברמה הגבוהה ביותר האפשרי, השתמש בהירות תאורה רקע כדי לכוונן את הבהירות עד החיות ברורים ביותר.
- דגים הרשומה עבור 24 או 48 שעות.
הערה: מארזי סוללות גיבוי חירום כי כוח כל תאורה, מחשבים, מצלמות לרוכשם במקרה של הפסקות חשמל. כל הסוללות צריכים גם להיות פקוק לתוך שקעי חשמל חירום, במידת האפשר. מארזי סוללות בדרך כלל לא חשמל ציוד יותר מכמה דקות לשעה לכל היותר ומגישים לגשר בין מאבד את הכוח הראשי לבין העברת מערכת החירום.
4. ניתוח של פעילות גינקולוגיות בנפרד שוכנו דגים באמצעות כלים אוטומטיים תוכנת מעקב
- כדי להתחיל בניתוח התנהגות, לפתוח את תוכנת מעקב, בחר ניסוי חדש מתבניתולאחר מכן בחר להחיל תבנית Pre-Defined.
- כאשר התוכנית תבקש עכשיו איזה מין כדי לעקוב אחר, בחר דגים. השתמש בתיבת רשימה נפתחת כדי לבחור או דג זברה הזחלים של דג זברה מבוגר בהתאם את פרדיגמה נסיונית.
- להגדיר את ארנס שבו כל בעל חיים יהיו תחת מעקב. עבור הזחלים, בחר היטב את הצלחת, סיבוב טוב , תבנית אזור לא. למבוגרים, השתמש בשדה פתוח, כיכר עם תבנית אזור לא. לאחר מכן לקבוע את המספר הנכון של ארנס, אחד עבור כל חיה במעקב בהוידאו.
- בחר את המודל של האופטימלית מעקב, לחץ על מעקב אחר -נקודת המרכז, , וודא כי הצבע בעלי חיים נבחרה להיות כהים יותר הרקע. להחיל את קצב המסגרות שבו נרכשה הווידאו. תוכנת מעקב אמורה לזהות באופן אוטומטי זה.
- לצייר בקנה מידה למדוד את המרחק בעולם האמיתי של אובייקט כדי לקבוע באופן מדויק את ההתנהגות גינקולוגיות של הדג באמצעות הגדרות ארנה.
- ערוך את ארנס כדי לוודא כי כל האזור הנמצאים הדגים יהיו תחת מעקב; אחרת דגימות יאבדו במהלך הרכישה.
הערה: פעל בזהירות בעת הגדרת אזורים. הזחל דגים במיוחד רגישים לאיתור שגיאות אם ארנאס או גדול מדי או קטן. תאורה גרועה בניסוי ניתן גם ליצור צללים על הקירות של צלחות טוב, התוכנית אולי חושב שזה חיה, יצירת חיובי כוזב. - לחץ על מתקדם. תחת שיטת זיהויסביבה, בחר חיסור דינמית, ולאחר מכן לחץ על רקע ובחר להתחיל ללמוד. התאם את יחס אות/רעש הניגודיות כהה עד החיות מתבצע מעקב אחר. ובכן, הרקע לא גורם. המעקב לקפוץ.
הערה: איכות וידאו יכול להשתנות בין ניסויים, אז בכל ניסוי ייתכן שיהיה עליך להשתמש בהגדרות שונות, בהתאם. באמצעות התכונות מתאר נושא נושא גודל באופן משמעותי לשפר תוצאות מעקב. - בחר רשימת המשפט ולטעון הפרמטרים הנכון לפני שתתחיל להקליט את הנתונים לתוכנית.
- לחץ על הכרטיסיה ייבוא לתוך, בחר מסלול מתוכנן כל המבחנים ולחץ על לחצן הרשומה.
- תחת ניתוח פרופיל, ודא מרחק, זמן & התנועה נבחרו.
הערה: סדר לניתוח שינה בשלב מאוחר יותר, זה קריטי כי הגדרות אלה נכונים, כמו .perl הקובץ חייב לקרוא את הנתונים הללו בסדר הנכון כדי לחשב שינה. - תחת ייצוא, בחר נתונים גולמיים, לייצא את הנתונים כטקסט Unicode.
5. מעקב חברתית שוכנו דגים
- בצע את שלבים 4.1-4.4 כדי להגדיר את הניסוי בתוכנת מעקב.
- בתפריט הנפתח, בחר כמה בעלי-חיים כדי לעקוב אחר לניסוי.
- ב'הגדרות ' ארנה ', צייר את קנה המידה הנכון כדי לכייל את המרחק בעולם האמיתי.
- הגדרות איתור , להשתמש חיסור דינמית, הניגודיות כהה לעקוב בצורה הטובה ביותר את החיה.
- להתאים את גודל הנושא תחת הגדרת זיהוי, כך מתבצע רק חלק קטן מאוד של החיה.
הערה: על ידי מעקב רק חלק קטן של החיה, זה יקטין את כמות מעבר בין בעלי חיים, כשהם חוצים נתיבים במהלך רכישת. - ברגע המסילה נרכשים, השתמש בעורך המסלול לתקן באופן ידני פעמים איפה דגים יכול לחצות נתיבים.
6. מיצוי של נתוני השינה מפעילות גינקולוגיות
הערה: ההגדרה התנהגותית שינה, זחל והן למבוגרים mexicanus א היא 1 דקות או יותר של תרדמה. הגדרה זו נקבע באמצעות ניסויים סף גירוי, שבו גירוי חושי יותר נדרש ליזום תגובה התנהגותית במצב שינה (> 60 s) לעומת להעיר14,17. עבור תנועות קטנות, נסחף נפוצות לדוג מינים, שם מהירות ספי מוחלים על הפרדת תנועה ממש רעש או להיסחף. ספי אלה הם שהמפתחות נגזר על-ידי השוואת מתאמים בין מרחק משך השינה כדי לחפש את הערכים ה-R בריבוע הגבוהה ביותר; ובכך קביעת המהירות המדויקת ביותר עבור התנועה ולישון. דגים זחל, הגבולות העליונים והתחתונים הם שני 12 מ"מ/s כמו שיש קצת כדי לא להיסחף. דגים למבוגרים הגבול התחתון הוא 2 ס מ לשנייה עם גבול עליון של 4 ס"מ/s עבור סחיפה.
- התקן Cygwin למחשב ניתוח כדי להוציא את ההוצאה להורג של הסקריפטים שכתוב מותאמת אישית כדי לחלץ גינקולוגיות ולישון התנהגות.
- צור תיקיה חדשה ניסוי בתוך ספריית הבית Cygwin.
- ייבוא הנתונים הגולמיים Unicode מתוך תוכנת מעקב, הפעל את הקובץ .sh ב Cygwin להמיר בקידוד של UTF-16 ל- UTF-8.
- הפעל את הקובץ .perl ב Cygwin כדי לחלץ את הנתונים שינה.
- פתח את הקובץ מאקרו ובצע את ההוראות בתוך הגיליון כדי לסיים את ניתוח הנתונים לפי הצורך.
הערה: רמה בסיסית של קידוד שורת הפקודה יהיה צורך לבצע את החלק הזה של ניתוח. פקודות לינוקס הכללי יהיה מספיק. אם קיימות בעיות עם התוכניות קריאת הנתונים כראוי, לבדוק הנתונים של תוכנת בכל עורך טקסט זמינה בחופשיות מעקב כדי לוודא את הקידוד והוא הסדר הנכון עבור קבצי ההפעלה לכתוב כראוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הזחלים הגילאים ש-4-30 dpf ניתן לרשום בצורה מהימנה במערכת סגורה מותאמת אישית-לבנות המתואר באיור1. המערכת כוללת IR והן תאורה גלויה כדי לאפשר את הקלטות בתנאים כהים ובהירים, בתנאים שונים גלוי אור (איור 1 א'). קטעי וידאו ולאחר מכן נותחה באמצעות תוכנת מעקב (איור 1Bג), שלאחר מעובד באמצעות מאקרו שינה מותאם אישית (ראה להוריד משלימה). הזחל דגים שלוש אוכלוסיות cavefish עצמאית להציג ירידה משמעותית בשינה לעומת דג פני השטח (איור 1D) ו- 20 dpf ולאחר האובדן שינה הוא עקבי לאורך שלבים התפתחותיים. גיל דגים ניתח לשינה היא לעתים קרובות תלויים מניפולציה ניסויית. לדוגמה, mexicanus א לא צורכים מזון ב- 4 ימים, כך ניסויים בחינת אינטראקציות בין שינה האכלה יתרחש בדרך כלל הזחלים בוגרים25. לעומת זאת, morpholinos יעילים רק ב מוקדם פריי (בדרך כלל צעיר יותר 4 dpf) אז בגיל הזה משמש ישבנים שינה24,26,27.
Mexicanus א יכול לחיות עד 30 שנים במעבדה, אך ניסויים באמצעות מבוגרים מבוצעות בדרך כלל בדגים בגילאי 6 חודשים עד 3 שנים. ניתן להקליט דגים במגוון מידות המיכל בהתאם הניסוי ומאפשר תאורת IR להקלטות במהלך תקופות אור וחושך (איור 2 א). ארנס נפרדות מסומנות ב מעקב כדי לאפשר מעקב של דגים, ומספק שלאחר עיבוד באמצעות מאקרו מותאם אישית על הבדיקה של שינה (איור 2Bג). שינה פוחת באופן משמעותי ב- cavefish Pachón Molino, Tinaja, בהשוואה לדגים פני השטח (איור דו-ממדי). בנוסף, מערכת זו מאפשרת הקלטה מרובות דגים בזירה אחת (בדרך כלל גלון 10 טנקים), המאפשר ניתוח של אינטראקציות חברתיות איך להשפיע על השינה (איור 2EF). Robustly דיור חברתי מפחית שינה בדגים השטח, מבלי להשפיע על שינה ב Pachón cavefish (איור 2G). חוסר השפעה של cavefish הוא ככל הנראה בגלל אפקט המרתף, איפה cavefish לישון מעט, בפרט ארנאס גדולים יותר היה לבחון את התנהגות חברתית.
איור 1: הקלטה שינה התנהגות זחל, לנוער א mexicanus. (א) תיאור סכמטי של שינה זחל ההתנהגות כיוונון: זחל ממוקמות על פלטפורמה הכליון הנשלטות על-ידי אור. מערכות תאורה אינפרא אדום ולבן לשבת מתחת הדג בתחתית הצינורית. מצלמת אינפרא-אדום לעבור יושבת בחלק העליון של הצינור ומחובר למחשב נייד שבו נרשם הווידאו. כל מערכות אספקת חשמל (תאורה, מחשב נייד) מחוברים כוח גיבוי. (B) ארנה הגדרות תוכנת מעקב. הזחלים בודדים נשמרים בבארות בצלחת תרביות רקמה, ארנס (ציאן) מיוצרים עבור כל בעל חיים. (ג) רשמים גינקולוגיות ההתנהגות גינקולוגיות דגים, לאחר שרכשה את הנתונים בתוכנת מעקב. סימנים אדומים מייצגים 10 s של פעילות בדגים 20 - בן יום. (ד) Resulting לישון נתונים תוכנת מעקב. Cavefish לנוער מתכנסת על התנהגות שינה מופחתת בהשוואה morphs משטח דגים (One-way ANOVA F(3, 116) = 76.12; Dunnett פוסט-הוק ניתוח הוחלה להשוות כל אוכלוסיית cavefish עם משטח דגים, P < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: למבוגרים mexicanus א מערכת שינה והתנהגות היממה. (א) דיאגרמה של מערכת שינה-הקלטה: דגים מוחזקים טנקים על מתלה מול לאתר מצלמות. מערכת תאורה אינפרא אדום ממוקמת מאחורי מיכלי דגים, ואילו מצלמות IR-מעבר מחוברים למחשב נייד עבור הקלטה התנהגות. כל מערכות אספקת חשמל מחוברים למערכת סוללת גיבוי במקרה של תנודות מתח. ארנה (B) ההתקנה של תוכנת מעקב. דגים בודדים מסומנים על-ידי יצירת נפרד ארנאס (ציאן) כדי לעקוב אחר התנהגות גינקולוגיות. (ג) נציג גינקולוגיות רצועות (קווים אדומים) של דגים בודדים לאחר שרכשה הקלטה התנהגותית על תוכנת מעקב. S מייצגים 20 עקבות של פעילות. משך השינה הכולל (D) מעל 24 שעות פוחת באופן משמעותי בשלוש אוכלוסיות נפרדות של cavefish לעומת דג משטח (One-way ANOVA F(3, 106) = 52.66; Dunnett פוסט-הוק בדיקות הוחלו בין דגים משטח כל האוכלוסייה המערה, P < 0.001). (E) של טנק בודד המכיל מספר דגים אשר אחד ארנה (כתום) נעשית כדי לעקוב אחר אינטראקציות חברתיות ולישון. רשמים גינקולוגיות (F) של דגים מרובות לאחר קירור והקפאה במציאת תוכנה (כל צבע קו מייצג של דגים בודדים). (G) נציג נתונים של פני השטח, Pachón cavefish בשינה חברתית מעקב. משטח דגים להפחית באופן משמעותי את שינה במיכלים 10 L בהשוואה ל- 2 L ארנאס; דגים משטח שינה נוספת מופחתת כאשר דגים שוכנות מבחינה חברתית. Cavefish שינה אינה משתנה באופן משמעותי בכל מצב (דו-כיווני ANOVA F(2,46) = 4.545; ניתוח לאחר הוק בוצעה בתוך כל אוכלוסייה כדי לבחון את ההשפעה של מצב חברתי וגודל המיכל על שינה הכולל 10 L יחיד, P = 0.013; 10 L חברתית, P = 0.0003). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר מערכת מותאמת אישית עבור לכימות שינה ופעילות גינקולוגיות cavefish הזחל ומבוגרים. Cavefish הופיעו כמודל מוביל לימוד האבולוציה של שינה יכול לשמש כדי לחקור את הבסיס הגנטי והעצבים של שינה בתקנה1. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים אופטימיזציה של תאורה, איכות וידאו כדי להבטיח מעקב מדויק זה יש צורך לכמת שינה. המערכת עבור רכישת וניתוח המתוארים כאן פועלים באופן תקין לחלוטין, כמו גם מערכות רבות, מסחרי והן לפי הזמנה, לכמת ומכניקה והתנהגות28,29,30. ניתן להאריך את הבדיקה הקודמת בדיקת שינה בדגים יחיד כדי לאפשר ניתוח של דג שוכן-קבוצה. הוא שיקול משמעותי כאשר וגישה לפתרון בעיות או עיצוב מבחני מבלבל התנהגות חברתית שיש על השינה של הפרט. לדוגמה, תוקפנות היא שכיחה בקרב Astyanax, רמות תוקפנות שונים בין משטח דגים, cavefish31. מיטוב מספר דגים, גודל ארנה, ואת יחס, על מנת למזער את התוקפנות יאפשר למדידות לשחזור של תקנה שינה.
מגבלה של הטכניקה, כפי שתואר, הוא חוסר אמינות בעקבות בודדים ולדגי וזמינותו. מעקב אחר בעלי חיים אוטומטיות לעיתים קרובות תתחלף בעלי חיים כאשר הם באים במגע קרוב. זו ניתן לטפל על ידי אופטימיזציה זהירה של ספי, או על-ידי תיקון באופן ידני כל המתגים. בנוסף, המערכת המתוארת אינה מערכת זרימה דרך, לכן, איכות המים יכול להיות בעיה לאחר הקלטות שנמשך יותר מכמה ימים. אחרים זרימה דרך מערכות תוארו דג זברה13 , אלה יכול בקלות ליישם את השמיעה קול במחסן של cavefish מקסיקני.
המתודולוגיה המתוארת היא משמעותית את תחולתן רחבה כדי למדוד התנהגות זני דגים מגוונות. שינה טרם להתאפיין כמעט כל דג מים ימיים או טריים כולל Sticklebacks, Cichlids של זנב החרב32,33,34. צדדיות של מערכת זו. כדי למדוד את השינה mexicanus א , דגמים דגים אחרים רשאי לפנות שאלות מגוונות על האבולוציה ועל בסיס גנטי של שינה. חומרת הקשורים במערכת זו הוא מאוד חסכוני, שהופך אותו הפוטנציאל מאוד נגיש, מתן תפוקה גבוהה ניתוח של תרופתי וניתוח ecotoxilogical שינה ופעילות גינקולוגיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שיש להם אין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי פרס NIGMS GM127872 ACK, פרס NINDS 105072 ERD ולאחר אישור NSF פרס 1656574 אק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 V power adaptor | Environmental Lights | 24 Watt 12 VDC Power Supply | |
| Acrylic dividers (adults) | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Adult infrared light power source | Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply | ||
| Battery pack | CyberPower | CP850PFCLCD | |
| Camera lens (adult) | Navitar Zoom 7000 | Zoom 7000 | |
| Camera lens (larval) | Fujian 35mm f/1.7 | B01CHX7668 | Purchase on Amazon |
| Camera lens adapter | d | 1524219 | |
| Camera mount | CowboyStudio Super Clamp | B002LV7X1K | Purchase on Amazon |
| Fish tank | Deep Blue Professional | ADB11006 | |
| Heat sink (adult) | M-D Building products | SKU: 61085 | Cut to fit |
| Heat sink (larval) | M-D Building products | SKU: 57000 | Cut to fit |
| Infrared lights (adults) | Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip | irrf850-5050-60-reel | Cut to fit |
| Infrared lights (larval) | LED World | B00MO9H7H4 | Purchase on Amazon |
| IR-diffusing acrylic | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Laptop/computer | N/A | N/A | Any laptop will work. |
| LED light | Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) | B06XKTRSP7 | Use with Chanzon 25 pcs 1 W, 3 W, 5 W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel |
| light timer | Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded | ||
| Plastic wall mount for IR | Everbilt Plastic pegboard | Model # 17961 | |
| Power cable | BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire | B01K4RPE0Y | |
| Power source | Rapid LED | MOONLIGHT DRIVER (350MA) | |
| Tissue culture plates | Fisherbrand | 12-well (FB012928) 24-well (FB012929) | |
| Tripod Ball head | Demon DB-44 | B00TQ54CZO | Purchase on Amazon |
| USB Hardrive | Seagate 3TB backup | STDT3000100 | |
| USB Webcam | Microsoft LifeCam | Q2F-00014 | Purchase on Amazon |
| Wall mount for camera | LDR Industries 1/2" Steel pipe | 307 12X36 | Mounted on wall with Flange and 90° pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera. |
References
- Keene, A. C., Duboue, E. R. The origins and evolution of sleep. The Journal of Experimental Biology. , (2018).
- Joiner, W. J.
- Allada, R., Siegel, J. M.
- Sehgal, A., Mignot, E. Genetics of sleep and sleep disorders. Cell. 146, 194-207 (2011).
- Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep: a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8, 269-300 (1984).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
- Geissmann, Q., Rodriguez, L. G., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. Ethoscopes: An Open Platform For High-Throughput Ethomics. bioRxiv. , 113647 (2017).
- Garbe, D. S., et al. Context-specific comparison of sleep acquisition systems in Drosophila. Biology Open. 4 (11), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Gilestro, G. F., Cirelli, C. PySolo: A complete suite for sleep analysis in Drosophila. Bioinformatics. 25, 1466-1467 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6, 451-457 (2009).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science (New York, N.Y.). 327, 348-351 (2010).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, (2015).
- Chiu, C. N., Prober, D. A. Regulation of zebrafish sleep and arousal states: current and prospective approaches. Frontiers in Neural Circuits. 7 (April), 58 (2013).
- Elbaz, I., Foulkes, N. S., Gothilf, Y., Appelbaum, L. Circadian clocks, rhythmic synaptic plasticity and the sleep-wake cycle in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21, 671-676 (2011).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Jeffery, W. R.
- Gross, J. B.
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9688 (2015).
- Jaggard, J., et al. The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Journal of Experimental Biology. 220 (2), (2017).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. , e32637 (2018).
- Hinaux, H., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pacho ´n Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., La Schimmenti,, Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. Plos One. 8 (11), e80823 (2013).
- Yokogawa, T., et al. Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants. PLoS Biology. 5, 2379-2397 (2007).
- Appelbaum, L., et al. Sleep-wake regulation and hypocretin-melatonin interaction in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21942-21947 (2009).
- Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. eLife. 4 (September), (2015).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Bell, M. A., Foster, S. A. The evolutionary biology of the threespine stickleback. 584, Oxford University Press. Available from: http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1 (1994).
- Seehausen, O. African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research. Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).
- Basolo, A. L. Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish. Science. 250, 808-810 (1990).
