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Developmental Biology

Visualización del surco Ocular Superior durante la embriogénesis de Danio rerio

Published: March 27, 2019 doi: 10.3791/59259
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 2,3,4,5, 1,2,6
1Department of Biological Sciences, University of Alberta, 2Women & Children's Health Research Institute, University of Alberta, 3Division of Anatomy, Department of Surgery, University of Alberta, 4Department of Cell Biology, University of Alberta, 5Department of Medical Genetics, University of Alberta, 6Neuroscience and Mental Health Research Institute, University of Alberta

Summary

Aquí, presentamos una serie estandarizada de protocolos para observar el surco ocular superior, una estructura recientemente identificadas, conservadas evolutivamente en el ojo vertebrado. Con larvas de pez cebra, demostramos técnicas necesarias para identificar los factores que contribuyen a la formación y cierre del surco ocular superior.

Abstract

Coloboma ocular congénito es un trastorno genético que típicamente se observa como una hendidura en el aspecto inferior del ojo resultante cierre de fisura coroide incompleta. Recientemente, la identificación de individuos con coloboma en el aspecto superior del iris, retina y lente conducido al descubrimiento de una nueva estructura, denominada la fisura superior o surco ocular superior (SOS), que es transitorio presente en el dorsal aspecto de la Copa óptica durante el desarrollo del ojo vertebrado. Aunque esta estructura se conserva en ratones, pollos, pescados y newt, nuestra comprensión actual de los SOS es limitada. Con el fin de dilucidar los factores que contribuyen a su formación y cierre, es imprescindible para poder observar e identificar anormalidades, tales como retraso en el cierre de la SOS. Aquí, nos propusimos para crear una serie estandarizada de protocolos que puede utilizarse para visualizar eficientemente el SOS combinando técnicas de microscopía disponible con técnicas de biología molecular comunes tales como coloración inmunofluorescente y mRNA sobreexpresión. Mientras que este conjunto de protocolos se centra en la capacidad de observar el retardo de cierre de SOS, es adaptable a las necesidades del experimentador y pueden modificarse fácilmente. En general, esperamos crear un método accesible a través del cual se puede avanzar nuestra comprensión de la SOS para ampliar el conocimiento actual del desarrollo del ojo vertebrado.

Introduction

La formación del ojo vertebrado es un proceso altamente conservado en que vías de señalización intercelulares cuidadosamente orquestadas establecen tipos de tejidos y especifican identidad regional1. Perturbaciones a la morfogénesis temprana de ojo provocar defectos profundos en la arquitectura del ojo y con frecuencia son ciego2. Una de esas enfermedades resultado de la falta para cerrar la fisura ocular coroide en la parte ventral de la taza óptica3. Este trastorno, conocido como coloboma ocular, se estima para ocurrir en 1 fuera de 4-5000 nacidos vivos y causa el 3-11% de ceguera pediátrica, que se manifiesta comúnmente como una ojo de la cerradura-como la estructura que sobresale en parte inferior de la pupila en el centro del ojo4, 5,6. La función de la fisura coroide es proporcionar un punto de entrada de vasculatura temprana creciendo en la Copa óptica, después de que los lados de la fisura fusible para incluir los vasos7.

Mientras que el coloboma ocular ha sido conocido desde la antigüedad, recientemente hemos identificado un nuevo subconjunto de pacientes con coloboma con pérdida de tejido que afectan el aspecto dorsal superior del ojo. Trabajos recientes en nuestro laboratorio ha conducido al descubrimiento de una estructura ocular en el ojo dorsal del pez cebra, que llamamos el surco ocular superior (SOS) o fisura superior8. Es importante tener en cuenta que la estructura tiene características de un surco y una fisura. Similar a un surco, es una capa de tejido continuo que abarca desde la nasal de la retina temporal. Además, el cierre de la estructura no está mediado por una fusión de los dos opuestos de la membrana del sótano, y que parece requerir un proceso morfogenético por que la estructura está poblada por las células. Sin embargo, similar a una fisura, forma una estructura que separa las partes nasal y temporales del ojo dorsal con la membrana basal. Coherencia, nos referiremos a él como SOS en este texto.

El SOS es evolutivamente conservado en vertebrados, siendo visible durante la morfogénesis de ojo de pescado, pollo, newt y mouse8. En contraste con la fisura coroide, que está presente desde la fecundación después de 20-60 horas (hpf) en el pez cebra, el SOS es muy transitorio, visible de 20-23 hpf y ausente por hpf 268. Investigaciones recientes en nuestro laboratorio ha encontrado que, similar a la fisura de la coroide, el SOS desempeña un papel en dirección vascular durante la morfogénesis de ojo8. Aunque los factores que controlan la formación y el cierre del SOS no se entienden todavía completamente, nuestros datos destacan papeles ojo dorsal ventral patrones genes8.

Pez cebra es un organismo modelo excelente para estudiar el SOS. Como sistema modelo, ofrece una serie de ventajas en el estudio de desarrollo del ojo: es un modelo vertebrado; cada generación presenta alta fecundidad (~ 200 embriones); su genoma se ha secuenciado completamente lo que facilita la manipulación genética; y aproximadamente el 70% de los genes humanos tienen al menos un pez cebra orthologue, convirtiéndolo en un modelo ideal basado en la genética de la enfermedad humana9,10. Lo más importante, su desarrollo lleva a cabo externamente a la madre, y sus larvas son transparentes, que permite la visualización del ojo en desarrollo con relativa facilidad11.

En este conjunto de protocolos, se describen las técnicas a través del cual se puede visualizar el SOS en larvas de pez cebra. La variedad de técnicas de visualización utilizado en este informe permitirá observación clara de los SOS durante el desarrollo normal del ojo, así como la capacidad para detectar defectos de cierre de SOS. Nuestros protocolos de ejemplo contará con investigaciones de Gdf6, un BMP localizada en la dorsal ojos y conocido regulador de cierre de SOS. Además, estas técnicas pueden combinarse con manipulaciones experimentales para identificar factores genéticos o agentes farmacológicos que afectan el cierre y la correcta formación de SOS. Además, hemos incluido un protocolo mediante el cual la imagen fluorescente de todas las membranas celulares es posible, lo que permite al experimentador observar cambios morfológicos en las células que rodean el SOS. Nuestro objetivo es establecer una serie de protocolos estandarizados que pueden utilizarse en toda la comunidad científica para ofrecer nuevas penetraciones en la estructura de novela del ojo en desarrollo.

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Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Universidad del Comité de uso y cuidado de animales de Alberta.

1. Protocolo n ° 1: Visualización de SOS con Estereomicroscopio y proyección de imagen de interferencia diferencial (DIC) de contraste

  1. Colección de embriones
    1. En un tanque de agua declorada, preparar cruces de gdf6a+- pez cebra en la noche por la vinculación de un pez cebra macho con una hembra pez cebra. Asegúrese de separar el macho de la hembra mediante un divisor para asegurar que los embriones nacen dentro de un intervalo pequeño de tiempo.
    2. A la mañana siguiente, tire el divisor y permiten el pez cebra criar para no más de 30 minutos recogen los embriones en placas de Petri con los medios E3, se describe en el libro de los peces cebra12y colocarlos en una incubadora de 28,5 ° C.
    3. Eliminar huevos no fertilizados o embriones muertos, que aparecen blanco y opaco.
  2. Preparación y vivir-la proyección de imagen de embriones de pez cebra
    1. 20 hpf, reemplace el E3 media medios E3 que contienen 0.004% 1-fenil 2-tiourea (PTU) para evitar la producción de pigmento.
      Nota: Además de PTU en un punto un poco más tarde, como 22-24 hpf, es improbable que interfieran con el experimento de debido a la temprana edad de los embriones en el momento de la proyección de imagen. Sin embargo, se recomienda para el tratamiento de los embriones temprano para prevenir totalmente la pigmentación ya que hay una banda de pigmentación que aparece en la vista dorsal, que puede interferir con la imagen de la SOS.
    2. Garantizar que todos los embriones en las etapas de desarrollo correcto en varios puntos a la hora de observación. Se recomienda que se realice en las etapas en que somite número es claramente visible como se indica por Kimmel et al.13. Eliminar aquellos que son inmaduros al desarrollo.
    3. Coloque los embriones bajo un microscopio de disección y dechorionate los embriones tirando suavemente aparte el corion con unas pinzas finas. Visualizar el SOS en la vista dorsal. El SOS puede aparecer como una muesca en el margen dorsal del ojo, y una línea debe ser visible a través de la vista dorsal. Para el cierre de SOS normal, observar los embriones en torno a 20-23 hpf. Para la examinación de los fenotipos de cierre de SOS retrasadas, observar los embriones 28 hpf o más tarde.
    4. Clasificar los embriones que muestran retardo del cierre de SOS de los que no.
    5. Para fotografiar estos embriones utilizando un microscopio de disección, preparar un plato de Petri que contenga 1% agarosa en E3. Pinchar ligeramente el centro de la agarosa para crear un agujero poco profundo en el que la yema del embrión puede sentarse cuando el embrión se coloca en la agarosa. Esto asegurará que el embrión no está en un ángulo oblicuo al ser fotografiados.
    6. Anestesiar los embriones con Metanosulfonato de 0.003% en E3 y lateralmente en la agarosa.
    7. Para los embriones usando un microscopio compuesto o confocal de imágenes, transferir el embrión en 35 mm placa de Petri que contiene un pequeño bolo de no cuajó bajo punto de fusión punto de agarosa al 1% en E3 (w/v). Coloque el embrión lateralmente usando un sedal fino o una pestaña y esperar a que la agarosa se enfríe rápidamente. Una vez firme la agarosa, vierta suficiente E3 en el plato para cubrir la agarosa. Para más detalles, ver Distel y Köster14.
      Nota: Si está usando un microscopio invertido, el embrión puede ser colocado contra el vidrio de un plato de vidrio-cubreobjetos-bottom y fotografiado con un estándar de 20 X lente objetiva.
    8. Utilice un objetivo de inmersión x 20 agua para visualizar el SOS con un microscopio compuesto. Después de visualización, suavemente tire la agarosa de los embriones y fijar en 4% paraformaldehido (PFA) o permitir que continúen su desarrollo.

2. Protocolo 2: Whole-mount de coloración inmunofluorescente del laminin

  1. Tinción inmunofluorescente de laminina de montaje conjunto: día 1
    1. Dechorionate embriones como se describe en el paso 1.2.3, si no lo ha hecho. Fijar los embriones en un tubo de microcentrífuga en el punto deseado en el recién hecho 4% PFA por 2 h en un agitador de temperatura ambiente (22-25 ° C). Lavado en 1 x PBST durante 5 minutos, cuatro veces.
      Nota: Después de la gastrulación, embriones pueden fijar mejor después de dechorionation.
    2. Permeabilizar embriones en proteinasa de 10 mg/mL K a temperatura ambiente por 5 minutos tiempo de incubación dependerá de la etapa de desarrollo en el cual los embriones son fijos (ver Thisse y Thisse15).
    3. Lavado en 1 x PBST durante 5 minutos, cuatro veces.
    4. Bloque de embriones en una solución de 5% cabra suero y 2 mg/mL albúmina de suero bovino (BSA) en 1xPBST para 1-2 h en un agitador de la temperatura ambiente.
    5. Preparar solución de anticuerpo primario por diluir el anticuerpo de conejo anti-laminina en la solución de bloque en una dilución 1: 200.
    6. Incubar los embriones en el anticuerpo primario anti-laminina durante la noche en un agitador de 4 ° C.
  2. Tinción inmunofluorescente de laminina de montaje conjunto: día 2
    1. Lavado en 1 x PBST durante 15 minutos, cinco veces.
    2. Preparar la solución de anticuerpo secundario por diluir el anticuerpo de cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 en 1 x PBST a una dilución de 1: 1000.
      Nota: Es posible adaptar este paso para adaptarse a los recursos disponibles al experimentador, mediante el uso de un anticuerpo secundario diferente.
    3. Incubar los embriones en el anticuerpo secundario durante la noche en un agitador de 4 ° C. Proteger de la luz tanto como sea posible de este paso adelante.
    4. Lavado en 1 x PBST durante 15 minutos, cuatro veces. Los embriones pueden almacenarse a 4 ° C por hasta una semana, si es necesario.
  3. Disección y montaje de ojos embrionarios
    1. Si lo desea, coloque los embriones en una placa Petri pequeña y deyolk los embriones en 1 x PBST. Para ello, interrumpir la yema de huevo con unas pinzas finas y eliminar las células de la yema mediante raspado suave de la vesícula vitelina.
    2. Preparar las siguientes concentraciones de glicerol PBS serie soluciones en tubos de microcentrífuga: glicerol 30%, 50% y 70% en PBS. Transferencia de embriones en 30% glicerol/PBS, asegurándose de colocar los embriones en la parte superior la solución y la transferencia de tan poco de la solución anterior como sea posible. Espere a que los embriones a hundirse hasta el fondo del tubo.
    3. Cuando los embriones han hundido en el fondo, transferir al 50% glicerol/PBS. Repetición y transferencia a 70% glicerol/PBS.
    4. Una vez que los embriones han hundido en 70% glicerol/PBS, moverlos a un pequeño plato de plástico para disecciones.
    5. Cortar el embrión posterior al cerebelo y utilice el tejido posterior para genotipificación, si es necesario.
    6. Mover la cabeza de un portaobjetos de vidrio, transferencia como glicerol poco como sea posible. Utilice pinzas u otras herramientas de disección fina para sujetar en el extremo posterior para mantener la cabeza inmóvil. Use un alfiler fino minutien u otras herramientas de disección fina suavemente introducir en el ventrículo del cerebro anterior de la anterior y empuje hacia abajo para separar las mitades derecha e izquierdas de la cabeza de uno al otro. Repita este movimiento posteriormente a través del mesencéfalo y en el ventrículo del hindbrain, esencialmente fileting la cabeza hacia abajo de la línea media. Esto reduce al mínimo la manipulación manual del ojo y el tejido circundante, dejando intacto el SOS.
    7. Montar cada lado de la línea media cabeza hacia abajo, ojo para arriba. Cuatro entradas de grasa para vacío en las esquinas (una distancia apropiada para el cubreobjetos se utiliza) y cubrir con un cubreobjetos de vidrio, presionar secuencialmente en cada post hasta el cubreobjetos en contacto con las muestras. Pipeta con glicerol al 70% en el borde del cubreobjetos para que el glicerol se tira abajo, llenando el espacio entre el cubreobjetos y la diapositiva.
    8. Muestras de la imagen dentro de un día, o un sello en el cubreobjetos con la muestra de imagen sólo después de que se haya secado el esmalte de uñas y esmalte de uñas. Almacenar en la oscuridad a 4 ° C.

3. Protocolo 3: Visualización de SOS usando eGFP CAAX mRNA

  1. Síntesis de mRNA de eGFP CAAX
    1. Alinear 1 mg de plásmido pCS2-eGFP-CAAX16 con NotI en un volumen de reacción de 40 mL durante 4 horas a 37 ° C.
    2. Para detener la reacción de digestión de restricción, añadir 10 mL libre de Rnasa de agua, 2,5 mL 10% SDS y 2,0 mL 10 mg/mL de proteinasa K.
    3. Incubar 1 hora a 50 ° C.
    4. Agregue lo siguiente para la reacción (volumen total 200 mL) y proceder al siguiente paso: 50 mL libre de Rnasa de agua, 20 mL 3 M sodio acetato pH 5.2 y 75,5 mL libre de Rnasa de agua
      Nota: El agua libre de ARNasa se agrega en dos ocasiones para evitar la excesiva dilución del acetato de sodio.
  2. Purificación del ADN mediante fenol/cloroformo extracción y etanol de precipitación
    1. Añadir 200 mL de alcohol de fenol: cloroformo: isoamílico y vortex para 20 s. separado las fases acuosas y orgánicas a través de centrifugación a 18.000 x g durante 5 minutos.
    2. Transferir la capa acuosa superior a un tubo nuevo de microcentrífuga, asegurándose de evitar a la transferencia de la capa orgánica de fondo. Añadir un volumen igual de cloroformo al tubo de nuevo.
      Nota: La adición de cloroformo es opcional, pero se recomienda para asegurar la completa remoción del fenol de la muestra.
    3. Vortex para 20 s. separado las fases acuosas y orgánicas a través de centrifugación a 18.000 x g durante 5 minutos.
    4. Como antes, transferir la capa acuosa superior a un tubo nuevo de microcentrífuga, asegurándose de evitar a la transferencia de la capa orgánica de fondo.
    5. Añadir el 1/10 volumen de 3 M sodio acetato pH 5.2.
    6. Precipitar el ADN agregando 3 volúmenes de etanol al 100% libre de ARNasas y frío a-20 ° C durante 15 minutos la centrifugadora a 18.000 x g por 20 min a 4 ° C. Un pellet debe ser visible. Decantar el sobrenadante.
    7. Lavar el precipitado con 100 mL de agua fría de la Rnasa-libre etanol del 70%. Después de mezclar suavemente para romper los pellets sueltos, centrifugar a 18.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Un pellet debe ser visible. Decantar el sobrenadante.
    8. Secar el pellet por 5 min y resuspender el ADN en 7 mL de agua.
      Nota: La pastilla deba ser secada durante más de 5 min dependiendo el flujo de aire disponible.
  3. Transcripción y purificación de eGFP CAAX mRNA
    1. De una manera libre de Rnasa, preparar una reacción de transcripción en vitro con un kit de polimerasa Sp6 RNA comercialmente disponible, utilizando aproximadamente 1 mg de plásmido linearizado purificado ADN obtenido en el paso 3.2. Incubar por 2 h a 37 ° C.
      Nota: Sp6 RNA polimerasa debe usarse para la producción de mRNA tapado.
    2. Añadir 1 mL de DNasa (2 U/mL; Libre de ARNasas) e incubar durante 30 min a 37 ° C.
    3. Purificar el ARNm con cualquier kit de purificación de RNA comercialmente disponible. Alícuota del mRNA para evitar la congelación y descongelación repetida y almacenar a-80 ° C.
  4. Inyección y visualización
    1. Obtener embriones en protocolo 1.1.
    2. Usar un aparato de microinyección, inyectar 300 pg de eGFP CAAX mRNA en la etapa de 1 célula.
    3. Pantalla de embriones con la brillante expresión de eGFP en los ojos utilizando un estereoscopio de fluorescencia.
    4. Imagen de los embriones como se describe en el protocolo de 1.2.
    5. Alternativamente, dechorionate y fijar los embriones en el punto deseado en el 4% PFA durante 4 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4° C. Lave los embriones en el 1 x SAFT durante 5 minutos, cuatro veces y dechorionate, si no ha hecho. Diseccionar los ojos y móntelas en las diapositivas como se describe en el protocolo 2.3.

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Representative Results

El pez cebra SOS aparece en 20 hpf en la presunta retina dorsal8. 23 hpf el SOS las transiciones de su arquitectura inicial estrecha a una muesca amplia y 26 hpf ya no es visible8. Por lo tanto, para examinar el SOS durante el desarrollo de ojo de pez cebra normal, deben observarse los embriones entre 20-23 hpf. Durante este período, el SOS es observable mediante el microscopio de disección y a través de la proyección de imagen de DIC como una línea fina en el ojo dorsal que separa las mitades nasal y temporales de la retina en desarrollo (figura 1). Además, una sutil muesca puede ser visible en el límite dorsal de los ojos (figura 1). Tras tinción inmunofluorescente de la laminina, la delgada línea que puede confirmarse que la membrana basal (figura 1).

Para examinar vías moleculares dando por resultado el cierre tardío de SOS, optamos por observar los embriones 28 hpf como este es un punto que es suficientemente desde el momento de cierre de SOS normal y es, por tanto, un marcador confiable de retardo de cierre de SOS debido a experimental manipulaciones. A través de la visualización directa de 28 hpf pez cebra con el microscopio de disección, es posible evaluar el retardo de cierre de SOS debido a la manipulación experimental. Cuando se retrasa el cierre de SOS, su presencia prolongada puede verse como una hendidura pronunciada en la parte dorsal del ojo con el microscopio de disección (figura 2). Cuando se observa bajo el microscopio compuesto utilizando óptica DIC o Nomarski, esta característica es más prominente, y las partes nasal y temporales del ojo están separadas por el SOS, que es claramente visible como una línea en la vista dorsal (figura 3).

El SOS se alinea con los componentes de la lámina basal, como la laminina. Por lo tanto, coloración inmunofluorescente proporciona un método complementario de la evaluación de cierre de SOS en embriones de fijados. Cuando la proyección de imagen el ojo embrionario desde una vista lateral, la lámina basal delimita el margen exterior del ojo, oculares fisuras y la frontera entre la lente y la retina (figura 4). El SOS es directamente opuesta a la fisura coroide en el aspecto dorsal del ojo. Todo embriones pueden montarse lateralmente, con un poco mejor la claridad óptica que logrado si los ojos están previamente microdissected. Por 28 hpf, en pez cebra wildtype, laminina tinción demuestra claramente que el SOS está completamente cerrado, que hace de este un escenario ideal para el control de retrasos en el cierre de la fisura.

Inyección de mRNA de eGFP CAAX permite la visualización de las membranas de la célula de un embrión vivo o fija (figura 5). Inyección de etapa exitosa de una célula es suficiente para producir embriones con fluorescencia de membrana de la célula completa. En la vista lateral, todos los límites celulares deben ser marcados por la fluorescencia de GFP, y como tal, claramente se observa la morfología de la célula. Esto permite la visualización de los cambios morfológicos en las células que conducen al cierre de SOS.

Figure 1
Figura 1: observación de SOS durante el desarrollo del pez cebra normal ojo. Embriones de pez cebra fueron recogidos y reflejados en 22 hpf. A-B. Vista lateral de 22 embriones hpf en vivo-imágenes con el microscopio de disección (A) y a través de DIC la proyección de imagen (B), respectivamente. El SOS es marcado por un asterisco rojo. C. laminina coloración inmunofluorescente de un embrión de hpf 22. Embriones se fijaron en 4% PFA y obtenido para el conjunto de montaje coloración inmunofluorescente del laminin. Los embriones fueron fileted y en 70% glicerol/PBS. Imágenes individuales se obtuvieron a través de la proyección de imagen confocal con un software. El SOS es marcado por un asterisco blanco. Todas las figuras fueron anotadas y montado usando el software Adobe Illustrator. Barras de escala representan 50 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: imágenes de microscopio de retardo de cierre de SOS en larvas de pez cebra de disección. Embriones de tipo salvaje y gdf6a- / - fueron recogidos y vivir-reflejada en 28 hpf. A. vista Lateral de un embrión de tipo salvaje con un SOS cerrado. B. Lateral vista de un embrión gdf6a- / - con un retraso de cierre de SOS (asterisco). Una fuerte depresión es observable en el aspecto dorsal del ojo debido a la falta de la SOS para cerrar adecuadamente. Barras de escala representan 50 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: imágenes de DIC representante de SOS en el ojo de embrión de pez cebra. Embriones de tipo salvaje y gdf6a- / - fueron recogidos, anestesiados y colocados lateralmente en ultrapura bajo punto de fusión punto de agarosa al 1% en E3 en una placa de Petri de 35 mm. El plato estaba lleno de E3, y se utilizó un microscopio compuesto con 20 x objetivo de inmersión de agua para proyección de imagen de DIC. A. vista Lateral de un embrión de tipo salvaje con un SOS cerrado. B. Lateral vista de un embrión gdf6a- / - con un retraso de cierre de SOS (asterisco). El SOS es observable como una línea delgada en la cara dorsal del ojo. Barras de escala representan 50 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: imágenes representativas del laminin inmunofluorescente tinción en ojo de embrión de pez cebra. Embriones de tipo salvaje y gdf6a- / - se colectaron y se fija en 4% PFA 28 hpf. La lámina basal fue immunostained, y los embriones fueron fileted y montados en 70% glicerol/PBS para la proyección de imagen confocal. Imágenes individuales se obtuvieron utilizando el software ZEN. A. vista Lateral de un embrión de tipo salvaje con un SOS cerrado. B. Lateral vista de un embrión gdf6a- / - con un retraso de cierre de SOS (asterisco). La lámina basal aparece delineando el ojo en verde, con el SOS visible en la parte dorsal del ojo en gdf6a- / - embriones. Barras de escala representan 50 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: proyección de imagen de pez cebra ojo embrionario después de la inyección de mRNA de eGFP caax. Embriones de tipo salvaje se inyectan 300 pg de eGFP caax mRNA en células de 1 etapa. A los 22 hpf y 28 hpf, respectivamente, los embriones fueron anestesiados y montados lateralmente en ultrapura bajo punto de fusión punto de agarosa al 1% en E3 en una placa de Petri de 35 mm. Un microscopio confocal con 20 x objetivo de inmersión de agua fue utilizado para la proyección de imagen, y solo imágenes se obtuvieron mediante un software. A. vista de un embrión gdf6a- / - 22 Lateral hpf con un visible SOS abierto (asterisco). B. agrandamiento de paneles de un embrión gdf6a- / - 22 hpf. C. vista Lateral de un embrión gdf6a- / - 28 hpf con un cierre de SOS retrasar. D. agrandamiento de paneles de un embrión gdf6a- / - 28 hpf. Barras de escala representan 50 mm y 10 mm en paneles A y C y B y D, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí, presentamos una serie estandarizada de protocolos para observar el SOS en el embrión de pez cebra en desarrollo. Para determinar fenotipos de retardo de cierre, los protocolos se han centrado en la capacidad de distinguir la separación de dos lóbulos discretos de los lados del ojo, similar a las técnicas utilizadas para visualizar retardo de cierre de fisura coroide nasal dorsal y dorsal-temporal fenotipos en la vista ventral.

Estas técnicas de visualización pueden utilizarse junto con una variedad de técnicas de manipulación genética para estudiar los efectos de la inhibición o inducción de expresión de ciertos genes para estudiar su papel en el cierre de la SOS. Hemos elegido para demostrar estos protocolos embriones gdf6a- / - como previamente hemos demostrado su pérdida puede afectar el cierre adecuado de la SOS, pero los protocolos pueden ser utilizados para estudiar los efectos de manipular la expresión de cualquier gen como Obligatorio. Se recomienda que los cambios morfológicos a la vista dorsal se estudiaron preliminarmente con observaciones con el microscopio de disección. Las otras técnicas se deben utilizar una vez que se establezca un enlace inicial definitivamente, ya que son más desperdiciadores de tiempo y menor rendimiento.

Si bien los protocolos pueden ser fácilmente modificados para adaptarse a las necesidades del experimentador, hay varios aspectos que deben ser seguidos cuidadosamente. Debido a la naturaleza transitoria de esta estructura, es imprescindible garantizar que todos los embriones son de la misma etapa del desarrollo. Para nuestro trabajo, nos parece importante para permitir que sólo una pequeña ventana de tiempo de reproducción y ordenar periódicamente los embriones durante el desarrollo temprano. Es el paso más importante de igualación etapas 20 hpf, cuando puede contar todavía con precisión somitas (24)17, y nos parece mucho más confiable que la excelente puesta en escena que delinean tiempo 28 hpf. Además, pigmentación debe inhibida o eliminada para asegurar éxito visualización de la estructura. Hemos observado la pigmentación en el ojo comienza a comenzar alrededor 22 hpf, y existe un patrón de pigmentación en el ojo dorsal que puede interferir con la correcta visualización de la SOS. Por lo tanto, se recomienda para el tratamiento de los embriones con PTU antes de pigmentación para visualización exitosa. Además, disección del ojo embrionario antes del montaje de la diapositiva sin causar daño requiere algo de práctica. También es imprescindible montar lateralmente los ojos tan paralelos como sea posible a la diapositiva. Se recomienda que el experimentador las prácticas de estas técnicas con los embriones extras antes del experimento.

Con la excepción de la tinción inmunofluorescente de la lámina basal, todos los protocolos descritos aquí pueden completarse con embriones vivos. Esto permite la visualización continua de la SOS a lo largo de la embriogénesis temprana, lo que permite al experimentador realizar Time-lapse estudios de los cambios morfológicos en el cierre de la SOS. En el pasado, hemos utilizado los transgenes específicos de retina, como Tg(rx3:eGFP), que marca la retina neural durante el desarrollo temprano de. Aunque carece de la capacidad de visualizar las membranas celulares, el uso de Tg(rx3:eGFP) tiene la ventaja de no requerir microinyecciones y ha sido nuestro principal método de visualizar cambios morfológicos brutos arquitectura SOS en tiempo real. Dicho Protocolo no se ha incluido aquí, como métodos similares se han discutido anteriormente en este diario18,19. Sin embargo, investigación de base biológica de la célula de formación SOS y cierre requiere proteínas fluorescentes de la membrana. Específicamente, la inyección de mRNA de eGFP CAAX permite la visualización de las membranas celulares en el SOS como se ve en la figura 5, que nos permite estudiar la dinámica de cambios de forma de células en el ojo dorsal que se requieren para el correcto cierre de SOS. Mientras CAAX eGFP puede ser útil para la realización de imágenes en vivo de cierre de SOS, se hace difícil por la presencia de la capa envolvente en el pez cebra. Además, se debe tener cuidado al analizar los resultados de las inyecciones de mRNA porque puede resultar en mosaicismo, lo que hace difícil comparar directamente embriones basados en la cuantificación de la fuerza de la expresión de eGFP. Esto podría ser mejorado mediante el uso de líneas de pez cebra transgénico que etiqueta fluorescente de las membranas celulares especialmente en la retina en desarrollo, como Tg(vsx2.2:GFP-caax).

Uno de los retos de nuestros protocolos se encuentra con cualquier tratamiento que no es completamente penetrante. Anteriormente hemos observado que retrasos de SOS se observan en aproximadamente el 10% de embriones control 28 hpf8, y esta presencia subyacente de los embriones con un SOS dentro de cualquier grupo experimental dado podría hacer difícil de observar efectos sutiles de experimental manipulación. Esto podría abordarse cegamiento el experimentador para reducir el sesgo del experimentador y aumentando el número de embriones utilizados dentro de cada grupo experimental para aumentar la potencia del experimento. Además, la etapa de análisis podría cambiar de puesto a 29-30 hpf.

Con este conjunto de protocolos, se busca estandarizar la manera a través del cual se visualiza retraso de cierre de SOS. Las técnicas descritas anteriormente han demostrado ser fiables en la detección y visualización de retraso de cierre de SOS en una variedad de ajustes experimentales y son adaptables a las necesidades del experimentador. Si bien hemos utilizado técnicas tales como análisis de microscopia electrónica o proyección de imagen de Time-lapse de embriones transgénicos para visualizar la SOS en mayor detalle, nuestro objetivo aquí es crear un conjunto estandarizado de protocolos que son susceptibles de alto rendimiento experimental diseños para visualizar un gran número de embriones en un solo día con énfasis en la posibilidad de puntuación de cierre retardo de fenotipos. Además de su uso con embriones- / - gdf6a, hemos podido observar fenotipos de retardo de cierre de SOS con estas técnicas de visualización junto con tratamientos farmacológicos, las inyecciones de morfolino y estudios de sobreexpresión de RNA. Como el papel del SOS en el desarrollo del ojo es aclarado más a través de diversos medios, esperamos que este conjunto estandarizado de protocolos de proporciona a la comunidad científica un lenguaje común a través del cual se estudia esta estructura nueva.

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Disclosures

Los autores tienen intereses contradictorios a declarar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por los institutos canadienses de investigación de salud (CIHR), ciencias naturales y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC), Alberta Innova tecnología futuros y la mujer e Instituto de investigación de salud (WCHRI de los niños).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl 2-thiourea Sigma Aldrich P7629-10G
100 mm Petri dish Fisher Scientific FB0875713
35 mm Petri dish Corning CLS430588
Agarose BioShop Canada Inc. AGA001.1
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope Zeiss AxioImager Z1
Dissection microscope Olympus SZX12
Dissection microscope camera Qimaging MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease Fisher Scientific 14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma Aldrich A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 Abcam ab150077
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Image capture software Zeiss ZEN
Incubator VWR Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Microscope slide Fisher Scientific 12-544-2
Minutien pin Fine Science Tools 26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
NotI New England Biolabs R0189S
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 Fisher Scientific BP1752-100
Proteinase K Sigma Aldrich P4850
Rabbit anti-laminin antibody Millipore Sigma L9393
TURBO Dnase (2 U/µL) Invitrogen AM2238
Ultrapure low-melting point agarose Invitrogen 16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Invitrogen 15525017

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References

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Biología del desarrollo número 145 desarrollo del ojo coloboma fisura superior surco ocular superior fisura coroide pez cebra anatomía ocular coloboma superior coloboma anormal señalización de BMP patrón axial dorsoventral ojo dorsal
Visualización del surco Ocular Superior durante la embriogénesis de <em>Danio rerio</em>
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Yoon, K. H., Widen, S. A., Wilson,… More

Yoon, K. H., Widen, S. A., Wilson, M. M., Hocking, J. C., Waskiewicz, A. J. Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59259, doi:10.3791/59259 (2019).

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