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Developmental Biology

Danio rerio भ्रूणयोजनजनन के दौरान बेहतर नेत्र परिखा का दृश्य

Published: March 27, 2019 doi: 10.3791/59259
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 2,3,4,5, 1,2,6
1Department of Biological Sciences, University of Alberta, 2Women & Children's Health Research Institute, University of Alberta, 3Division of Anatomy, Department of Surgery, University of Alberta, 4Department of Cell Biology, University of Alberta, 5Department of Medical Genetics, University of Alberta, 6Neuroscience and Mental Health Research Institute, University of Alberta

Summary

यहां, हम प्रोटोकॉल की एक मानकीकृत श्रृंखला प्रस्तुत करने के लिए बेहतर नेत्र परिखा, एक हाल ही में पहचान की, विकासवादी-रीढ़ की आंख में संरक्षण संरचना का निरीक्षण । zebrafish लार्वा का उपयोग करते हुए, हम कारकों की पहचान करने के लिए आवश्यक तकनीकों का प्रदर्शन करते हैं जो बेहतर नेत्र परिखा के गठन और बंद करने में योगदान करते हैं ।

Abstract

जन्मजात नेत्र coloboma एक आनुवंशिक विकार है कि आम तौर पर अपूर्ण रंजित विदर बंद करने से उत्पंन आंख के अवर पहलू में एक फांक के रूप में मनाया जाता है । हाल ही में, परितारिका, रेटिना के बेहतर पहलू में coloboma के साथ व्यक्तियों की पहचान, और लेंस एक उपंयास संरचना की खोज के लिए नेतृत्व किया, बेहतर विदर या बेहतर नेत्र परिखा (एसओएस) के रूप में संदर्भित है, कि संक्रमण के पृष्ठीय पर मौजूद है कशेरुका आँख विकास के दौरान ऑप्टिक कप का पहलू. हालांकि इस संरचना चूहों, लड़की, मछली, और ंयूट भर में संरक्षित है, हमारे मुसीबत का इशारा की वर्तमान समझ सीमित है । इसके गठन और बंद करने में योगदान देने वाले कारकों को स्पष्ट करने के लिए यह अनिवार्य है कि वे इसका निरीक्षण करें और असामान्यताएं, जैसे कि एसओएस के बंद होने में देरी की पहचान कर सकें । यहां, हम बाहर सेट करने के लिए प्रोटोकॉल का एक मानकीकृत श्रृंखला बनाने के लिए कुशलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोपी तकनीकों के संयोजन के द्वारा मुसीबत का इशारा इस तरह के रूप में आम आणविक जीव विज्ञान तकनीकों के साथ immunofluorescent धुंधला और mRNA अधिव्यंजक. जबकि प्रोटोकॉल के इस सेट के लिए मुसीबत का इशारा बंद करने में देरी का निरीक्षण करने की क्षमता पर ध्यान केंद्रित है, यह experimenter की जरूरत है अनुकूलनीय है और आसानी से संशोधित किया जा सकता है । कुल मिलाकर, हम एक पंहुचा तरीका है जिसके माध्यम से हमारे मुसीबत का इशारा की हमारी समझ के लिए कशेरुका आँख विकास के वर्तमान ज्ञान का विस्तार उंनत किया जा सकता है बनाने की उंमीद है ।

Introduction

कशेरुका आँख के गठन एक अत्यधिक संरक्षित प्रक्रिया है जिसमें ध्यान से अंतराकोशिक संकेतन रास्ते में ऊतक प्रकार की स्थापना और क्षेत्रीय पहचान निर्दिष्ट1। जल्दी आंख संरचनाविकास के लिए क्षोभ आंख की वास्तुकला के लिए गहन दोषों में परिणाम और अक्सर2चकाचौंध कर रहे हैं । एक ऐसी बीमारी के परिणाम के लिए ऑप्टिक कप3के अधर पक्ष में रंजित नेत्र विदर को बंद करने के लिए विफलता से । इस विकार, नेत्र coloboma के रूप में जाना जाता है, 4-5000 जीवित जन्मों में से 1 में होने का अनुमान है और बाल चिकित्सा अंधापन का कारण 3-11%, सामांयतः एक keyhole की तरह संरचना है कि आंख4के केंद्र में पुतले से inferiorly के रूप में प्रकट, 5,6. रंजित विदर का कार्य ऑप्टिक कप में बढ़ रही जल्दी vasculature के लिए एक प्रवेश बिंदु प्रदान करने के लिए है, जिसके बाद विदर के पक्षों7जहाजों को बंद करने के लिए फ्यूज हो जाएगा ।

जबकि नेत्र coloboma प्राचीन काल से ज्ञात किया गया है, हम हाल ही में आंख के बेहतर/पृष्ठीय पहलू को प्रभावित ऊतक हानि के साथ coloboma रोगियों के एक उपंयास सबसेट की पहचान की है । हमारी प्रयोगशाला में हाल के काम के लिए zebrafish पृष्ठीय नेत्र में एक नेत्र संरचना की खोज करने के लिए नेतृत्व किया गया है, जो हम के रूप में संदर्भित करने के लिए बेहतर नेत्र संकस (मुसीबत का इशारा) या बेहतर विदर8. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि संरचना में एक परिखा और विदर दोनों की विशेषताएँ हैं । एक परिखा के समान, यह एक नित्य ऊतक परत है कि नाक से लौकिक रेटिना तक spans है । इसके अलावा, संरचना के बंद करने के दो विरोध तहखाने झिल्ली के एक विलय द्वारा मध्यस्थता नहीं है, और यह एक संरचनाविकासी प्रक्रिया है जिसके द्वारा संरचना कोशिकाओं द्वारा पॉपुलेटेड है की आवश्यकता प्रतीत होता है. हालांकि, एक विदर के समान, यह एक संरचना है कि तहखाने झिल्ली के साथ नाक और पृष्ठीय आंख के लौकिक पक्षों अलग रूपों । निरंतरता के लिए, हम इस पाठ में मुसीबत का इशारा के रूप में यह उल्लेख करेंगे ।

मुसीबत का इशारा विकासवाद में कशेरुका है, जो मछली, चूजा, ंयूट, और माउस8में आंख की उत्पत्ति के दौरान दिखाई देता है । के विपरीत रंजित विदर, जो zebrafish में 20-60 घंटे के बाद निषेचन (hpf) से मौजूद है, मुसीबत का इशारा अत्यधिक क्षणिक है, आसानी से 20-23 hpf से दिखाई जा रही है और 26 hpf8से अनुपस्थित । हमारी प्रयोगशाला में हाल ही में अनुसंधान पाया गया है कि, रंजित विदर के समान, मुसीबत का इशारा आंख संरचनाविकास8के दौरान संवहनी मार्गदर्शन में एक भूमिका निभाता है । हालांकि कारकों के गठन और मुसीबत का इशारा के बंद करने को नियंत्रित अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं कर रहे हैं, हमारे डेटा पृष्ठीय-अधर नेत्र patterning जीन8के लिए भूमिकाओं को उजागर किया ।

Zebrafish मुसीबत का इशारा अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है । एक मॉडल प्रणाली के रूप में, यह नेत्र विकास का अध्ययन करने में लाभ के एक नंबर प्रदान करता है: यह एक कशेरुका मॉडल है; प्रत्येक पीढ़ी के उच्च बहुप्रजता (~ २०० भ्रूण) प्रदर्शित; इसके जीनोम पूरी तरह से sequenced किया गया है, जो आनुवंशिक हेरफेर की सुविधा; और मानव जीन के लगभग ७०% है कम एक zebrafish orthologue, यह एक आदर्श आनुवंशिकी आधारित मानव रोग9,10के मॉडल बना । सबसे महत्वपूर्ण बात, इसका विकास मां के लिए बाह्य जगह लेता है, और उसके लार्वा पारदर्शी हैं, जो सापेक्ष आसानी11के साथ विकासशील आंख के दृश्य के लिए अनुमति देता है ।

प्रोटोकॉल के इस सेट में, हम उन तकनीकों का वर्णन करते हैं, जिनके माध्यम से SOS को zebrafish लार्वा में विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है. दृश्य इस रिपोर्ट में इस्तेमाल किया तकनीकों की विविधता सामांय नेत्र विकास के दौरान मुसीबत का इशारा के स्पष्ट अवलोकन की अनुमति, साथ ही साथ मुसीबत का इशारा बंद करने के दोषों का पता लगाने की क्षमता होगी । हमारे उदाहरण प्रोटोकॉल Gdf6, एक बीएमपी पृष्ठीय नेत्र और एसओएस बंद करने के ज्ञात नियामक के लिए स्थानीयकृत की जांच की सुविधा होगी । इसके अलावा, इन तकनीकों को प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के साथ जोड़ा जा सकता है आनुवंशिक कारकों या औषधीय एजेंटों कि उचित मुसीबत का इशारा गठन और बंद को प्रभावित पहचान । इसके अलावा, हम एक प्रोटोकॉल है जिसके माध्यम से सभी कोशिका झिल्ली के फ्लोरोसेंट इमेजिंग संभव है, प्रयोगकर्ता की अनुमति के लिए मुसीबत का इशारा आसपास की कोशिकाओं को रूपात्मक परिवर्तन का निरीक्षण कर शामिल है । हमारा लक्ष्य मानकीकृत प्रोटोकॉल का एक सेट है कि वैज्ञानिक समुदाय के लिए विकासशील आंख के इस उपंयास संरचना में नई अंतर्दृष्टि की पेशकश भर में इस्तेमाल किया जा सकता है स्थापित है ।

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Protocol

यहां बताई गई सभी विधियों को यूनिवर्सिटी ऑफ अलबर्टा एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी ने मंजूरी दे दी है ।

1. प्रोटोकॉल 1: एसओएस के दृश्य stereomicroscopy और विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) इमेजिंग का उपयोग

  1. भ्रूण संग्रह
    1. विक्लोरीनयुक्त पानी के एक टैंक में, एक महिला zebrafish के साथ एक पुरुष zebrafish बांधना द्वारा शाम में gdf6a+/- zebrafish के पार की तैयारी । सुनिश्चित करें कि भ्रूण एक छोटे से समय की सीमा के भीतर पैदा कर रहे हैं करने के लिए एक डिवाइडर का उपयोग करके महिला से पुरुष अलग करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    2. अगले सुबह, डिवाइडर खींचो और zebrafish की अनुमति के लिए अब से 30 मिनट के लिए नस्ल । E3 मीडिया, Zebrafish बुक12में वर्णित के साथ पेट्री व्यंजन में भ्रूण ले लीजिए, और उंहें एक २८.५ डिग्री सेल्सियस इनयूबेटर में जगह है ।
    3. किसी भी अनिषेचित अंडे या मृत भ्रूण को हटा दें, जो सफेद और अपारदर्शी दिखाई देगा ।
  2. तैयारी और लाइव-zebrafish भ्रूण की इमेजिंग
    1. 20 hpf से कम, e3 मीडिया के साथ E3 मीडिया ०.००४% 1-phenyl 2-thiourea (PTU) युक्त वर्णक उत्पादन को रोकने के लिए बदलें ।
      नोट: PTU के अलावा एक थोड़ा बाद में timepoint, जैसे 22-24 hpf, इमेजिंग के समय में भ्रूण की प्रारंभिक उम्र के कारण प्रयोग के साथ हस्तक्षेप करने की संभावना नहीं है. हालांकि, यह भ्रूण के इलाज के लिए जल्दी पूरी तरह से निखरता को रोकने के रूप में वहां निखरता कि पृष्ठीय आंख है, जो मुसीबत का इशारा की इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते है में प्रकट होता है की एक बैंड है की सिफारिश की है ।
    2. सुनिश्चित करें कि सभी भ्रूण निरीक्षण के समय तक अग्रणी विभिन्न बिंदुओं पर सही विकासात्मक चरणों में हैं । यह सिफारिश की है कि यह उन चरणों में किया जाता है जिस पर किम्मेल एट अल.13द्वारा उल्लिखित के रूप में सोमाइट संख्या स्पष्ट रूप से दिखाई देती है । उन लोगों को हटा दें जो विकास के लिए अपरिपक्व हैं ।
    3. एक विदारक खुर्दबीन के नीचे भ्रूण प्लेस, और धीरे से अलग चोरियों ठीक forceps का उपयोग कर खींच द्वारा भ्रूण dechorionate । पृष्ठीय आँख में मुसीबत का इशारा कल्पना । मुसीबत का इशारा आंख के पृष्ठीय मार्जिन पर एक इंडेंटेशन के रूप में प्रकट हो सकता है, और एक लाइन पृष्ठीय आंख भर में दिखाई जानी चाहिए । सामांय मुसीबत का इशारा बंद करने के लिए, लगभग 20-23 hpf पर भ्रूण का पालन करें । विलंबित मुसीबत का इशारा बंद करने के phenotypes की परीक्षा के लिए, 28 hpf या बाद में भ्रूण का निरीक्षण ।
    4. उन है कि नहीं से मुसीबत का इशारा बंद करने के शो देरी भ्रूण को सॉर्ट करें ।
    5. एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर इन भ्रूण की तस्वीर के लिए, E3 में 1% ऐगेरोस युक्त एक पेट्री पकवान तैयार करते हैं । हल्के से चुभन के केंद्र में एक उथले छेद बनाने के लिए जो भ्रूण के पीतक बैठ सकता है जब भ्रूण ऐगेरोस पर रखा जाता है । यह सुनिश्चित करेगा कि भ्रूण एक परोक्ष कोण पर नहीं है जब फोटो खिंचवाने जा रहा है ।
    6. Anesthetize भ्रूण के साथ ०.००३% tricaine E3 में और जगह laterally पर एगरोस ।
    7. एक यौगिक या संनाभि माइक्रोस्कोप का उपयोग कर भ्रूण छवि, ३५ मिमी पेट्री डिश में भ्रूण हस्तांतरण गैर के एक छोटे से बोल्स-gelled 1% कम पिघलने बिंदु ऐगेरोस में E3 (w/ जल्दी से एक ठीक मछली पकड़ने की रेखा या एक बरौनी का उपयोग कर भ्रूण की स्थिति और एगरोस शांत करने के लिए रुको । एक बार ऐगेरोस फर्म है, पकवान में पर्याप्त E3 डालना करने के लिए ऐगेरोस कवर । अधिक जानकारी के लिए, डिस्टल और Köster14देखें ।
      नोट: यदि एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, भ्रूण एक गिलास-coverslip नीचे पकवान के गिलास के खिलाफ रखा जा सकता है और एक मानक 20X उद्देश्य लेंस के साथ imaged ।
    8. एक यौगिक माइक्रोस्कोप के साथ मुसीबत का इशारा कल्पना करने के लिए एक जल विसर्जन 20x उद्देश्य लेंस का प्रयोग करें । दृश्य के बाद, धीरे भ्रूण से ऐगेरोस खींच और 4% paraformaldehyde में तय (पीएफए) या उनके विकास जारी रखने के लिए अनुमति देते हैं ।

2. प्रोटोकॉल 2: पूरे माउंट इमयूनोफ्लोरोसेंट laminin धुंधला

  1. पूरे माउंट इमयूनोफ्लोरोसेंट दाग के laminin: 1 दिवस
    1. यदि पहले से ही नहीं किया गया है, तो चरण 1.2.3 में वर्णित के रूप में Dechorionate भ्रूण । नए सिरे से बनाया में वांछित timepoint पर एक microcentrifuge ट्यूब में भ्रूण फिक्स एक कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए 4% पीएफए (22-25 डिग्री सेल्सियस) शेखर । 5 मिनट, चार बार के लिए 1x PBST में धो लें ।
      नोट: निम्न गैंयुलेशन, भ्रूण के बाद बेहतर निदान कर सकते हैं ।
    2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिलीग्राम/उष्मायन समय में भ्रूण पारगम्य विकास के चरण पर निर्भर करेगा (Thisse और Thisse15) को देखने के लिए ।
    3. 5 मिनट, चार बार के लिए 1x PBST में धो लें ।
    4. एक कमरे के तापमान शेखर पर 1-2 के लिए 1xPBST में 5% बकरी सीरम और 2 मिलीग्राम/मिलीलीटर गोजातीय सीरम एल्ब्युम (BSA) के समाधान में भ्रूण ब्लॉक ।
    5. एक 1:200 कमजोर पड़ने पर ब्लॉक समाधान में खरगोश विरोधी laminin एंटीबॉडी कमजोर द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करते हैं ।
    6. विरोधी में भ्रूण सेते-laminin प्राथमिक एंटीबॉडी एक 4 ° c शेखर पर रातोंरात ।
  2. पूरे-माउंट इमयूनोफ्लोरोसेंट दाग के laminin: 2 दिन
    1. 15 मिनट, पांच बार के लिए 1x PBST में धो लें ।
    2. बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा Fluor ४८८ एंटीबॉडी 1x PBST में 1:1000 की एक कमजोर पड़ने के लिए कमजोर द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करते हैं ।
      नोट: यह एक अलग द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रयोगकर्ता के लिए उपलब्ध संसाधनों के अनुरूप करने के लिए इस चरण को अनुकूलित करने के लिए संभव है ।
    3. माध्यमिक एंटीबॉडी में भ्रूण एक 4 ° c शेखर पर रातोंरात सेते । इस कदम के बाद से जितना संभव हो उतना प्रकाश से ढाल ।
    4. 1x PBST में 15 मिनट, चार बार के लिए धो लें । भ्रूण एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो ।
  3. विच्छेदन और भ्रूण आंखों के बढ़ते
    1. यदि वांछित, एक छोटी पेट्री डिश में भ्रूण जगह और 1x PBST में भ्रूण देयॉल्क । धीरे से ठीक संदंश और जर्दी थैली के हल्के scraping के माध्यम से जर्दी कोशिकाओं को हटाने के साथ जर्दी बाधित द्वारा यह मत करो ।
    2. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में पीबीएस-ग्लिसोल श्रृंखला समाधान के निम्नलिखित सांद्रता तैयार करें: 30%, ५०%, और PBS में ७०% ग्लिसोल. 30% glycerol/PBS में भ्रूण स्थानांतरण, समाधान के शीर्ष पर भ्रूण जगह सुनिश्चित करने और संभव के रूप में पिछले समाधान के कम के रूप में स्थानांतरित । भ्रूण के लिए प्रतीक्षा करने के लिए ट्यूब के नीचे सिंक ।
    3. जब भ्रूण नीचे करने के लिए डूब गया है, उंहें ५०% ग्लिसरोल के लिए स्थानांतरण/ दोहराएं और ७०% ग्लिसोल/PBS के लिए स्थानांतरण ।
    4. एक बार भ्रूण ७०% ग्लिसरोल/पीबीएस में डूब गया है, उन्हें विच्छेदों के लिए एक छोटे से प्लास्टिक की डिश में ले जाएँ ।
    5. मस्तिष्क के पीछे भ्रूण को विच्छेद करें, और यदि आवश्यक हो, तो जीनोटाइपिंग के लिए पीछे के ऊतकों का उपयोग करें ।
    6. एक गिलास स्लाइड के लिए सिर ले जाएं, संभव के रूप में थोड़ा ग्लिसरॉल के रूप में स्थानांतरित । सिर स्थिर रखने के लिए पीछे के अंत पर पकड़ करने के लिए संदंश या अन्य ठीक विच्छेदन उपकरण का उपयोग करें । एक ठीक minutien पिन या अंय ठीक विच्छेदन उपकरण का प्रयोग करें धीरे पूर्वकाल से अग्र मस्तिष्क वेंट्रिकले में डालने के लिए और नीचे पुश करने के लिए एक दूसरे से सिर के सही और बाएं आधा अलग । यह दोहराएं, जबकि मध्यमस्तिष्क के माध्यम से पीछे चल रहा है और मस्तिष्क वेंट्रिल में, अनिवार्य रूप से मिडलाइन नीचे सिर fileting । यह आंख और आसपास के ऊतकों के मैनुअल हेरफेर कम कर देता है, जिससे मुसीबत का इशारा अक्षतिग्रस्त छोड़ ।
    7. नीचे सिर मिडलाइन के प्रत्येक पक्ष माउंट, ऊपर आंख । कोनों पर वैक्यूम तेल की स्थिति चार पदों (coverslip इस्तेमाल किया जा रहा है के लिए एक उपयुक्त दूरी के अलावा) और एक गिलास coverslip के साथ कवर, नीचे क्रमिक रूप से प्रत्येक पोस्ट पर धक्का जब तक coverslip नमूनों के साथ संपर्क करता है । पिपेट coverslip के किनारे पर ७०% ग्लिसरॉल ताकि ग्लिसरॉल नीचे खींच लिया है, coverslip और स्लाइड के बीच अंतरिक्ष भरने ।
    8. एक दिन के भीतर छवि नमूने, या नेल पॉलिश और छवि के नमूनों के साथ coverslip चारों ओर मुहर ही नाखून पोलिश के बाद सूख गया है । 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर ।

3. प्रोटोकॉल 3: एसओएस के दृश्य egfp का उपयोग कर -caax mrna

  1. eGFP-CAAX mRNA का संश्लेषण
    1. pCS2 के 1 मिलीग्राम-egfp-caax प्लाज्मिड16 noti के साथ ४० मिलीलीटर की प्रतिक्रिया मात्रा में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए ।
    2. प्रतिबंध डाइजेस्ट प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, 10 मिलीलीटर RNase मुक्त पानी, २.५ मिलीलीटर 10% एसडीएस और २.० मिलीलीटर 10 मिलीग्राम/एमएल Proteinase कश्मीर जोड़ें ।
    3. ५० डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे सेते ।
    4. प्रतिक्रिया के लिए निंनलिखित जोड़ें (कुल मात्रा २०० मिलीलीटर) और अगले चरण के लिए आगे बढ़ें: ५० मिलीलीटर RNase-मुफ्त पानी, 20 मिलीलीटर 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच ५.२ और ७५.५ मिलीलीटर RNase-मुफ्त पानी
      नोट: RNase मुक्त पानी सोडियम एसीटेट की अत्यधिक कमजोर पड़ने को रोकने के लिए दो अलग अवसरों में जोड़ा जाता है ।
  2. phenol/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और इथेनॉल वर्षण के माध्यम से डीएनए का शुद्धिकरण
    1. जोड़ें २०० मिलीलीटर phenol: क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब और 20 एस के लिए भंवर 5 मिनट के लिए १८,००० एक्स जी पर केंद्रापसारक के माध्यम से जलीय और कार्बनिक चरणों अलग ।
    2. ऊपरी जलीय परत को एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर स्थानांतरित करें, जिससे कि नीचे कार्बनिक परत के अंतरण से बचा जा सके । नए ट्यूब के लिए क्लोरोफॉर्म की एक समान मात्रा जोड़ें ।
      नोट: क्लोरोफॉर्म के अलावा वैकल्पिक है, लेकिन यह नमूना से phenol की पूरी तरह से हटाने को सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है.
    3. 20 एस के लिए भंवर 5 मिनट के लिए १८,००० एक्स जी पर केंद्रापसारक के माध्यम से जलीय और कार्बनिक चरणों अलग ।
    4. पहले की तरह, एक नए microcentrifuge ट्यूब के लिए ऊपरी जलीय परत स्थानांतरण, नीचे कार्बनिक परत के हस्तांतरण से बचने के लिए सुनिश्चित कर रही है ।
    5. 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच ५.२ की 1/10 मात्रा जोड़ें ।
    6. 15 मिनट के लिए १००% RNase-नि: शुल्क इथेनॉल और चिल-20 ° c में के 3 खंड जोड़कर डीएनए हाला । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १८,००० x g पर सेंट्रीफ्यूज । एक गोली दिखाई जानी चाहिए । देकांत द सुपरनॅंट.
    7. ठंडा ७०% इथेनॉल/RNase मुक्त पानी की १०० मिलीलीटर के साथ गोली धो लें । धीरे से गोली ढीला को तोड़ने के बाद मिश्रण, १८,००० x g पर सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए । एक गोली दिखाई जानी चाहिए । देकांत द सुपरनॅंट.
    8. हवा 5 मिनट के लिए गोली सूखी और 7 मिलीलीटर पानी में डीएनए resuspend ।
      नोट: गोली उपलब्ध airflow के आधार पर 5 मिनट से अधिक समय के लिए सूख करने की आवश्यकता हो सकती है ।
  3. Transcription और eGFP के शुद्धिकरण-CAAX mRNA
    1. एक rnase मुक्त तरीके से, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Sp6 rna पोलीमरेज़ किट के साथ विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में तैयार, शुद्ध अर्थवान प्लाज्मिड डीएनए के बारे में 1 मिलीग्राम का उपयोग कर चरण ३.२ में प्राप्त किया । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए इनसेबेट ।
      नोट: Sp6 आरएनए पॉलीमरेज़ का उपयोग छाया मृणा के उत्पादन के लिए किया जाना चाहिए ।
    2. 1 मिलीलीटर के DNase जोड़ें (2 U/ RNase free) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते ।
    3. एमआरएनए को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए शोधन किट के साथ शुद्ध करना । एमएनए को दोहराया फ्रीज गल से बचने के लिए, और-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  4. इंजेक्शन और विज़ुअलाइज़ेशन
    1. भ्रूण १.१ प्रोटोकॉल में उल्लिखित के रूप में प्राप्त करें ।
    2. एक microinjection उपकरण का उपयोग कर, 1-सेल चरण में eGFP-CAAX mRNA के ३०० स्नातकोत्तर इंजेक्ट ।
    3. एक प्रतिदीप्ति त्रिविमदर्शी का उपयोग आंखों में eGFP की उज्ज्वल अभिव्यक्ति के साथ भ्रूण के लिए स्क्रीन ।
    4. छवि भ्रूण के रूप में प्रोटोकॉल १.२ में वर्णित है ।
    5. वैकल्पिक रूप से, dechorionate और 4% में वांछित timepoint पर भ्रूण को ठीक 4 घंटे के लिए खाद्य अपमिश्रण के कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर । 5 मिनट के लिए 1x PBST में भ्रूण धोने, चार बार, और dechorionate, अगर पहले नहीं किया । आंखें काटना और उंहें स्लाइड पर माउंट के रूप में प्रोटोकॉल २.३ में वर्णित है ।

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Representative Results

zebrafish मुसीबत का इशारा पृष्ठीय रेटिना8में 20 hpf पर प्रकट होता है । 23 hpf द्वारा अपनी प्रारंभिक संकीर्ण वास्तुकला से एक विस्तृत इंडेंटेशन के लिए मुसीबत का इशारा संक्रमण और 26 hpf द्वारा यह अब8दिखाई नहीं है । इसलिए, सामांय zebrafish नेत्र विकास के दौरान मुसीबत का इशारा जांच करने के लिए, भ्रूण 20-23 hpf के बीच मनाया जाना चाहिए । इस अवधि के दौरान, मुसीबत का इशारा माइक्रोस्कोप के माध्यम से और डीआईसी इमेजिंग के माध्यम से पृष्ठीय नेत्र कि नाक और विकासशील रेटिना के लौकिक हिस्सों अलग करता है (चित्रा 1) में एक पतली रेखा के रूप में नमूदनीय है । इसके अलावा, एक सूक्ष्म इंडेंटेशन आंख की पृष्ठीय सीमा में दिखाई दे सकता है (चित्रा 1) । लैमिनिन के प्रतिदीप्तिदीप्त अभिरंजक के बाद, पतली रेखा को तहखाने झिल्ली (चित्रा 1) होने की पुष्टि की जा सकती है ।

देरी मुसीबत का इशारा बंद करने में जिसके परिणामस्वरूप आणविक रास्ते की जांच करने के लिए, हम इस के रूप में एक timepoint है कि पर्याप्त सामांय मुसीबत का इशारा बंद करने के समय से हटा दिया जाता है और है, इसलिए, एसओएस बंद करने के कारण एक विश्वसनीय मार्कर है 28 hpf पर भ्रूण निरीक्षण करने के लिए चुना प्रयोगात्मक जोड़तोड़. 28 hpf zebrafish के प्रत्यक्ष दृश्य के माध्यम से विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से, प्रायोगिक हेरफेर के कारण मुसीबत का इशारा बंद करने में देरी का मूल्यांकन करने के लिए संभव है । जब मुसीबत का इशारा बंद करने में देरी हो रही है, अपनी लंबी उपस्थिति विदारक माइक्रोस्कोप के तहत आंख के पृष्ठीय पक्ष में एक स्पष्ट फांक के रूप में देखा जा सकता है (चित्रा 2) । जब मिश्रित माइक्रोस्कोप के तहत डीआईसी या Nomarski प्रकाशिकी का उपयोग करते हुए मनाया, यह सुविधा और भी प्रमुख है, और आंख के नाक और लौकिक पक्ष मुसीबत का इशारा है, जो पृष्ठीय नेत्र में एक पंक्ति के रूप में स्पष्ट रूप से दिखाई है द्वारा अलग कर रहे है (चित्रा 3) ।

एसओएस लमिन् स सहित बेसल लमिना घटकों से पंक्तिवाला है । इसलिए, immunofluorescent धुंधला तय भ्रूण में मुसीबत का इशारा बंद का मूल्यांकन करने की एक पूरक विधि प्रदान करता है । जब एक पार्श्व दृष्टि से भ्रूण नेत्र इमेजिंग, बेसल लेमिना आंख के बाहरी मार्जिन, दोनों नेत्र दरारें, और लेंस और रेटिना के बीच की सीमा (चित्रा 4) ओ । एसओएस सीधे आंख के पृष्ठीय पहलू में रंजित विदर के विपरीत उंमुख है । पूरे भ्रूण laterally घुड़सवार जा सकता है, कुछ हद तक बेहतर ऑप्टिकल अगर आंखें पहले microdissected है हासिल की स्पष्टता के साथ । द्वारा 28 hpf, वाइल्डटाइप zebrafish में, laminin धुंधला होना स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि मुसीबत का इशारा पूरी तरह से बंद है, जो इस विदर बंद करने में देरी की निगरानी के लिए आदर्श मंच बनाता है ।

eGFP-CAAX mRNA के इंजेक्शन एक जीवित या स्थिर भ्रूण की कोशिका झिल्ली के दृश्य की अनुमति देता है (चित्रा 5). सफल एक सेल स्टेज इंजेक्शन पूर्ण कोशिका झिल्ली प्रतिदीप्ति के साथ भ्रूण का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त है । पार्श्व दृश्य में, सभी सेलुलर सीमाओं gfp प्रतिदीप्ति द्वारा चिह्नित किया जाना चाहिए, और इस तरह के रूप में, सेल आकारिकी भी स्पष्ट रूप से मनाया जाता है. यह कोशिकाओं है कि मुसीबत का इशारा बंद करने के लिए नेतृत्व के रूपात्मक परिवर्तन के दृश्य की अनुमति देता है ।

Figure 1
चित्रा 1 सामान्य zebrafish नेत्र विकास के दौरान मुसीबत का इशारा का अवलोकन. Zebrafish भ्रूण एकत्र और 22 hpf पर imaged थे । ए-बी. 22 hpf भ्रूण के पार्श्व दृश्य लाइव-विदारक माइक्रोस्कोप के साथ imaged (क) और डीआईसी इमेजिंग (बी), क्रमशः के माध्यम से । SOS एक लाल तारांकन चिह्न द्वारा चिह्नित किया गया है । C. एक 22 hpf भ्रूण का laminin immunoफ्लुरोसेंट धुंधला । भ्रूण 4% पीएफए में तय किए गए और लैमिनिंग के पूरे माउंट इमयूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के लिए प्राप्त किया । भ्रूण को फाईल किया गया और ७०% ग्लिसोल/पीबीएस में रखा गया । एकल स्लाइस छवियों एक सॉफ्टवेयर के साथ संनाभि इमेजिंग के माध्यम से प्राप्त किया गया । SOS एक श्वेत तारांकन चिह्न द्वारा चिह्नित किया गया है । सभी आंकड़े एनोटेटेड और एडोब Illustrator सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इकट्ठे हुए थे । स्केल सलाखों ५० मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: zebrafish लार्वा में मुसीबत का इशारा बंद करने में देरी की माइक्रोस्कोप छवियों विदारक । वाइल्डटाइप और gdf6a-/- भ्रूण एकत्र और रहते थे-28 hpf पर imaged । a . एक बंद मुसीबत का इशारा के साथ एक वाइल्डटाइप भ्रूण का पार्श्व दृश्य । ख. एक gdf6a के पार्श्व दृश्य-/- एक मुसीबत का इशारा बंद करने में देरी (तारांकन) के साथ भ्रूण । एक तेज अवसाद आंख के पृष्ठीय पहलू में चौकस करने के लिए उचित रूप से बंद करने के लिए मुसीबत का इशारा की विफलता के कारण है । स्केल सलाखों ५० मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: zebrafish भ्रूणीय नेत्र में मुसीबत का इशारा के प्रतिनिधि डीआईसी छवियां । वाइल्डटाइप और gdf6a-/- भ्रूण एकत्र किए गए, anesthetized, और एक ३५ मिमी पेट्री डिश पर E3 में 1% ultrapure कम पिघलने बिंदु ऐगेरोस में laterally रखा । पकवान E3 से भरा था, और एक 20x पानी की सूई उद्देश्य के साथ एक यौगिक माइक्रोस्कोप डीआईसी इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था । a . एक बंद मुसीबत का इशारा के साथ एक वाइल्डटाइप भ्रूण का पार्श्व दृश्य । ख. एक gdf6a के पार्श्व दृश्य-/- एक मुसीबत का इशारा बंद करने में देरी (तारांकन) के साथ भ्रूण । मुसीबत का इशारा आंख के पृष्ठीय पहलू में एक पतली रेखा के रूप में नमूनायोग्य है । स्केल सलाखों ५० मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: भ्रूण zebrafish आंख में laminin immunoफ्लुओरोसेंट धुंधला के प्रतिनिधि छवियों । gdf6a-/- भ्रूण को एकत्र किया गया और 28 hpf में 4% खाद्य अपमिश्रण निवारण में तय की । बेसल लेमिना को रोगरहित किया गया और भ्रूण को संनाभि इमेजिंग के लिए ७०% ग्लिसोल/पीबीएस में रखा गया । एकल स्लाइस छवियों ज़ेन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त किया गया । a . एक बंद मुसीबत का इशारा के साथ एक वाइल्डटाइप भ्रूण का पार्श्व दृश्य । ख. एक gdf6a के पार्श्व दृश्य-/- एक मुसीबत का इशारा बंद करने में देरी (तारांकन) के साथ भ्रूण । बेसल लमिना में आँख के पृष्ठीय भाग में दिखाई देने वाले gdf6a- भ्रूणों के साथ हरे रंग में नेत्र की रूपरेखा दर्शाई गई है । स्केल सलाखों ५० मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: eGFP-caax mRNA इंजेक्शन के बाद zebrafish भ्रूणीय नेत्र की इमेजिंग । वाइल्डटाइप भ्रूण 1-सेल स्टेज पर eGFP-caax mRNA के ३०० स्नातकोत्तर के साथ इंजेक्शन थे । 22 hpf और 28 hpf पर क्रमशः, भ्रूण ऊपर और एक ३५ मिमी पेट्री डिश पर E3 में 1% ultrapure कम पिघलने बिंदु ऐगेरोस में laterally घुड़सवार थे । एक 20x पानी की सूई उद्देश्य के साथ एक संनाभि माइक्रोस्कोप इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था, और एक टुकड़ा छवियों एक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त किया गया । a . gdf6a का पार्श्व दृश्य -/- एक दृश्यमान खुला SOS (तारांकन) के साथ 22 hpf पर भ्रूण । B. 22 hpf पर एक gdf6a-/- भ्रूण के बढ़े हुए पैनल । C. एक gdf6a के पार्श्व दृश्य-/- एक मुसीबत का इशारा बंद करने में देरी के साथ 28 hpf पर भ्रूण । D. 28 hpf पर एक gdf6a-/- भ्रूण के बढ़े हुए पैनल । स्केल पट्टियां क्रमशः पैनलों A और C, और B और D में ५० mm और 10 mm का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां, हम प्रोटोकॉल की एक मानकीकृत श्रृंखला प्रस्तुत करने के लिए विकासशील zebrafish भ्रूण में मुसीबत का इशारा निरीक्षण । बंद करने में देरी phenotypes निर्धारित करने के लिए, हमारे प्रोटोकॉल के दो असतत lobes की जुदाई अंतर करने की क्षमता पर ध्यान केंद्रित किया है पृष्ठीय-नाक और पृष्ठीय आंख के लौकिक पक्षों, रंजित विदर बंद करने में देरी की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया तकनीक के समान अधर नेत्र में फीनोटाइप

इन दृश्य तकनीकों आनुवंशिक हेरफेर तकनीकों की एक किस्म के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है बाधा या कुछ जीन की अभिव्यक्ति उत्प्रेरण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए मुसीबत का इशारा के बंद में अपनी भूमिकाओं का अध्ययन । हम इन gdf6a का उपयोग कर प्रोटोकॉल -/- भ्रूण के रूप में हम पहले से पता चला है कि इसके नुकसान मुसीबत का इशारा के उचित बंद को प्रभावित कर सकते है चुना है, लेकिन प्रोटोकॉल के रूप में किसी भी जीन की अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है आवश्यक. यह अनुशंसा की जाती है कि पृष्ठीय नेत्रों में होने वाले किसी भी रूपात्मक परिवर्तन को विच्छेदी सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करके प्रेक्षणों के साथ प्रारंभिक अध्ययन किया जाए । अंय तकनीकों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए एक बार एक प्रारंभिक लिंक निश्चित स्थापित है, के रूप में वे अधिक समय लेने वाली और कम थ्रपुट हैं ।

जबकि प्रोटोकॉल आसानी से experimenter की जरूरतों के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है, वहां कई पहलुओं है कि ध्यान से पालन किया जाना चाहिए रहे हैं । इस संरचना की क्षणिक प्रकृति के कारण यह सुनिश्चित करना अनिवार्य है कि सभी मनाया जाने वाला भ्रूण समान विकासात्मक अवस्था का हो । हमारे काम के लिए, हम यह महत्वपूर्ण करने के लिए केवल प्रजनन समय की एक छोटी सी खिड़की की अनुमति है और आवधिक रूप से जल्दी विकास के दौरान भ्रूण सॉर्ट करने के लिए लगता है । समकारी चरणों का सबसे महत्वपूर्ण कदम 20 hpf पर है, जब आप अभी भी सही somites (24)17गिनती कर सकते हैं, और हम यह बहुत अधिक विश्वसनीय मचान बानगी है कि 28 hpf पर समय चित्रित करना से लगता है । इसके अलावा, निखरता को हिचकते या संरचना का सफल दृश्य सुनिश्चित करने के लिए हटा दिया जाना चाहिए । हम आंखों में निखरता मनाया 22 hpf के आसपास शुरू शुरू होता है, और वहां पृष्ठीय नेत्र कि मुसीबत का इशारा के उचित दृश्य के साथ हस्तक्षेप कर सकते है में निखरता का एक पैटर्न है । इसलिए, यह अत्यधिक करने के लिए सफल दृश्य सुनिश्चित करने के लिए निखरता से पहले ptu के साथ भ्रूण के इलाज की सिफारिश की है । इसके अतिरिक्त, भ्रूण आंख के विच्छेदन क्षति के कारण के बिना बढ़ते स्लाइड से पहले कुछ अभ्यास की आवश्यकता है । यह भी आवश्यक है laterally के रूप में स्लाइड के लिए संभव के रूप में समानांतर आंखें माउंट । यह अनुशंसित है कि प्रयोग के लिए पहले अतिरिक्त भ्रूण के साथ प्रयोगकर्ता इन तकनीकों का अभ्यास करें ।

बेसल लमिना के इमयूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के अपवाद के साथ, यहां वर्णित प्रोटोकॉल के सभी जीवित भ्रूण का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है । यह जल्दी भ्रूणयोजनसिस भर में मुसीबत का इशारा के नित्य दृश्य की अनुमति देता है, प्रयोगकर्ता के बंद होने में शामिल रूपात्मक परिवर्तन के समय चूक अध्ययन का संचालन करने की इजाजत दी । अतीत में, हम रेटिना विशिष्ट transgenes, जैसे टीजी (rx3: eGFP), जो प्रारंभिक विकास के दौरान तंत्रिका रेटिना के निशान का उपयोग किया है. हालांकि यह कोशिका झिल्ली कल्पना करने की क्षमता का अभाव है, टीजी का उपयोग (rx3: eGFP) microinjections की आवश्यकता नहीं का लाभ है और वास्तविक समय में एसओएस वास्तुकला के लिए सकल रूपात्मक परिवर्तन visualizing की हमारी प्राथमिक विधि किया गया है. यह प्रोटोकॉल यहां शामिल नहीं किया गया है, के रूप में समान तरीके पहले इस जर्नल18,19में चर्चा की गई है । तथापि, एसओएस निर्माण और बंद होने के सेल जैवीय आधार की जांच से झिल्ली फ्लोरोसेंट प्रोटीन की आवश्यकता होगी । विशेष रूप से, eGFP के इंजेक्शन CAAX mRNA एसओएस के आसपास कोशिका झिल्ली के दृश्य की अनुमति देता है के रूप में चित्रा 5 में देखा है, जो हमें पृष्ठीय नेत्र में कोशिका आकृति परिवर्तन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है कि उचित मुसीबत का इशारा बंद करने के लिए आवश्यक हैं । जबकि eGFP-CAAX एसओएस बंद करने की लाइव इमेजिंग प्रदर्शन के लिए उपयोगी हो सकता है, यह zebrafish में आवरण परत की उपस्थिति से मुश्किल बना दिया है । इसके अलावा, देखभाल जब mRNA इंजेक्शन से परिणाम का विश्लेषण किया जाना चाहिए क्योंकि यह मोसैसिज्म में परिणाम कर सकते हैं, यह मुश्किल सीधे eGFP अभिव्यक्ति की शक्ति के परिमाणन के आधार पर भ्रूण की तुलना करने के लिए बना । यह ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों के उपयोग के माध्यम से ameliorated जा सकता है कि प्रतिदीप्ति लेबल कोशिका झिल्ली विशेष रूप से विकासशील रेटिना में, जैसे टीजी (vsx 2.2: GFP-caax)।

हमारे प्रोटोकॉल की चुनौतियों में से एक है कि पूरी तरह से प्रवेश नहीं है किसी भी इलाज के साथ निहित है । हम पहले से ध्यान दिया है कि मुसीबत का इशारा देरी नियंत्रण भ्रूण के बारे में 10% में 28 hpf8में देखा जा सकता है, और किसी भी प्रयोगात्मक समूह के भीतर एक मुसीबत का इशारा के साथ भ्रूण की इस अंतर्निहित उपस्थिति यह मुश्किल प्रयोगात्मक के सूक्ष्म प्रभाव का पालन करने के लिए कर सकता है हेरफेर. यह प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह को कम करने के लिए और प्रयोग की शक्ति को बढ़ाने के लिए प्रत्येक प्रायोगिक समूह के भीतर इस्तेमाल भ्रूण की संख्या में वृद्धि करके प्रयोग कंकरीट द्वारा संबोधित किया जा सकता है । इसके अलावा, विश्लेषण की अवस्था को 29-30 hpf में स्थानांतरित किया जा सकता है ।

प्रोटोकॉल के इस सेट के साथ, हम जिस तरह से के माध्यम से मुसीबत का इशारा बंद करने में देरी visualized है मानकीकृत करना चाहते हैं । ऊपर वर्णित तकनीकों का पता लगाने में विश्वसनीय होना दिखाया गया है और प्रयोगात्मक सेटिंग्स की एक किस्म में मुसीबत का इशारा बंद करने में देरी visualizing और experimenter की जरूरत के लिए अनुकूलनीय हैं । जब तक हम ऐसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग या ट्रांसजेनिक भ्रूण के समय चूक इमेजिंग के रूप में तकनीक का इस्तेमाल किया है अधिक से अधिक विस्तार में मुसीबत का इशारा कल्पना, हमारे यहां उद्देश्य प्रोटोकॉल का एक मानकीकृत सेट है कि उच्च थ्रूपुट प्रयोगात्मक करने के लिए उत्तरदाई है बनाने के लिए है डिजाइन बंद करने में देरी phenotypes स्कोर करने की क्षमता पर जोर देने के साथ एक ही दिन में भ्रूण की एक बड़ी संख्या कल्पना करने के लिए । gdf6a-/- भ्रूण के साथ इसके उपयोग के अलावा, हम मुसीबत का इशारा बंद करने में देरी phenotypes औषधीय उपचार, morpholino इंजेक्शन के साथ इन दृश्य तकनीकों का उपयोग कर, और आरएनए overexpression अध्ययन का पालन करने में सक्षम है । के रूप में आंख के विकास में मुसीबत का इशारा की भूमिका के विभिंन साधनों के माध्यम से आगे आविर्भाव है, हमें उंमीद है कि प्रोटोकॉल के इस मानकीकृत सेट वैज्ञानिक समुदाय एक आम भाषा है जिसके माध्यम से इस उपंयास संरचना का अध्ययन किया है प्रदान करते हैं ।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए कोई परस्पर विरोधी हित नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (CIHR), प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC), अलबर्टा Innovates प्रौद्योगिकी फ्यूचर्स, और महिलाओं और बच्चों के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (WCHRI) द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl 2-thiourea Sigma Aldrich P7629-10G
100 mm Petri dish Fisher Scientific FB0875713
35 mm Petri dish Corning CLS430588
Agarose BioShop Canada Inc. AGA001.1
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope Zeiss AxioImager Z1
Dissection microscope Olympus SZX12
Dissection microscope camera Qimaging MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease Fisher Scientific 14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma Aldrich A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 Abcam ab150077
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Image capture software Zeiss ZEN
Incubator VWR Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Microscope slide Fisher Scientific 12-544-2
Minutien pin Fine Science Tools 26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
NotI New England Biolabs R0189S
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 Fisher Scientific BP1752-100
Proteinase K Sigma Aldrich P4850
Rabbit anti-laminin antibody Millipore Sigma L9393
TURBO Dnase (2 U/µL) Invitrogen AM2238
Ultrapure low-melting point agarose Invitrogen 16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Invitrogen 15525017

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References

  1. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
  2. Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
  3. Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
  4. Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
  5. Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
  6. Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
  7. Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
  8. Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
  9. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
  10. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  11. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  14. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  15. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
  16. Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  18. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
  19. Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).

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<em>Danio rerio</em> भ्रूणयोजनजनन के दौरान बेहतर नेत्र परिखा का दृश्य
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Yoon, K. H., Widen, S. A., Wilson,… More

Yoon, K. H., Widen, S. A., Wilson, M. M., Hocking, J. C., Waskiewicz, A. J. Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59259, doi:10.3791/59259 (2019).

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