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Behavior

मैक्सिकन Cavefish में नींद और चलन गतिविधि के स्वचालित माप

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/59198
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 2,3, 1,2
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

Summary

इस प्रोटोकॉल का विवरण गतिगत व्यवहार बढ़ाता और मैक्सिकन cavefish में नींद के लिए कार्यप्रणाली । पिछले विश्लेषण सामाजिक रूप से घर में मछली में इन व्यवहारों को मापने के लिए विस्तारित कर रहे हैं । इस प्रणाली को व्यापक रूप से अंय मछली प्रजातियों में नींद और गतिविधि का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Abstract

phyla भर में, नींद अत्यधिक संरक्षित व्यवहार विशेषताओं है कि ऊंचा उत्तेजित थ्रेशोल्ड शामिल की विशेषता है, नींद अभाव के बाद खुशहाली लौटने लगी, और व्यवहार गतिहीनता की समेकित अवधि. मैक्सिकन cavefish, astyanax mexicanus (एक. mexicanus), पर्यावरण क्षोभ के जवाब में विशेषता विकास का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल है । ए mexicanus आंखों की सतह पर निवास रूपों और कई अंधा गुफा में रहने वाले आबादी है कि मजबूत रूपात्मक और व्यवहार मतभेद है के रूप में मौजूद हैं । सो हानि कई में हुई है, स्वतंत्र रूप से विकसित cavefish आबादी । यह प्रोटोकॉल एक. mexicanus गुफा और सतह मछली में नींद और चलन गतिविधि बढ़ाता के लिए एक पद्धति का वर्णन है । एक लागत प्रभावी वीडियो निगरानी प्रणाली एक सप्ताह या उससे अधिक समय के लिए व्यक्तिगत रूप से घर का लारवाल या वयस्क मछली के व्यवहार इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । इस प्रणाली में 4 दिनों की आयु के बाद वयस्कता के माध्यम से निषेचन के बाद मछली को लागू किया जा सकता है । दृष्टिकोण भी एक ही क्षेत्र में कई मछली रिकॉर्डिंग द्वारा नींद पर सामाजिक बातचीत के प्रभाव को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । व्यवहार रिकॉर्डिंग के बाद, डेटा स्वचालित ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया है और नींद विश्लेषण अनुकूलित लिपियों कि अवधि, मुक्केबाज़ी लंबाई, और मुक्केबाज़ी संख्या सहित कई नींद चर यों तो का उपयोग कर संसाधित है । इस प्रणाली के लिए, zebrafish और sticklebacks सहित लगभग किसी भी मछली प्रजातियों में नींद, circadian व्यवहार, और चलन गतिविधि को मापने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

नींद अत्यधिक शारीरिक, कार्यात्मक, और व्यवहार के स्तर1,2,3पर पशु किंगडम भर में संरक्षित है । जबकि स्तनधारी प्रयोगशाला जानवरों में नींद आम तौर पर electroencephalograms का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाता है, electroशरीरक्रियात्मक रिकॉर्डिंग छोटे आनुवंशिक रूप से नवागत मॉडल सिस्टम में कम व्यावहारिक हैं और इस प्रकार सो आम तौर पर व्यवहार के आधार पर मापा जाता है3 , 4. व्यवहार नींद के साथ जुड़े विशेषताओं अत्यधिक पशु किंगडम भर में संरक्षित कर रहे हैं और वृद्धि हुई कामोत्तेजना दहलीज, उत्तेजना के साथ प्रतिवर्त्यता, और लंबे समय तक व्यवहार वैराग्य5शामिल हैं. इन उपायों से मनुष्य के माध्यम से नेमेटोड कृमि, सी. एलिगेंससे लेकर पशुओं में सोने की विशेषता का प्रयोगकिया जा सकता है ।

व्यवहार की quiescence के उपयोग के लिए नींद की विशेषता स्वचालित ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर की आवश्यकता है । ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के साथ, गतिविधि की अवधि और गतिहीनता दिनों की एक संख्या से अधिक निर्धारित कर रहे हैं, और निष्क्रियता की लंबी अवधि के रूप में वर्गीकृत कर रहे है सो7,8। हाल के वर्षों में, छोटे आनुवंशिक रूप से नवागत मॉडल प्रणालियों की विविधता के बीच गतिविधि डेटा प्राप्त करने के लिए मल्टीपल ट्रैकिंग सिस्टम विकसित किए गए हैं; जिनमें कीड़े, फल मक्खियां और मछली9,10,11शामिल हैं । इन प्रोग्रामों को सॉफ्टवेयर है कि दोनों खुला स्रोत फ्रीवेयर और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर सहित पशु व्यवहार के स्वचालित ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है के साथ कर रहे है7,12,13,14 . इन पद्धतियों उनके लचीलेपन में अलग और कुशल स्क्रीनिंग और कई आनुवंशिक रूप से संशोधनीय मॉडलों में नींद phenotypes के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं ।

zebrafish में नींद की आनुवंशिक जांच, danio rerio, कई जीन और तंत्रिका सर्किट कि नींद15,16को विनियमित की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है । हालांकि यह एक कशेरुका प्रयोगशाला जानवर में नींद के तंत्रिका आधार की जांच के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान की गई है, बहुत कम कैसे नींद विकसित और कैसे प्राकृतिक भिन्नता के नियमन के लिए सोने का योगदान के बारे में जाना जाता है । मैक्सिकन cavefish, Astyanax mexicanus (ए। mexicanus), नींद, चलन गतिविधि और circadian लय17,18में नाटकीय मतभेदों को विकसित किया है । इन मछलियों के रूप में मौजूद सतह मछली कि मेक्सिको और दक्षिणी टेक्सास की नदियों में निवास करता है और कम से 29 पूर्वोत्तर मेक्सिको के सिएरा डेल abra क्षेत्र के आसपास गुफा आबादी19,20,21। उल्लेखनीय है, कई व्यवहार मतभेद, सोने की हानि सहित, के लिए कई cavefish आबादी14,22में स्वतंत्र रूप से उभरा दिखाई देते हैं । इसलिए, cavefish नींद के अभिसरण विकास की जांच के लिए एक मॉडल प्रदान करते हैं, circadian, और सामाजिक व्यवहार ।

यह प्रोटोकॉल एकमें नींद और चलन व्यवहार को मापने के लिए एक प्रणाली का वर्णन करता है । mexicanus लार्वा और वयस्कों । एक कस्टम निर्मित अवरक्त आधारित रिकॉर्डिंग प्रणाली प्रकाश और अंधेरे की स्थिति के तहत जानवरों की वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कस्टम मैक्रोज़ निष्क्रियता के कई पहलुओं की मात्रा और नींद की अवधि निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है । यह प्रोटोकॉल भी एक टैंक के भीतर कई जानवरों की गतिविधि पर नज़र रखने के लिए प्रयोगात्मक संशोधनों का वर्णन, नींद और सामाजिक व्यवहार के बीच बातचीत की जांच करने की क्षमता प्रदान. इन प्रणालियों के लिए, zebrafish और sticklebacks सहित अतिरिक्त मछली प्रजातियों में नींद, circadian व्यवहार, और चलन गतिविधि को मापने के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Protocol

नोट: लार्वा और वयस्कों में व्यवहार ट्रैकिंग के लिए सिस्टम सेट करें.

1. लार्वा के लिए नींद प्रणाली का निर्माण

नोट: किशोर मछली के माध्यम से लार्वल पर नज़र रखने के लिए निगरानी प्रणाली 4 दिनों के बाद निषेचन (dpf) 30 dpf के माध्यम से एक. mexicanus अवरक्त (ir) प्रकाश, एक्रिलिक ir प्रकाश diffusers, स्वचालित प्रकाश सहित उपकरणों के कई टुकड़ों की आवश्यकता है नियंत्रण (टाइमर), कंप्यूटर, कैमरा, और द्वितीयक सामग्री जैसे तारों और पावर नियंत्रकों (चित्र 1a) । निंनलिखित निर्देश सूचित करेंगे कि कैसे एक प्रणाली का निर्माण करने के लिए सही चलन को ट्रैक करने के लिए और लार्वा ए mexicanus में सोने circadian लय अध्ययन ।

  1. एक प्रकाश IR और सफेद प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) के निर्वाचकगण प्रणाली का निर्माण: एक त्रिकोण में तीन IR रोशनी जगह एक दूसरे से लगभग ७.६२ सेमी एक ३०.५ सेमी x ३०.५ सेमी पतली धातु मंच हीट सिंक पर । बिजली के तार के साथ श्रृंखला में तार रोशनी और एक शक्ति के स्रोत से कनेक्ट ।
  2. तीन IR रोशनी के केंद्र में एलईडी एक एकल सफेद प्रकाश प्लेस और उंहें सत्ता के स्रोत के लिए देते हैं ।
  3. एलईडी के लिए एक प्रकाश टाइमर एक मानक circadian समय सेट करने के लिए शक्ति का स्रोत कनेक्ट करें ।
  4. लार्वल ट्रैकिंग प्रणाली के लिए एक मंच का निर्माण । मंच के सभी घटकों के लिए ०.३३ सेमी मोटी सफेद साइन एक्रिलिक का प्रयोग करें ।
  5. प्रकाश स्क्वायर हीट सिंक जिस पर एरेना मछली युक्त व्यवहार ट्रैकिंग के दौरान निवास करेंगे के शीर्ष पर रिकॉर्डिंग मंच प्लेस ।
  6. रोशनी और जानवरों के बीच बॉक्स के अंदर एक दूसरे एक्रिलिक प्लेस इष्टतम प्रकाश और इसके विपरीत के लिए IR फैलाना ।
    नोट:     लार्वा प्रकाश बॉक्स के लिए आयाम निंनानुसार है: २ १८ सेमी x ८.५ सेमी और २ १७ सेमी x ८.५ सेमी एल ई डी कि रासायनिक एक साथ बंधुआ रहे है एक 18 सेमी x 18 सेमी वर्ग है कि ८.५ सेमी लंबा है फार्म । इसके अतिरिक्त, एक्रिलिक आसानी से काटा जा सकता है या अनुकूलित नौकरशाही का आकार घटाने के लिए उचित उपकरण का उपयोग कर drilled ।
    1. एक संलग्न प्लास्टिक ट्यूब के भीतर पूरे लार्वा ट्रैकिंग स्टेज और प्रकाश सेटअप प्लेस, और फिर ट्यूब के शीर्ष पर कैमरे की स्थिति ।
      नोट: यह ट्रैकिंग वीडियो पर प्रदर्शित होने से प्रकाश प्रतिबिंब रखने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में इस सटीकता ट्रैकिंग ख़राब होगा । एक ट्यूब है कि चारों ओर के मंच के शीर्ष पर कैमरों की नियुक्ति कैमरों कि इन प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है के लिए प्रकाश और तीखेपन में सुधार ।
  7. एक वेब कैमरा में हेरफेर ( सामग्री की मेजदेखें) आईआर आधारित रिकॉर्डिंग के लिए । एक रोटरी उपकरण का उपयोग कर निर्माता लेंस निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  8. आंतरिक आवास को हटाने के लिए कैमरे के पीछे पक्षों पर छोटे चांदी शिकंजा निकालें ।
  9. लेंस के शेष को ढीला करने के लिए कैमरे के शरीर के अंदर छोटे काले शिकंजा निकालें । एक छोटे से पेचकश का प्रयोग लेंस आवास है कि लेंस काटने के बाद छोड़ दिया है के किसी भी भाग को हटा दें ।
  10. चार्ज युग्मित डिवाइस (सीसीडी) आवास के शीर्ष भाग पर नीले एलईडी निकालें ।
  11. कैमरा वापस अपने मूल अभिविंयास को आंतरिक आवास वापस रखकर और दो चांदी शिकंजा पंगा लेना वापस अपने मूल स्थिति को एक साथ रखो ।
  12. एक छोटे से एक गोल प्लास्टिक रूटिंग बिट के साथ फिट करने के लिए देखा का उपयोग कर कैमरे के अंदर रूट । अतिरिक्त प्लास्टिक नीचे चिकनी जब तक यह एक लेंस एडाप्टर फिट कर सकते हैं ।
  13. कैमरे के साथ सीधे संपर्क करने के बिना संभव के रूप में सीसीडी के करीब के रूप में कैमरे के अंदर एक आईआर पास फिल्टर स्थापित करें ।
    नोट: कैमरा के आवास के भीतर सीसीडी चिप को नुकसान नहीं करने के लिए ध्यान रखना । संभव के रूप में स्तर के रूप में कटौती रखने के लिए सुनिश्चित करें । IR फिल्टर और कैमरे के शरीर के बाहर के बीच किसी भी खुली जगह सील फ़िल्टर किया जा रहा बिना सीसीडी तक पहुंचने से प्रकाश रखने के लिए ।
  14. कैमरा एक ३५ मिमी फिक्स्ड लेंस के लिए संलग्न ( सामग्री की मेजदेखें) लेंस के पीछे में कैमरे के सामने अनुकूलक पंगा लेना द्वारा ।
  15. छेद में कैमरा और लेंस ट्यूब के शीर्ष पर ढक्कन में drilled है कि मंच और रोशनी घरों और कंप्यूटर के लिए यूएसबी संलग्न से दर्ज किया जाएगा ।
    नोट: एक व्यवहार कक्ष है कि जहां से शेयर मछली व्यवहार रिकॉर्डिंग के दौरान ंयूनतम अवरोधों को सुनिश्चित करने के लिए रखे है अलग है में मछली प्लेस । तापमान और वेंटिलेशन में उतार चढ़ाव को कम करने के लिए ध्यान रखना जो व्यवहार प्रयोगों को सीमित कर सकते हैं ।

वयस्कों के लिए 2. Sleep प्रणाली

  1. लगभग ४६ सेमी अंतराल के लिए IR स्ट्रिप्स काटने से वयस्क मछली पर नज़र रखने के लिए एक IR प्रकाश व्यवस्था का निर्माण । १ ४६ सेमी पट्टी प्रत्येक 10 एल व्यवहार टैंक के लिए पर्याप्त है ।
  2. एक श्रृंखला में एक साथ एक पट्टी वायर, डीसी बिजली के तार के लिए प्रत्येक पट्टी टांका और एक 9 वी शक्ति स्रोत के लिए देते हैं ।
  3. एक हीट सिंक के रूप में कार्य करेगा कि एल्यूमीनियम के एक ५१ सेमी एक्स ५.१ सेमी टुकड़ा करने के लिए प्रत्येक आईआर पट्टी संलग्न करें ।
  4. एक ४६ सेमी x 5 सेमी, ०.३२ सेमी मोटी 9% प्रकाश-पास सफेद साइन एक्रिलिक शीट सीधे प्रत्येक IR प्रकाश पट्टी के सामने आईआर प्रकाश फैलाना करने के लिए जगह है ।
  5. रियर-घुड़सवार IR प्रकाश का समर्थन करता है कि एक रैक पर सभी टैंकों प्लेस ।
  6. व्यक्तिगत एरेनस बनाने के लिए 10 एल ग्लास टैंक में अपारदर्शी प्लास्टिक डिवाइडर का उपयोग करें ।
    नोट: अखाड़ा आकार इस्तेमाल किया और टैंक के आकार के डिवाइडर की संख्या के आधार पर अलग किया जा सकता है । अखाड़ा आकार गतिज गतिविधि और दोनों गुफा और सतह मछली में नींद23।
  7. माउंट कैमरों टैंक से लगभग 4-6 मीटर दूर । प्रत्येक कैमरा आमतौर पर ट्रैकिंग के लिए पर्याप्त समाधान प्रदान करने के लिए एक समय में 3 टैंकों से रिकॉर्ड कर सकते हैं ।
    नोट: वयस्क व्यवहार रिकॉर्डिंग आम तौर पर दिन रात परिवर्तन को नियंत्रित करने के लिए एक अलग सफेद प्रकाश व्यवस्था की आवश्यकता नहीं है । बस एक व्यवहार एक टाइमर से जुड़े कमरे में मानक उपरि रोशनी का उपयोग करने के लिए पर्याप्त होने की संभावना है ।

3. रिकॉर्डिंग चलन गतिविधि

नोट: सभी व्यवहार रिकॉर्डिंग एक मानक लैपटॉप कंप्यूटर या एक बैकअप बैटरी स्रोत के साथ डेस्कटॉप का उपयोग किया जाता है । एक 24 h रिकॉर्डिंग (60-100 GB) की बड़ी फ़ाइल आकार के कारण, बाहरी हार्ड ड्राइव पर सभी रिकॉर्डिंग को सहेजें ।

  1. रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले 18-24 h के लिए मछली उंर 4-30 dpf Acclimate । फ़ीड लारवल मछली लाइव नमकीन चिंराट के साथ जब पहली रिकॉर्डिंग कक्ष में रखा है, और 1 एच रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले । Acclimate वयस्क मछली 4-5 व्यवहार रिकॉर्डिंग से पहले दिन और एक बार परत खाना या लाइव ब्लैकवॉर्म के साथ दैनिक फ़ीड ।
    नोट: ताजा पानी में लार्वा मछली जगह करने के लिए रिकॉर्डिंग से पहले सुनिश्चित करें, के रूप में बचे हुए नमकीन चिंराट बाद में विश्लेषण के दौरान मुद्दों पर नज़र रखने का कारण होगा । रोटीफर्स के साथ सह-culturing एक वैकल्पिक विकल्प प्रदान करता है, के रूप में उनके छोटे आकार ट्रैकिंग के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है ।
  2. प्लेस मछली 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों में 4-6 dpf आयु वर्ग । घर में मछली की आयु 20-30 dpf 12-अच्छी तरह से रिकॉर्डिंग के लिए ऊतक संस्कृति प्लेटें ।
  3. 10 एल टैंक में रिकॉर्ड वयस्कों के लिए डिवाइडर के साथ फिट पांच व्यक्तिगत रूप से घर में मछली को समायोजित करने के लिए, या डिवाइडर के बिना एक सामाजिक सेटिंग में नींद और गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए ।
    नोट: देखभाल करने के लिए कैमरे ध्यान केंद्रित करने के लिए रिकॉर्डिंग की शुरुआत करने से पहले क्रम में सटीकता ट्रैकिंग अधिकतम करने के लिए ले लो । कैमरा लेंस के आईरिस बहुत दूर मत खोलो, क्योंकि यह तेजी से छवि के तेज कम हो जाएगा । वहां एक संतुलन है, लेकिन; यदि आईरिस बहुत दूर तक बंद है, तो वीडियो की फ़्रेम दर १५.०० एफपीएस से नीचे गिर जाएगी । यह बाद में विश्लेषण के लिए आवश्यक है कि फ्रेम दर कुछ कस्टम-लिखा नींद स्क्रिप्ट23,24के साथ उपयोग के लिए प्रति s १५.०० फ्रेम रहता है ।
  4. प्रकाश/चमक पृष्ठभूमि illuminations सेट करें ।
  5. रिकॉर्डिंग की शुरुआत करने से पहले प्रकाश का अनुकूलन । हमेशा उच्चतम संभव स्तर पर विपरीत रखने के लिए और चमक और पृष्ठभूमि रोशनी का उपयोग करने के लिए पशुओं को सबसे स्पष्ट है जब तक चमक समायोजित करें ।
  6. 24 या ४८ एच के लिए रिकॉर्ड मछली ।
    नोट: आपातकालीन बैकअप बैटरी पैक है कि बिजली सभी प्रकाश व्यवस्था, कंप्यूटर, और कैमरों बिजली outages के मामले में खरीदा जाना चाहिए । सभी बैटरी पैक भी आपात बिजली दुकानों में खामियों को दूर किया जाना चाहिए, यदि संभव हो तो । बैटरी पैक आम तौर पर अधिक से अधिक एक घंटे के लिए कुछ मिनट से अधिक के लिए उपकरणों की शक्ति नहीं होगा और मुख्य शक्ति खोने और आपातकालीन शक्ति प्रणाली को स्थानांतरित करने के बीच पुल की सेवा ।

4. स्वचालित ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर व्यक्तिगत घर में मछली में चलन गतिविधि का विश्लेषण

  1. व्यवहार का विश्लेषण शुरू करने के लिए, ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर खोलें, टेम्पलेट से नए प्रयोगका चयन करें, फिर पूर्व-निर्धारित टेम्पलेट लागूकरें चुनें.
  2. कार्यक्रम के रूप में अब क्या प्रजातियों को ट्रैक करने के लिए, मछलीका चयन पूछना होगा । प्रयोग ड्रॉपडाउन बॉक्स का चयन करने के लिए या तो Zebrafish वयस्क के Zebrafish लार्वा प्रायोगिक प्रतिमान के आधार पर ।
  3. एरेना की स्थापना करें जिसमें प्रत्येक जानवर को ट्रैक किया जाएगा । लार्वा के लिए, अच्छी तरह से थाली, गोल अच्छी तरह से और कोई क्षेत्र टेम्पलेटका चयन करें । वयस्कों के लिए, खुला क्षेत्र, कोई क्षेत्र टेम्पलेटके साथ वर्ग का उपयोग करें । फिर एरेनस की उचित संख्या निर्धारित करते हैं, प्रत्येक जानवर के लिए एक वीडियो में ट्रैक किया जा रहा है ।
  4. इष्टतम ट्रैकिंग के लिए मॉडल का चयन करें, ट्रैक केंद्र पर क्लिक-प्वाइंट, और यकीन है कि पशु रंग पृष्ठभूमि से गहरा हो चुना है । वह फ़्रेम दर लागू करें जिस पर वीडियो प्राप्त किया गया था । ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से यह पता लगाना चाहिए ।
  5. सही क्षेत्र सेटिंग्सका उपयोग कर मछली के चलन व्यवहार का निर्धारण करने के लिए एक वस्तु की वास्तविक दुनिया दूरी जांचना करने के लिए एक पैमाने ड्रा ।
  6. यह सुनिश्चित करने के लिए एरेना संपादित करें कि मछली के पूरे क्षेत्र को ट्रैक किया जाएगा; अन्यथा अधिग्रहण के दौरान नमूने गुम हो जाएंगे ।
    नोट: क्षेत्रों की स्थापना करते समय देखभाल का उपयोग करें । लार्वा मछली विशेष रूप से त्रुटियों पर नज़र रखने के लिए संवेदनशील होते हैं यदि एरेना या तो बहुत बड़े या छोटे होते हैं । प्रयोग में खराब प्रकाश व्यवस्था भी अच्छी तरह से प्लेटों की दीवारों पर छाया बना सकते हैं, जो कार्यक्रम सोच सकते हैं एक जानवर है, एक झूठी सकारात्मक बनाने.
  7. उंनतपर क्लिक करें । विधि का पता लगाने में सेटिंगके अंतर्गत, गतिशील घटावका चयन करें, और फिर पृष्ठभूमि पर क्लिक करें और सीखने शुरूका चयन. जानवरों को अच्छी तरह से ट्रैक किया जा रहा है जब तक अंधेरे विपरीत संकेत/शोर अनुपात समायोजित करें, और पृष्ठभूमि कूदने के लिए ट्रैकिंग का कारण नहीं है ।
    नोट: वीडियो की गुणवत्ता प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकती है, इसलिए प्रत्येक परीक्षण को भिन्न सेटिंग्स का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है, तदनुसार. विषय समोच्च और विषय आकार सुविधाओं का उपयोग काफी ट्रैकिंग परिणामों में सुधार कर सकते हैं ।
  8. परीक्षण सूची का चयन करें और कार्यक्रम में डेटा रिकॉर्ड करने के लिए शुरू करने से पहले उचित मापदंडों लोड ।
  9. प्राप्ति टैब में क्लिक करें, सभी नियोजित परीक्षणों को ट्रैक करें और रिकॉर्ड बटन पर क्लिक करें चुनें.
  10. विश्लेषण प्रोफ़ाइलके अंतर्गत, सुनिश्चित करें कि दूरी और समय & आंदोलन चयनित हैं.
    नोट: बाद में स्लीप विश्लेषण के लिए आदेश में, यह महत्वपूर्ण है कि ये सेटिंग्स सही हैं, के रूप में. perl फ़ाइल स्लीप की गणना करने के लिए सही क्रम में इन डेटा पढ़ना चाहिए ।
  11. निर्यात करें के अंतर्गत, Raw डेटाचुनें, डेटा को यूनिकोड पाठ के रूप में निर्यात करना.

5. ट्रैकिंग सामाजिक घर मछली

  1. ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर में प्रयोग सेट अप करने के लिए 4.1-4.4 चरणों का पालन करें.
  2. ड्रॉपडाउन मेनू में, प्रयोग के लिए ट्रैक करने के लिए कितने जानवरों का चयन करें.
  3. अखाड़ा सेटिंग्स में, वास्तविक दुनिया दूरी जांचना करने के लिए सही पैमाने पर आकर्षित ।
  4. पता लगाने सेटिंग्स में, गतिशील घटावका उपयोग करें, और सबसे अच्छा जानवर ट्रैक करने के लिए अंधेरे विपरीत समायोजित ।
  5. खोज सेटिंग्स के अंतर्गत विषय आकार समायोजित करें, ताकि केवल पशु का एक बहुत छोटा भाग ट्रैक है ।
    नोट: केवल जानवर के एक छोटे से हिस्से पर नज़र रखने से, यह पशुओं के बीच स्विचन की राशि कम हो जाएगा जब वे अधिग्रहण के दौरान रास्तों को पार ।
  6. एक बार पटरियों अधिग्रहण कर रहे हैं, मैन्युअल रूप से जहां मछली रास्तों पार कर सकते हैं समय तय करने के लिए ट्रैक संपादक का उपयोग करें.

6. गतिप्रेरक गतिविधि से नींद डेटा का निष्कर्षण

नोट: दोनों लार्वा और वयस्क में नींद की व्यवहार परिभाषा एक. mexicanus 1 मिनट या अधिक के quiescence है । यह परिभाषा कामोत्तेजना दहलीज प्रयोगों, जहां एक अधिक संवेदी उत्तेजना एक सो राज्य (> 60 एस) में एक व्यवहार प्रतिक्रिया शुरू करने की आवश्यकता है का उपयोग कर निर्धारित किया गया था14जागने,17की तुलना में । छोटे आंदोलनों और मछली प्रजातियों के लिए आम बहती के लिए खाते के लिए, वहाँ वेग थ्रेसहोल्ड शोर या बहाव से वास्तविक आंदोलन को अलग करने के लिए लागू कर रहे हैं । इन थ्रेसहोल्ड की दूरी और नींद की अवधि के बीच correlations की तुलना करने के लिए उच्चतम R चुकता मूल्यों को खोजने के द्वारा परिकलित कर रहे हैं; जिससे आंदोलन और नींद के लिए सबसे सटीक वेग का निर्धारण । लार्वा मछली के लिए ऊपरी और निचली सीमाएं दोनों 12 मिमी की होती हैं क्योंकि इसमें कोई बहाव नहीं होता है । वयस्क मछली के लिए बहाव के लिए खाते में 4 सेमी/एस की ऊपरी सीमा के साथ निचली सीमा 2 सेमी/है ।

  1. विश्लेषण कंप्यूटर के लिए Cygwin स्थापित करने के लिए कस्टम-लिखित लिपियों के निष्पादन बाहर ले जाने के लिए चलन और नींद व्यवहार निकालने के लिए ।
  2. Cygwin होम निर्देशिका के भीतर एक नया प्रयोग फ़ोल्डर बनाएं ।
  3. कच्चे यूनिकोड डेटा ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर से आयात करें और Cygwin में. sh फ़ाइल को utf-16 से एंकोडिंग को UTF-8 में कनवर्ट करने के लिए निष्पादित करें ।
  4. नींद डेटा को निकालने के लिए Cygwin में. perl फ़ाइल निष्पादित करें ।
  5. मैक्रो फ़ाइल खोलें और इच्छित के रूप में डेटा विश्लेषण को अंतिम रूप देने के लिए स्प्रेडशीट में निर्देशों का पालन करें ।
    नोट: कमांड लाइन कोडिंग के एक बुनियादी स्तर के विश्लेषण के इस हिस्से को पूरा करने के लिए आवश्यक हो जाएगा । जनरल लिनक्स आज्ञाओं पर्याप्त होगा । यदि डेटा ठीक से पढ़ने के कार्यक्रमों के साथ मुद्दों रहे हैं, किसी भी स्वतंत्र रूप से उपलब्ध पाठ संपादक में ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर से डेटा की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि एंकोडिंग और आदेश निष्पादकयोग्य के लिए सही है ठीक से लिखना ।

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Representative Results

लार्वा उंर 4-30 dpf मज़बूती से कस्टम निर्माण बंद चित्रा 1में वर्णित प्रणाली में दर्ज किया जा सकता है । प्रणाली दोनों IR और दृश्य प्रकाश व्यवस्था के लिए प्रकाश और अंधेरे शर्तों के तहत रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देने के लिए, विभिंन दृश्य प्रकाश शर्तों के तहत शामिल है (चित्रा 1a) । वीडियो तो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे है (चित्र 1b, सी) और पोस्ट-एक कस्टम सो मैक्रो का उपयोग कर संसाधित ( पूरक डाउनलोडदेखें) । तीन स्वतंत्र cavefish आबादी से लार्वा मछली सतह मछली (चित्रा 1 डी) और 20 dpf की तुलना में नींद में एक महत्वपूर्ण कमी प्रदर्शित करते हैं, और इस नींद की हानि विकासात्मक चरणों में सुसंगत है । सोने के लिए विश्लेषण मछली की उंर अक्सर प्रयोगात्मक हेरफेर पर निर्भर है । उदाहरण के लिए, एक. mexicanus 4 दिन में भोजन का उपभोग नहीं करते हैं, तो नींद और भोजन के बीच बातचीत की जांच प्रयोगों आम तौर पर पुराने लार्वा25में हो जाएगा । इसके विपरीत, morpholinos केवल जल्दी भून में प्रभावी रहे हैं (आमतौर पर छोटे से 4 dpf) तो इस उंर के गधे24,26,27सोने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

ए mexicanus प्रयोगशाला में 30 साल तक के लिए रह सकते हैं, लेकिन प्रयोग वयस्कों का उपयोग आमतौर पर मछली में प्रदर्शन कर रहे है 6 महीने से 3 साल की उंर । मछली प्रयोग और IR प्रकाश के आधार पर टैंक आकार की एक किस्म में दर्ज किया जा सकता है प्रकाश और अंधेरे अवधि के दौरान रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है (चित्रा 2A) । व्यक्तिगत एरेना ट्रैकिंग में मछली की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देने के लिए लेबल कर रहे हैं, और एक कस्टम मैक्रो का उपयोग कर पोस्ट-प्रोसेसिंग एक readout की नींद प्रदान करता है (चित्रा 2B, C). सोने की सतह मछली (चित्र 2 डी) की तुलना में, Pachón, molino, और तिनाजा cavefish में काफी कम है । इसके अलावा, इस प्रणाली को एक ही क्षेत्र (आमतौर पर 10 गैलन टैंक) में एकाधिक मछली रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है, कैसे सामाजिक बातचीत के विश्लेषण के लिए अनुमति नींद (चित्रा 2E, एफ) को प्रभावित करते हैं । सामाजिक आवास robustly की सतह मछली में सोने को कम कर देता है, Pachón cavefish में नींद को प्रभावित किए बिना (चित्रा 2 जी) । cavefish में प्रभाव की कमी की संभावना एक तहखाने प्रभाव के कारण है, जहां cavefish थोड़ा सो, विशेष रूप से बड़े एरेना में सामाजिक व्यवहार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया ।

Figure 1
चित्रा 1: लारवल और किशोर ए mexicanus में नींद व्यवहार रिकॉर्डिंग । (क) लार्वा स्लीप व्यवहार सेटअप की योजनाबद्ध: लार्वा को हल्के नियंत्रित ट्यूब के भीतर एक प्लेटफॉर्म पर रखा जाता है । अवरक्त और सफेद प्रकाश व्यवस्था ट्यूब के तल पर मछली के नीचे बैठते हैं । एक आईआर-पास कैमरा ट्यूब के शीर्ष पर बैठता है और एक लैपटॉप है जिस पर वीडियो दर्ज किया गया है से जुड़ा है । सभी संचालित सिस्टम (प्रकाश और लैपटॉप) बैकअप सत्ता में खामियों को दूर कर रहे हैं । (ख) ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर में एरिना सेटिंग्स । व्यक्तिगत लार्वा एक ऊतक संस्कृति थाली में कुओं में रखा जाता है, और एरेनस (सियान) प्रत्येक जानवर के लिए किए जाते हैं । (ग) ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर में डाटा प्राप्त करने के बाद मछली चलन व्यवहार का चलन । लाल निशान 20 दिन पुरानी मछली में गतिविधि के 10 एस का प्रतिनिधित्व करते हैं । (घ) सॉफ्टवेयर ट्रैकिंग से परिणामी स्लीप डेटा । किशोर cavefish सतह मछली morphs (एक तरह से ANOVA एफ (3, ११६) = ७६.१२ की तुलना में कम नींद व्यवहार पर एकाग्र; ड्यूनेट पोस्ट-हॉक विश्लेषण सतह मछली, पी < ०.००१) के साथ प्रत्येक cavefish जनसंख्या की तुलना करने के लिए लागू किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: वयस्क A. नींद और circadian व्यवहार के लिए mexicanus प्रणाली । (क) स्लीप रिकॉर्डिंग प्रणाली का आरेख: मछली कैमरों ट्रैकिंग के विपरीत एक रैक पर टैंकों में आयोजित कर रहे हैं । एक अवरक्त प्रकाश व्यवस्था मछली टैंक के पीछे रखा गया है, जबकि IR-पास कैमरों रिकॉर्डिंग व्यवहार के लिए एक लैपटॉप से जुड़े हैं । सभी संचालित सिस्टम बिजली के उतार चढ़ाव के मामले में एक बैकअप बैटरी प्रणाली में खामियों को दूर कर रहे हैं । (ख) ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर में एरिना सेटअप । व्यक्तिगत मछली अलग एरेनस (cyan) लोकोमोटर व्यवहार को ट्रैक करने के लिए बनाने के द्वारा चिह्नित हैं । (ग) ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर पर एक व्यवहार रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के बाद व्यक्तिगत मछली की प्रतिनिधि चलन पटरियों (लाल लाइनें) । अंश गतिविधि के 20 s का प्रतिनिधित्व करते हैं । (घ) 24 ज पर कुल नींद की अवधि काफी सतह मछली (एक तरह से Anova एफ (3, १०६) = ५२.६६ की तुलना में cavefish के तीन अलग आबादी में कम है; ड्यूनेट पोस्ट-हॉक परीक्षण सतह मछली और प्रत्येक गुफा आबादी, P < ०.००१) के बीच लागू किए गए थे । (ङ) एक ही टैंक जिसमें कई मछलियाँ होती हैं, जिसमें एक अखाड़ा (नारंगी) सामाजिक बातचीत और नींद को ट्रैक करने के लिए बनाया जाता है । (च) ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर में डाटा प्राप्ति के बाद अनेक मछलियों का चलन अंश (प्रत्येक लाइन का रंग एक व्यक्ति की मछली का प्रतिनिधित्व करता है) । (छ) सामाजिक नींद ट्रैकिंग में भूतल और Pachón cavefish के प्रतिनिधि डेटा । सतह मछली काफी 2 एल एरेनस की तुलना में 10 एल टैंक में नींद कम; सतही मछली की नींद तब और कम हो जाती है जब मछली सामाजिक रूप से घर में हो । Cavefish नींद काफी किसी भी हालत में बदल नहीं है (दो तरह से ANOVA एफ (2, 46) = ४.५४५; प्रत्येक जनसंख्या के भीतर बाद में किए गए विश्लेषण के लिए टैंक आकार और सामाजिक राज्य के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए कुल नींद 10 एल एकल, पी = ०.०१३; 10 एल सामाजिक, पी = ०.०००३) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के लिए एक कस्टम प्रणाली का वर्णन करता है और लार्वा और वयस्क cavefish में नींद और गतिवाला गतिविधि बढ़ाता । Cavefish नींद विनियमन1के आनुवंशिक और तंत्रिका आधार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सोने के विकास का अध्ययन करने के लिए एक अग्रणी मॉडल के रूप में उभरा है । इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम प्रकाश और वीडियो की गुणवत्ता के अनुकूलन के क्रम में सही ट्रैकिंग है कि सोने की मात्रा निर्धारित करने के लिए आवश्यक है आश्वस्त करने के लिए शामिल हैं । अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए प्रणाली यहां वर्णित पूरी तरह कार्यात्मक हैं, के रूप में कई अंय प्रणालियों, दोनों वाणिज्यिक और कस्टम निर्मित, के लिए चलन और28,29,30व्यवहार यों तो । पिछले परख एकल मछली में नींद की जांच के लिए समूह के विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए बढ़ाया जा सकता है घर मछली । एक महत्वपूर्ण विचार जब मुसीबत शूटिंग या डिजाइन assays है confounds सामाजिक व्यवहार एक व्यक्ति की नींद पर हो सकता है । उदाहरण के लिए, आक्रामकता Astyanaxमें आम है, और आक्रामकता का स्तर सतह मछली और cavefish31के बीच अलग है । मछली की संख्या का अनुकूलन, क्षेत्र के आकार, और लिंग अनुपात, क्रम में आक्रामकता को कम करने के लिए नींद विनियमन के reproducible माप के लिए अनुमति देगा ।

तकनीक की एक सीमा है, के रूप में वर्णित है, विश्वसनीयता की कमी परख भर में व्यक्तिगत मछली निंनलिखित है । स्वचालित पशु ट्रैकिंग अक्सर जानवरों स्विच जब वे निकट संपर्क में आ जाएगा । यह थ्रेसहोल्ड की सावधानीपूर्वक ऑप्टिमाइज़ेशन द्वारा संबोधित किया जा सकता है, या मैंयुअल रूप से किसी भी स्विचेस को सही । इसके अलावा, वर्णित प्रणाली एक प्रवाह के माध्यम से प्रणाली नहीं है, और इसलिए, पानी की गुणवत्ता कुछ दिनों से अधिक स्थाई रिकॉर्डिंग के बाद एक मुद्दा बन सकता है । सिस्टम के माध्यम से अंय प्रवाह13 zebrafish में वर्णित किया गया है और इन आसानी से मैक्सिकन cavefish के sty के लिए लागू किया जा सकता है ।

वर्णित पद्धति अपनी व्यापक प्रयोज्यता की वजह से विविध मछली प्रजातियों में व्यवहार को मापने के लिए महत्वपूर्ण है । सो अभी तक लगभग किसी भी समुद्री या sticklebacks सहित ताजा पानी की मछली में विशेषता हो गया है, cichlids, और swordtails३२,३३,३४। एक. mexicanus और अंय मछली मॉडल में नींद को मापने के लिए इस प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा के विकास और नींद की आनुवंशिक आधार के बारे में विविध प्रश्नों को संबोधित कर सकते हैं । इस प्रणाली के साथ जुड़े हार्डवेयर अत्यधिक लागत प्रभावी है, यह अत्यधिक सुलभ बनाने और नींद और चलन गतिविधि के औषधीय और ecotoxilogical विश्लेषण के उच्च थ्रॉपुट विश्लेषण के लिए क्षमता प्रदान करते हैं ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धी हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम के द्वारा समर्थन किया गया था NIGMS पुरस्कार GM127872 ACK, NINDS पुरस्कार १०५०७२ करने के लिए ERD और ACK, और NSF पुरस्कार १६५६५७४ ACK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 V power adaptor Environmental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply
Acrylic dividers (adults) TAP Plastic Order sheets in sizes as needed
Adult infrared light power source Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply
Battery pack CyberPower CP850PFCLCD
Camera lens (adult) Navitar Zoom 7000 Zoom 7000
Camera lens (larval) Fujian 35mm f/1.7 B01CHX7668 Purchase on Amazon
Camera lens adapter d 1524219
Camera mount CowboyStudio Super Clamp B002LV7X1K Purchase on Amazon
Fish tank Deep Blue Professional ADB11006
Heat sink (adult) M-D Building products SKU: 61085 Cut to fit
Heat sink (larval) M-D Building products SKU: 57000 Cut to fit
Infrared lights (adults) Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip irrf850-5050-60-reel Cut to fit
Infrared lights (larval) LED World B00MO9H7H4 Purchase on Amazon
IR-diffusing acrylic TAP Plastic Order sheets in sizes as needed
Laptop/computer N/A N/A Any laptop will work.
LED light Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) B06XKTRSP7 Use with Chanzon 25 pcs 1 W, 3 W, 5 W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel
light timer Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded
Plastic wall mount for IR Everbilt Plastic pegboard Model # 17961
Power cable BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire B01K4RPE0Y
Power source Rapid LED MOONLIGHT DRIVER (350MA)
Tissue culture plates Fisherbrand 12-well (FB012928) 24-well (FB012929)
Tripod Ball head Demon DB-44 B00TQ54CZO Purchase on Amazon
USB Hardrive Seagate 3TB backup STDT3000100
USB Webcam Microsoft LifeCam Q2F-00014 Purchase on Amazon
Wall mount for camera LDR Industries 1/2" Steel pipe 307 12X36 Mounted on wall with Flange and 90° pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera.

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References

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व्यवहार मुद्दा १४५ cavefish ट्रैकिंग नींद सामाजिक व्यवहार चलन गतिविधि अभिसरण विकास
मैक्सिकन Cavefish में नींद और चलन गतिविधि के स्वचालित माप
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Jaggard, J. B., Lloyd, E., Lopatto, A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Automated Measurements of Sleep and Locomotor Activity in Mexican Cavefish. J. Vis. Exp. (145), e59198, doi:10.3791/59198 (2019).

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