在这种方法中, 胚胎心脏组织被手术显微解剖, 离解, 荧光标记, 并植入宿主胚胎组织。这为研究异位血流动力学条件下的个体或组织水平发育组织以及/或改变后的副血流/朱克沙林环境提供了一个平台。
解释细胞自主模式与外在微环境对细胞谱系测定的相对影响是发育生物学研究中的一个普遍挑战。在胚胎心脏, 这可能是特别困难的, 因为区域差异的表达转录调节剂, 副朱克林/朱克辛胺信号提示, 和血流动力学力量都知道影响心肌细胞成熟。因此, 改变正在发育的心肌细胞分子和生物力学微环境的简化方法将成为研究局部条件如何影响细胞命运和功能的有力技术。为了解决这个问题, 我们优化了一种将幼年体心肌细胞移植到心脏或周围胚胎组织异位的方法。这使我们能够研究微环境条件如何影响完整胚胎内单个细胞的心肌细胞命运转变。在这里, 我们描述了一个协议, 其中胚胎肌细胞可以从各种心脏子域分离, 离解, 荧光标记, 并微注射到宿主胚胎与高精度。然后, 可以使用各种成像和组织学技术直接对细胞进行原位分析。该方案是一个强大的替代传统的嫁接实验, 可以是令人望而却步的困难, 在移动组织, 如心脏。该方法的概述也可适用于各种供体组织和宿主环境, 其易用性、低成本和速度使其成为各种发育研究的潜在有用应用。
心脏发育研究从胚系转基因模型系统的出现中获益匪浅, 这些模型系统已经确定了许多基因调控网络, 这些网络的模式是心脏中不同的细胞谱系和功能域。然而, 确定这些基因网络如何与微环境条件相互作用并对其作出反应, 包括辅助神经/朱克沙克林信号和生物物理输入 (拉伸、应变、血流动力学), 可能具有挑战性。因此, 并不总是容易确定细胞表型是遗传扰动的直接结果, 还是适应心脏生物力学或高阶组织成分 1, 2 的次要结果.
嫁接实验通常被用来处理命运规范、承诺、归纳和能力3、4的概念, 它将是规避其中固有的一些挑战的理想方法。定义细胞自主与环境对心脏的影响。不幸的是, 心脏收缩使标准的嫁接方法困难。组织的快速运动通常会阻止移植细胞粘附心脏和大组织穿刺 (通常需要移植), 经常导致心脏衰竭和胚胎死亡5, 6,7.因此, 我们开发了一种基于压力的微注射系统, 用于发育中的雏鸡心脏进行精确的细胞植入, 绕过了前面描述的 8,9的组织移植技术障碍。使用这种技术, 从供体胚胎中分离出的单个或小群心肌细胞可以被微注射到宿主胚胎心脏的各种区域, 从而消除了广泛的宿主准备和大组织侮辱的需要使用标准的嫁接技术。用于这些植入研究的微注射针的外径为 ~ 30-40μm, 这意味着针头可以直接放置在目标组织中 (即可以穿透胚胎心肌壁), 细胞可以集中交付。对周围组织造成的损害最小。该协议可用于执行各种同位素、异位、同极和异质性慢性操作, 为直接研究开发过程中的经典实验胚胎学范式提供了一种快速、灵活、低成本的方法。四腔的心脏。
在下面概述的协议中, 我们用一种蠕动的荧光染料标记供体细胞, 这样可以实时监测微注射实验的成功, 并记录移植细胞的位置, 而不需要任何额外的染色。然而, 应该注意的是, 这种方法最适合短期实验 (约 48小时), 因为荧光染料可以通过细胞分裂丢失。可用于长期实验的替代方法。
当我们在心脏发育的背景下介绍这项技术时, 我们已经将其用于中胚层、头部、四肢和体细胞的细胞植入实验中发挥了巨大的作用。因此, 下面描述的基本方法是高度可操作的, 可以在各种器官系统中使用。
能够定义微环境条件如何影响心脏细胞命运的规范和血统稳定是建立先天性心脏病的压缩理解以及制定适当的有效协议的根本干细胞成熟或体细胞重组为基础的心肌细胞。上述协议使研究人员能够在体内改变的条件下直接检测心肌细胞的发育, 从而使细胞自主成熟过程与副瑞克西沙林和/或血流动力学线索分离。当与高分辨率成像、遗传分析和生理检测相结合时, 这种技术可以作为现有转基因模型的有力补充。
从技术立场, 这里介绍的协议依赖于有效的隔离, 标记, 并精确地植入宿主胚胎组织供体心脏细胞。微注射系统的使用极大地帮助了供体细胞的靶向, 并允许成功植入, 而无需在宿主组织中创建一个大型的植入位点。然而, 执行此技术需要一些操作技能, 因为如果注射针没有仔细地放置在目标组织中 (导致心脏破裂或局部血管破裂), 可能会导致生存能力下降。还应该注意和考虑隔离和标记步骤。供体组织的过度消化会导致植入效率低下, 而瞬态标记技术可能会限制可跟踪供体细胞的时间窗口 (因为细胞分裂会冲淡标签)。
这种技术是高度可修改的, 可以适应各种用途。例如, 可以分离出大量组织和阶段的供体细胞 (尽管需要优化酶消化), 同样也可以在不同的发育阶段注射到各种宿主组织中。同样, 可以修改标记方法, 以跟踪不同时间窗口中的细胞, 包括使用荧光无机半导体纳米晶体进行更长的瞬态标记, 以及从绿色植入鹌鹑细胞或细胞荧光蛋白转基因 (gfp +) 供体胚胎11 为永久标记。
虽然我们目前在鸟类植入研究中使用这种技术, 但我们觉得它可以用于未来的大量嵌合研究。例如, 转基因生物的转基因心肌细胞可以使用非常相似的协议被分离并微注射到鸟类心脏中。此外, 从干细胞或通过体细胞重组方法分化为心肌细胞的细胞可以微注射到胚胎心脏, 以评估它们在体内生物力学作用下融入组织和成熟的情况条件。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家卫生研究院、国家心脏、肺和血液研究所 (nhlbi) 颁发的 r00hl122360 赠款的支持。
1 mL Insulin Syringe | BD | 329654 | |
1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 24-282 | |
10 ml Syringe | BD | 305482 | |
1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-430 | |
15 mL Centriguge Tubes, Racked | Genesee Scientific | 28-101 | |
1588 Genesis Hova-Bator Incubator | GQF | 813927021221 | |
18G x 1 1/2 Needle | BD | 305196 | |
200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-412 | |
32G x 1/2" Needle | TSK Steriject Air-Tite | TSK3213 | |
Alchohol Wipes 70% | Thermo Fisher Scientific | 19015744 | |
Angled Forceps | Fine Scientific Tools | 11260-20 | |
Backloading Tips | Eppendorf | 930001007 | |
Black India Ink | KOH-I-NOOR | 3084-F | |
CellTracker Green CMF | Thermo Fisher Scientific | C7025 | 1 mM in DMSO |
CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 1 mM in DMSO |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Commercial Grade Packing Tape | Staples | 2619001 | |
Curved Tenotomy Scissors | Fine Scientific Tools | 14067-11 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
DMSO, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000021 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | |
Hatching Eggs | Pilgrim's Hatchery | — | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
Injectman 4 | Eppendorf | 5192000027D | |
Micromanipulator | Leica Microsystems | — | |
Parafilm | SIGMA | P6543-1EA | |
Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 100496-496 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-022 | |
Petri Dish | Genesee Scientific | 32-107 | |
Pipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
Pipette Puller | HEKA | PIP 6 | |
Scotch Transparent Tape | Staples | 487909 | |
Sigmacote | SIGMA | SL2-25ML | |
Stereo Microscope | Leica | — | |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
Transfer Pipette | Thermo Fisher Scientific | 273 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 |