Het integreren van visuele Psychophysical assays binnen een Y-doolhof om de rol te isoleren die visuele functies spelen in navigatie beslissingen

Summary

Hier presenteren we een protocol om een gedrags test aan te tonen die kwantificeert hoe alternatieve visuele kenmerken, zoals bewegings aanwijzingen, directionele beslissingen in vissen beïnvloeden. Representatieve gegevens worden gepresenteerd op de snelheid en nauwkeurigheid waar Golden shiner (Notemigonus crysoleucas) volgen virtuele vissen bewegingen.

Abstract

Collectief Dierengedrag vloeit voort uit individuele motivaties en sociale interacties die cruciaal zijn voor individuele fitheid. Vissen hebben al lang een onderzoek naar collectieve bewegingen geïnspireerd, met name hun vermogen om milieu-en sociale informatie te integreren in de ecologische context. Deze demonstratie illustreert technieken die worden gebruikt voor het kwantificeren van gedrags responsen van vissen, in dit geval Golden shiner (Notemigonus crysoleucas), aan visuele stimuli met behulp van computer visualisatie en digitale beeldanalyse. Recente ontwikkelingen in computer visualisatie zorgen voor empirische testen in het Lab waar visuele functies kunnen worden bestuurd en fijn gemanipuleerd om de mechanismen van sociale interacties te isoleren. Het doel van deze methode is om visuele kenmerken te isoleren die de directionele beslissingen van het individu kunnen beïnvloeden, of het nu eenzame of met groepen is. Dit protocol biedt specifieke informatie over het fysieke Y-doolhof domein, opnameapparatuur, instellingen en kalibraties van de projector en animatie, experimentele stappen en gegevensanalyses. Deze technieken tonen aan dat computeranimatie biologisch zinvolle reacties kan opwekken. Bovendien zijn de technieken gemakkelijk aanpasbaar om alternatieve hypotheses, domeinen en soorten te testen voor een breed scala aan experimentele toepassingen. Het gebruik van virtuele stimuli zorgt voor de reductie en vervanging van het aantal levende dieren dat nodig is, en verlaagt daardoor de overhead van het laboratorium.

Deze demonstratie test de hypothese dat kleine relatieve verschillen in de bewegings snelheden (2 lichaams lengtes per seconde) van virtuele condetails de snelheid en nauwkeurigheid zullen verbeteren waarmee shiners de richtingaanwijzers volgen die door de virtuele Silhouetten. Resultaten tonen aan dat shiners directionele beslissingen aanzienlijk worden beïnvloed door stijgingen van de snelheid van de visuele aanwijzingen, zelfs in de aanwezigheid van achtergrondruis (67% beeld coherentie). Bij afwezigheid van bewegings aanwijzingen kozen proefpersonen willekeurig hun aanwijzingen. De relatie tussen de beslissings snelheid en de Cue-snelheid was variabel en de toename van de Cue-snelheid had een bescheiden onevenredige invloed op de directionele nauwkeurigheid.

Introduction

Dieren voelen en interpreteren hun habitat continu om weloverwogen beslissingen te nemen bij interactie met anderen en het navigeren door lawaaierige omgevingen. Individuen kunnen hun situationeel bewustzijn en besluitvorming verbeteren door sociale informatie in hun acties te integreren. Sociale informatie komt echter grotendeels voort uit deductie door middel van onbedoelde aanwijzingen (d.w.z. plotselinge manoeuvres om een roofdier te vermijden), wat onbetrouwbaar kan zijn, in plaats van via directe signalen die zijn geëvolueerd om specifieke berichten te communiceren (bijv. het waggle dansen in honingbijen)¹. Identificeren hoe individuen snel de waarde van sociale signalen of zintuiglijke informatie beoordelen, kan een uitdagende taak voor onderzoekers zijn, vooral wanneer individuen in groepen reizen. Visie speelt een belangrijke rol in de omgang met sociale interacties^2,3,4 en studies hebben de interactie netwerken afgeleid die kunnen ontstaan in visscholen op basis van het gezichtsveld van elk individu^{5, 6}. Visscholen zijn echter dynamische systemen, waardoor het moeilijk is om individuele reacties op bepaalde functies of naburige gedragingen te isoleren, vanwege de inherente collineiteiten en verstorende factoren die voortvloeien uit de interacties tussen groepsleden. Het doel van dit protocol is om de huidige werkzaamheden aan te vullen door te isoleren hoe alternatieve visuele kenmerken de directionele beslissingen van individuen die alleen of binnen groepen reizen kunnen beïnvloeden.

Het voordeel van het huidige protocol is om een manipulatief experiment te combineren met computer visualisatietechnieken om de elementaire visuele kenmerken te isoleren die een individu in de natuur kan ervaren. Specifiek, de Y-doolhof (Figuur 1) wordt gebruikt om de directionele keuze samen te vouwen tot een binaire reactie en introduceren computer geanimeerde beelden ontworpen om het gedrag van het zwemmen van virtuele buren na te bootsen. Deze beelden worden geprojecteerd vanaf onder het doolhof om de silhouetten van condetails die onder een of meer onderwerpen zwemmen na te bootsen. De visuele kenmerken van deze silhouetten, zoals hun morfologie, snelheid, coherentie en zwemgedrag, zijn gemakkelijk op maat gemaakt om alternatieve hypotheses⁷te testen.

Deze paper demonstreert het nut van deze aanpak door te isoleren hoe individuen van een model sociale vissoorten, de Golden shiner (Notemigonus crysoleucas), reageren op de relatieve snelheid van virtuele buren. Het protocol focus, hier, is op of de directionele invloed van virtuele buren veranderen met hun snelheid en, zo ja, kwantificeren van de vorm van de waargenomen relatie. In het bijzonder wordt de directionele Cue gegenereerd door een vast deel van de silhouetten fungeren als leiders en bewegen ballistisch naar de ene arm of een andere. De overgebleven silhouetten fungeren als afleidingen door willekeurig over te stappen om achtergrondgeluiden te bieden die kunnen worden afgesteld door de Leader/distractor ratio aan te passen. De verhouding van leidinggevenden tot afleiders vangt de coherentie van de richtingsaanwijzingen op en kan dienovereenkomstig worden aangepast. Afleider silhouetten blijven beperkt tot het beslissings gebied ("DA", Figuur 1a) door het hebben van de silhouetten reflecteren off van de grens. Leiders silhouetten mogen echter de DA-regio verlaten en hun aangewezen arm betreden voordat ze langzaam verdwijnen zodra de silhouetten de lengte van de arm 1/3. Naarmate leiders de DA verlaten, nemen nieuwe Leader-silhouetten hun plaats in en traceren ze hun exacte pad om ervoor te zorgen dat de Leader/distractor ratio constant blijft in de DA tijdens het experiment.

Het gebruik van virtuele vissen zorgt voor de controle van de visuele zintuiglijke informatie, terwijl het monitoren van de directionele reactie van het onderwerp, die kan onthullen nieuwe kenmerken van sociale navigatie, beweging, of besluitvorming in groepen. De benadering die hier wordt gebruikt, kan worden toegepast op een breed scala aan vragen, zoals effecten van subletale stress of predatie op sociale interacties, door de computeranimatie te manipuleren om gedragspatronen van verschillende complexiteit te produceren.

Protocol

Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van het milieu laboratorium, Amerikaanse leger ingenieur en onderzoeks-en ontwikkelingscentrum, Vicksburg, MS, USA (IACUC # 2013-3284-01).

1. sensorische doolhof ontwerp

1. Voer het experiment uit in een waterdicht polymethyl methacrylaat Y-Maze-platform (Made in-House) dat bovenop een transparant ondersteuningsplatform in een speciale ruimte wordt gezet. Hier is het platform 1,9 cm dik en wordt het ondersteund door 4 7,62 cm bundels geëxtrudeerd aluminium dat is 1,3 m breed, 1,3 m in lengte, en 0,19 m in hoogte.
2. Het bedrijf en de beslissings gebieden zodanig te construeren dat zij identiek zijn in de bouw (Figuur 1a). Hier zijn de Y-doolhof armen 46 cm lang, 23 cm breed en 20 cm diep met een centrale beslissings gebied ongeveer 46 cm in diameter.
3. Hecht wit project-through theater scherm aan de onderkant van de Y-Maze voor het projecteren van visuele stimuli in het domein.
4. Mantel de zijkanten van het Y-doolhof met wit vinyl om externe visuele stimuli te beperken.
5. Installeer een op afstand bestuurbare Clear Gate (via Clear monofilament) om het vasthoud gebied vanuit het centrale beslissings gebied te partitioneren om onderwerpen na acclimatiëring in het doolhof vrij te geven.
6. Plaats extra jaloezieën om te voorkomen dat de vis lichten, huisvesting en apparatuur bekijkt, zoals lichtwerende jaloezieën die de vloer in deurframes bereiken om lichteffecten en schaduw bewegingen van de externe kamer of hal te minimaliseren.

2. opnameapparatuur

1. Selecteer een overhead camera (zwart-wit) op basis van het contrast dat nodig is tussen de achtergrondafbeeldingen, virtuele vissen en onderwerpvissen.
2. Installeer een overhead camera om het doolhof van bovenaf op te nemen en het gedrag van de vissen en de visuele projecties op te nemen.
   1. Voor deze demonstratie gebruikt u b/w Gigabyte Ethernet (GigE)-camera's, zodat 9 m IP-kabels zijn aangesloten op een computer met een 1 GB Ethernet-kaart in een controlekamer.
3. Sluit de camera aan op een computer in een aangrenzende ruimte waar de waarnemer de poort, het visuele stimuli programma en de camera-opname software op afstand kan bedienen.
4. Zorg ervoor dat de camera-instellingen zijn op sampling en frequentie snelheden die flikkering effecten voorkomen, die optreden wanneer de camera en de software zijn uit de fase met de verlichting van de kamer.
   1. Controleer de elektrische frequentie van de locatie; verschuifbaar de bemonsteringssnelheid van de camera (frames per seconde, fps) om flikkering te voorkomen door de AC-frequentie te vermenigvuldigen of te verdelen met een geheel getal.
5. Stel de camera-instellingen zo in dat de helderheid van het beeld wordt geoptimaliseerd met behulp van de software en computer om het relevante gedrag te visualiseren.
   1. Voor deze demonstratie voert u sampling uit met 30 fps met een ruimtelijke resolutie van 1280 pixels x 1024 pixels.

3. Kalibreer de verlichtings-, projector-en camera-instellingen

1. Installeer vier bovengrondse spoor verlichtingssystemen langs de wanden van de experimentele ruimte.
2. Installeer instelbare Schakel schakelaars voor de verlichting voor meer flexibiliteit bij het bereiken van het juiste omgevingslicht voor de ruimte.
3. Plaats de lichten om reflecties op het doolhof te voorkomen (Figuur 1b).
4. Beveilig een korte Throw (ST) projector naar de onderrand van de support structuur van het doolhof (figuur 1c).
   1. Selecteer de projectie resolutie (ingesteld op 1440 pixels x 900 pixels voor deze demonstratie).
5. Pas de omgevingslicht niveaus aan, gemaakt door de overhead lampen en projector, om overeen te komen met de lichtomstandigheden in de woonkamer van de proefpersonen (hier ingesteld op 134 ± 5 lux tijdens het demonstratie-experiment, dat gelijkwaardig is aan natuurlijke verlichting op een overgegoten dag).
   1. Vergrendel of markeer de locatie van de dimmerschakelaar voor gemak en consistentie tijdens experimentele proeven.
6. Gebruik een camera-Viewer programma om de camera (s) te configureren om de belichtingsstand, versterking en witbalans te regelen.
   1. In deze demonstratie stelt u de Pylon-viewer in op "continu shot", 8000 μs belichtingstijd, 0 Gain en 96 witbalans, die de controle van de video-opname biedt.

4. programma voor visuele projectie kalibreren: achtergrond

1. Projecteer een homogene achtergrond op de bodem van het doolhof en meet eventuele licht vervorming van de projector. Hier is de achtergrond gemaakt met behulp van processing (v. 3), een Tractable en goed gedocumenteerd platform voor het maken van aangepaste visualisaties voor wetenschappelijke projecten (https://processing.org/examples/).
   1. Maak een programma dat een verwerkingsvenster zal uitvoeren om geprojecteerd te worden op de bodem van het doolhof. Het aanpassen van de achtergrondkleur van het venster gebeurt met de achtergrond opdracht, die een RGB-kleurcode accepteert. Verschillende kleine voorbeeld Programma's zijn te vinden in de processing Tutorials (https://processing.org/tutorials/).
   2. Gebruik het programma achtergrondkleur om de projector en externe lichtomstandigheden te kalibreren.
2. Meet elke licht vervorming die door de projector wordt gecreëerd met behulp van een beeldverwerkings programma om eventuele afwijkingen te identificeren van de verwachte homogene achtergrond die is gemaakt. De volgende stappen zijn van toepassing op ImageJ (v. 1.52 h; https://imagej.NIH.gov/IJ/).
   1. Leg een stilstaand beeld van het verlichte Y-doolhof vast met een uniforme achtergrondkleur en open in ImageJ.
   2. Met behulp van het rechte, gesegmenteerde of vrije lijn gereedschap tekent u een rechte verticale lijn van de helderste plaats in het midden van de hotspot naar de top van het Y-doolhof (Figuur 2a).
   3. Selecteer in het menu analyseren de optie plot profiel om een grafiek met grijze schaalwaarden te maken ten opzichte van de afstand in pixels.
   4. Sla pixelgegevens op als een door komma's gescheiden bestand (CSV-bestandsextensie) dat bestaat uit een indexkolom en een kolom met pixelwaarde.
3. Lijn het projectie gebied uit met het doolhof (Figuur 2b) en model elke ongewenste licht vervorming om kleurvervorming te verminderen die door de projector kan worden gecreëerd (figuur 2c). Hieronder volgt een overzicht van de stappen die in de huidige demonstratie zijn ondernomen.
   1. Importeer het gegevensbestand van de ImageJ-pixel intensiteit met behulp van de juiste tab-gescheiden Lees functie (bijvoorbeeld read_csv uit het tidyverse-pakket om te lezen in door komma's gescheiden bestanden).
   2. Bereken de variabiliteit in lichtintensiteit langs het monster transect, zoals met een variatiecoëfficiënt, om een referentie te geven voor het niveau van vervorming dat op de achtergrond wordt gemaakt.
   3. Transformeer de onbewerkte pixelwaarden naar een relatieve verandering in intensiteit van helderste naar dimmest, waarbij de kleinste pixel intensiteit de gewenste achtergrondkleur waarde benadert die is geselecteerd in het afbeeldings programma.
   4. Plot de pixel intensiteitswaarden die beginnen bij het helderste deel van de anomalie, genereren in het algemeen een rottende trend in intensiteitswaarden als een functie van de afstand tot de bron. Gebruik niet-lineaire kleinste kwadraten (functie nls) om de parameterwaarden te schatten die het beste bij de gegevens passen (hier een Gaussiaanse verval functie).
4. Maak de teller gradiënt met hetzelfde programma dat is goedgekeurd voor het genereren van de achtergrondteller afbeelding (processing v. 3) om de kleurvervorming te verminderen die door de projector kan worden gemaakt met behulp van R (v. 3.5.1).
   Opmerking: de verloopfunctie genereert een reeks concentrische cirkels die zijn gecentreerd op de helderste plek in de afbeelding die veranderen in pixel intensiteit als een functie van de afstand van het centrum. De kleur van elke ring wordt gedefinieerd door de wijziging in de pixel intensiteit die door het model wordt voorspeld, af te trekken van de achtergrondkleur. Dienovereenkomstig stijgt de ring RADIUS ook met de afstand tot de bron. Het beste pasvorm model moet elke pixel intensiteit in het verloop verminderen, zo niet elimineren, om een achtergrond uniformiteit te bieden.
   1. Maak een Gaussiaanse gradiënt() met behulp van het visuele stimulus-programma door de vereiste parameters aan te passen.
      1. Parameter a zijn van invloed op de helderheid/duisternis van het verloop van de Gaussiaanse verdeling. Hoe hoger de waarde, hoe donkerder het verloop.
      2. Parameter b beïnvloedt de variantie van het verloop. Hoe groter de waarde, hoe breder het verloop zich uitbreidt voordat de intensiteit van de gewenste achtergrond pixel wordt verlengd, c.
      3. Parameter c stelt de gewenste achtergrond pixel intensiteit in. Hoe groter de waarde, hoe donkerder de achtergrond.
   2. Sla de afbeelding op in een map met de functie Save frame , zodat een vaste achtergrondafbeelding kan worden geüpload tijdens de experimenten om geheugenbelasting te minimaliseren bij het renderen van de stimuli tijdens een experimentele proef.
   3. Voer het programma voor het genereren van de achtergrond opnieuw uit en Inspecteer de resultaten visueel, zoals weergegeven in figuur 2c. Herhaal stap 4,3 om de waargenomen verbeteringen te kwantificeren in de mate van variabiliteit in lichtintensiteit over de sample trans ect.
5. Stel de verlichtingsniveaus, de model parameters of de afstand die is bedekt in de transect (bijv. de buitenste straal van de teller gradiënt) empirisch in om aanvullende handmatige aanpassingen te maken totdat de RGB-waarden van de acclimatisatie zone vergelijkbaar zijn met het beslissings gebied. De model parameters in deze test waren: a = 215, b = 800 en c = 4.
6. Voeg het laatste filter toe aan het experiment Visual stimuli-programma.

5. Kalibreer visuele projectie programma: visuele stimuli

Opmerking: het renderen en animeren van de visuele stimuli kan ook worden gedaan in de verwerking met behulp van de onderstaande stappen als gidsen samen met de tutorials van het platform. Een schematische weergave van de logica van het huidige programma is te vinden in (Figuur 3) en aanvullende informatie vindt u in lemasson et al. (2018)⁷. De volgende stappen bevatten voorbeelden van de kalibratie stappen die zijn uitgevoerd in het huidige experiment.

1. Open het visuele projectie programma Vfish. pde om de projectie in het beslissings gebied van het doolhof te centreren (Figuur 1a) en Kalibreer de visuele projecties op basis van de te testen hypotheses (bijv. Kalibreer de grootte en snelheid van de silhouetten die overeenkomen proefpersonen). Kalibraties worden met de hand afgesteld in de koptekst van het hoofdprogramma (Vfish. pde) met behulp van vooraf geselecteerde vlaggen voor foutopsporing. In de foutopsporingsmodus (DEBUG = TRUE) stapsgewijs door elke DEBUGGING_LEVEL_ # vlag (nummers 0-2) om de nodige aanpassingen te maken
   1. Stel de vlag DEBUGGING_LEVEL_0 in op ' True ' en voer het programma uit door op het pictogram afspelen in het venster schets te drukken. Wijzig de x-en y-positiewaarden (respectievelijk domein parameters dx en dy) totdat de projectie gecentreerd is.
   2. Stel de DEBUGGING_LEVEL_1 in op ' True ' om de grootte van het silhouet van de vis te schalen (gerenderd als een ellips). Voer het programma uit en pas de breedte (eW) en de lengte (eL) van de ellips iteratief aan totdat het overeenkomt met de gemiddelde grootte van de proefpersonen. Daarna stelt u de DEBUGGING_LEVEL_2 in op ' True ' om de basislijn snelheid van de silhouetten (SS) aan te passen.
   3. Stel DEBUG = FALSE in om de foutopsporingsmodus af te sluiten.
2. Controleer of afleidende silhouetten begrensd blijven tot het beslissings gebied (da, Figuur 1a), dat Leader Silhouette trajecten goed zijn uitgelijnd met beide armen en dat de Leader/afleider ratio binnen de da constant blijft.
3. Stap door de GUI van het programma om de functionaliteit van de opties te garanderen.
4. Controleer of de gegevens correct worden weggeschreven naar het bestand.
5. Zorg ervoor dat de opname software het onderwerp vis met visuele projecties op zijn plaats kan volgen. Stappen om vissen te volgen zijn eerder beschreven in Kaidanovich-Berlin et al. (2011)⁸, Holcomb et al. (2014)⁹, Way et al. (2016)¹⁰ en Zhang et al. (2018)¹¹.

6. voorbereiding van dieren

1. Kies de onderwerpsoort op basis van de onderzoeksvraag en toepassing, waaronder geslacht, leeftijd, genotype. Wijs onderwerpen toe aan de experimentele vasthoud tanks en noteer de biometrische statistieken van de basislijn (bijv. lichaamslengte en massa).
2. Stel de omgevingscondities in het doolhof in op die van het vasthoud systeem. Water kwaliteit voor Baseline experimenten van gedrag worden vaak op optimale wijze gehouden voor de soort en voor de experimentele domeininstelling.
   1. In deze demonstratie, gebruik de volgende voorwaarden: 12 h licht/12 h donkere cyclus, overhead Flicker-Free halogeenlampen ingesteld op 134 ± 5 Lux, 22 ± 0,3 °C, 97,4 ± 1,3% opgeloste zuurstof, en pH van 7,8 ± 0,1.
3. Wennen de dieren door ze over te brengen naar het domein voor maximaal 30 minuten per dag gedurende 5 dagen zonder de computergegenereerde visuele stimuli (bijv. vissilhouetten) voor het begin van de experimentele proeven.
4. Zorg ervoor dat het onderwerp vis op dat moment wordt geselecteerd, toegewezen, gewogen, gemeten en overgebracht naar experimentele tanks.
   Opmerking: hier, Golden Shiners standaard lengte en natte gewicht waren 63,4 ± 3,5 mm SL en 1,8 ± 0,3 g WW, respectievelijk.
5. Gebruik een water-naar-water-overdracht bij het verplaatsen van vis tussen tanks en het doolhof om stress te verminderen van handling en lucht blootstelling.
6. Voer experimenten uit tijdens een reguliere, vaste licht cyclus die het natuurlijke biologische ritme van de proefpersonen weerspiegelt. Hierdoor kunnen de onderwerpen worden gevoed aan het einde van de experimentele proeven van elke dag om de digestie effecten op gedrag te beperken.

7. experimentele procedure

1. Schakel kamer projector en ledlichtrups systemen in op vooraf bepaald niveau van helderheid (in deze demonstratie 134 ± 5 lux) waardoor de bollen warm worden (ongeveer 10 minuten).
2. Open het Camera-Viewer programma en laad de instellingen voor diafragma, kleur en opname die zijn opgeslagen vanuit Setup om ervoor te zorgen dat de beste kwaliteit video kan worden bereikt.
   1. Open de Pylon-viewer en activeer de camera die moet worden gebruikt voor het opnemen.
   2. Selecteer functies laden in het dropdown-menu van de camera en navigeer naar de map met opgeslagen camera-instellingen.
   3. Open de opgeslagen instellingen (hier gelabeld als camerasettings_20181001) om de videokwaliteit te garanderen en klik op continue opname.
   4. Sluit de Pylon-viewer.
3. Open het visuele projectie programma Vfish. pde en controleer of de projectie gecentreerd blijft in het doolhof, dat de DataOut-map leeg is en dat het programma werkt zoals verwacht
   1. Controleer of de kalibratie ring is gecentreerd in de DA met stap 5.1.1.
   2. Open de map DataOut om ervoor te zorgen dat deze leeg is voor de dag.
   3. Voer het visuele stimuli programma uit door op afspelen te drukken in het schets venster van Vfish. pde en gebruik dummy variabelen om de programma functionaliteit te waarborgen.
      1. Voer Fish ID Number (1-16) in, druk op Enteren bevestig de selectie door op j of N te drukken voor Ja of Nee.
      2. Voer groepsgrootte in (vast hier bij 1) en bevestig de selectie.
      3. Voer de gewenste silhouet snelheid in (0-10 BL/s) en bevestig de selectie.
      4. Druk op Enter om voorbij de acclimatisatie periode te gaan en de projectie van de virtuele vis in het beslissings gebied te controleren.
      5. Druk op pauze om het programma te onderbreken en voer de keuze van de dummy uitkomst in, d.w.z. links (1) of rechts (2).
      6. Druk op Stop om het programma te beëindigen en de gegevens naar het bestand te schrijven.
   4. Controleer of de gegevens correct zijn weggeschreven naar het bestand in de map DataOut en log het bestand in als een testuitvoering in de Lab-notities voordat vis in het domein wordt geplaatst voor acclimatiëring.
4. Gebruik de klok tijd en een stopwatch om de start-en stoptijden van de proefversie in het lab-notitieblok aan te vullen als aanvulling op de verstreken tijden die later kunnen worden geëxtraheerd uit het afspelen van video vanwege de korte duur van sommige replicaatproeven.
5. Voer een water verandering uit (bijv. 30%) met behulp van het vasthoud systeem put water voor het overbrengen van een onderwerp aan het doolhof.
6. Bevestig dat de waterkwaliteit vergelijkbaar is tussen het doolhof en het vasthoud systeem, en controleer de werking van de poort om ervoor te zorgen dat deze soepel naar net boven de waterhoogte glijdt.
7. Door gebruik te maken van het vooraf bepaalde experimentele schema, dat in de loop van het experiment gerandomiseerde blootstellingen aan de behandeling heeft, voert u de waarden in die voor de huidige proefperiode zijn geselecteerd (stoppen bij het acclimatiserings scherm, stappen 7.3.3.1-7.3.3.3).
   1. Gegevens van de behandelings combinatie opnemen in het lab-notitieblok.
8. Breng het onderwerp over in de Y-Maze-vasthoud zone voor een acclimatie periode van 10 minuten.
9. Start de video-opname en druk op de return -toets in het vfish. pde-venster aan het einde van de acclimatie periode. Hiermee start u de visuele projecties.
10. Wanneer de virtuele vis in het domein wordt weergegeven, logt u de klok tijd in en brengt u de vasthoud poort (Fig. 4a) omhoog.
11. Beëindig het proces wanneer 50% van het lichaam van het onderwerp overgaat in een keuze-arm (figuur 4b) of wanneer de opgegeven tijdsperiode verstrijkt (bijvoorbeeld 5 min).
    1. Log de klok tijd, start-en stoptijden van de stopwatch en de keuze van de proefpersonen (d.w.z. links (1), rechts (2) of geen keuze (0)).
    2. Stop de video-opname en druk op pause in het Visual stimuli-programma, dat de gebruiker zal vragen om uitkomst gegevens van de proefperiode (het geselecteerde arm-nummer of een 0 om aan te geven dat er geen keuze is gemaakt). Nadat de selectie is bevestigd, keert het programma terug naar het eerste scherm en wacht u de verwachte waarden voor de volgende experimentele proef.
12. Verzamel het onderwerp en retourneer het naar de respectievelijke tank. Herhaal stap 7.7-7.13 voor elke proefversie.
13. Aan het einde van een sessie (AM of PM) druk op Stop in het programma zodra de laatste vis van de sessie een beslissing heeft genomen. Als u op Stop drukt, worden de gegevens van de sessie naar het bestand.
14. Herhaal de water uitwisseling aan het einde van de ochtendsessie om de stabiliteit van de waterkwaliteit te garanderen.
15. Na de laatste proefversie van de dag, Bekijk de Lab-notebook en maak alle benodigde notities.
    1. Druk op Stop in het programma visuele stimuli om de verzamelde gegevens uit te voeren naar de map dataout, na de laatste proef van de dag.
16. Controleer het aantal, de naam en de locatie van de gegevensbestanden die door het visualisatieprogramma zijn opgeslagen.
17. Log waterkwaliteit, samen met de lichtniveaus in de doolhof kamer te vergelijken met de ochtend instellingen. Plaats het beluchting systeem en de kachels in het Y-doolhof.
18. Schakel de projector en de experimentele ruimte-tracking verlichting uit.
19. Voer het vooraf bepaalde dagelijkse rantsoen.

8. gegevensanalyse

1. Zorg ervoor dat de experimentele gegevens de benodigde variabelen bevatten (bijvoorbeeld datum, proefperiode, onderwerp-id, arm geselecteerd door programma, geteste visuele factoren, keuze van onderwerp, start-en stoptijden en opmerkingen).
2. Controleer op eventuele opnamefouten (menselijk of programma geïnduceerd).
3. Tabuleren reacties en controleren op tekenen van enige directionele vooroordelen van de kant van de proefpersonen (bijv. binomiale test op de keuze van de arm in de controle voorwaarde)⁷.
4. Wanneer het experiment is ontworpen met behulp van herhaalde metingen aan dezelfde individuen, zoals in het geval hier, wordt het gebruik van modellen met gemengde effecten voorgesteld.

Representative Results

Hypothese en ontwerp

Om het nut van dit experimentele systeem te demonstreren, testten we de hypothese dat de nauwkeurigheid waarmee Golden shiner een visuele hint volgt, zal verbeteren met de snelheid van die hint. Wild type Golden shiner werden gebruikt (N = 16, lichaams lengtes, BL, en natte gewichten, WW, waren 63,4 ± 3,5 mm en 1,8 ± 0,3 g, respectvol). De coherentie van de visuele stimuli (Leader/distractor ratio) werd vastgesteld op 0,67, terwijl we de snelheid waarmee onze bewegings aanwijzingen (d.w.z. de leiders) verplaatst met betrekking tot hun afleidingen gemanipuleerd. Snelheidsniveaus van de Leader-silhouetten die de richtings signalen leveren varieerden van 0-10 BL/s (in stappen van 2), die het bereik van snelheden overspant die doorgaans worden beschouwd als aanhoudende, langdurige of burst-zwemactiviteiten in vissen¹². Op het niveau van de besturing, 0, waren de leiders silhouetten gericht op een doelarm onder de willekeurig georiënteerde afleiders, maar geen van de silhouetten verplaatst. De doelarm werd willekeurig gekozen voor elke proef door het programma. Afstandseenheden zijn in lichaamslengte, die werd gedefinieerd door de gemiddelde standaard lengte van onze onderwerpen, en de tijd is in seconden. De huidige representatieve analyse richt zich op het meten van primaire responsvariabelen (beslissings snelheid en nauwkeurigheid), maar het ontwerp van het experiment stelt onderzoekers ook in staat om toegevoegde informatie te extraheren door het volgen van de onderwerpen bewegingen en het analyseren van hun Kinematica.

Onze viskwekerijen werden ondergebracht na paragraaf 6 van het protocol. Elk onderwerp werd blootgesteld aan één niveau van de behandeling per dag. We gerandomiseerd zowel binnen het onderwerp behandelingsniveau (cue snelheid) over dagen en de volgorde waarin onderwerpen werden getest op elke dag. Lineaire en gegeneraliseerde lineaire gemengde effecten modellen (LMM en GLMM, respectievelijk) werden gebruikt om de effecten van Leader silhouet snelheid te testen op de snelheid en nauwkeurigheid waarmee onderwerpen de visuele stimuli volgden. De onderwerp-id is opgenomen als het willekeurige effect in beide modellen.

Gegevens en bevindingen

Bij afwezigheid van bewegings signalen Golden shiner gehandeld zoals verwacht en koos hun richting willekeurig (stimulus snelheid = 0, binomiale test, n_links= 33, n_rechts= 40, = 0,45, P = 0,483). Hoewel de meeste onderwerpen geen tekenen vertoonden van stressvol gedrag binnen het domein en een beslissende beslissing hebben genomen binnen de toegekende tijd (5 min), toonde 22% van de proefpersonen een terughoudendheid om het vasthoud gebied te verlaten of het beslissings gebied in te voeren. Gegevens van deze onbeslissende vis werden niet meegenomen in de analyse. De resterende 78% van onze proefpersonen toonde een significante verbetering in de nauwkeurigheid waarmee ze de richtings stimuli volgden, omdat de snelheid van die stimuli toenam (GLMM, z = 1,937, P = 0,053). Figuur 5a toont de aard van deze relatie, waar we een 1,2-voudige stijging van de directionele nauwkeurigheid vinden voor elke toename van het snelheidsniveau van de stimulus. Deze relatie is slechts bescheiden onevenredig en is op zichzelf niet suggestief voor een drempel reactie op veranderingen in Cue-snelheid. Stijgingen van de prikkel snelheid leidden ook tot een aanzienlijke stijging van de beslissings snelheid (LMM, F_{1, 56}= 4,774, P = 0,033). Zoals duidelijk in Figuur 5b was de trend in de beslissings snelheid echter inconsistent en zeer variabel over de snelheid van de stimulus. Wat in deze besluit snelheidsgegevens duidelijk is, is dat het gemiddeld overal van 5-20x langer onderwerpen heeft genomen om hun beslissing te nemen toen de stimuli beweerden dan wanneer ze niet waren (beslissings snelheden van 4,6 ± 2,3 s en 81,4 ± 74,7 s voor stimulus snelheden van respectievelijk 0 en 8, ± standaarddeviatie, SD). Inderdaad, zonder het controleniveau vonden we geen significante verandering in beslissings snelheid als functie van stimulus snelheid.

Figuur 1. Y-Maze domein. A. beeld van het Y-doolhof apparaat voor de besluitvorming test. Annotaties vertegenwoordigen het volgende: vasthoud gebied (HA, groen), beslissings gebied (DA, blauw), linker beslissings arm (LDA) en rechter beslissings arm (RDA). B. beeld van het Y-doolhof en ruimte met verstelbare Rail verlichting en GigE cameraplaatsing (slechts één van de vier overhead strips zijn zichtbaar). C. beeld van de Y-doolhof (zijaanzicht) inclusief de plaatsing van de projector die is vergrendeld door de slede om bewegingen tijdens of tussen proeven te elimineren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2. Achtergrond en stimulus kalibratie. A. afbeelding van het verlichte Y-doolhof met een uniforme achtergrondkleur en een transect pixel intensiteit (groene lijn) tussen het vasthoud gebied en het beslissings gebied, da (gemiddelde pixel intensiteit 112 ± 1278). De licht gradiënt die door de lamp van de projector (hotspot) wordt gegenereerd, is duidelijk zichtbaar. B. afbeelding die de uitlijning van de projecties met de da weergeeft. C. beeld van het doolhof met de gefilterde achtergrond en een eenzame silhouet geprojecteerd in het midden van de da voor kalibratie (grootte, snelheid). De toevoeging van de teller gradiënt achtergrond (C) resulteert in een donkerdere achtergrond (gemiddelde pixel intensiteit 143,1 ± 5,5) en veel minder ruimtelijke variabiliteit (variatiecoëfficiënt daalt van 11,4 (A) tot 0,03 (C.). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3. Schematische voorstelling van de algemene stroom van bewerkingen in het visualisatieprogramma dat wordt gebruikt in de experimenten. Zie voor aanvullende procedurele Details⁷. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4. Experimentele trial met zowel echte als virtuele vis silhouetten. A. afbeelding a (Live) Golden shiner verlaten van het vasthoud gebied (groene cirkel). B. afbeelding van een (Live) gouden Shiner in het beslissings gebied (groene cirkel) tussen de virtuele vissen silhouetten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5. Nauwkeurigheid en snelheid van directionele reacties op veranderingen in de relatieve snelheid van bewegings aanwijzingen. A. diagram van de nauwkeurigheid van de Visbeslissing waarmee Golden shiner de ' Leader ' silhouetten volgde die werden uitgezet tegen de stimulus snelheid (BL/s). B. grafiek van de visbeslissings snelheid uitgezet tegen de stimulus snelheid (BL/s). Gegevens zijn gemiddelden ± standaardfouten, SE. groepen van 15 virtuele silhouetten werden willekeurig verdeeld in de beslissings zone met een coherentie niveau van 67% (10 van de 15 silhouetten traden op als leiders, de overige 5 silhouetten traden op als afleidingen) en we varieerden de snelheid van de leiders van 0-10 BL/s. afleider snelheden bleven vast op 1 BL/s op alle snelheden, met uitzondering van de controle waarin geen van de silhouetten bewogen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Visuele aanwijzingen zijn bekend om een optomotor reactie te activeren in vissen blootgesteld aan zwart-wit roosters¹³ en er is toenemend theoretische en empirische bewijs dat de buur snelheid een invloedrijke rol speelt in het bestuur van de dynamische interacties waargenomen in visscholen^{7,14,15,16,17}. Er bestaan contrasterende hypotheses om uit te leggen hoe individuen in groepen aansluitende bewegingen integreren, zoals proportioneel reageren op alle waarneembaar cues¹⁴, een Motion-Threshold Response¹⁷aannemen of botsings tijden ^{controleren 18}. een eerste stap bij het testen van deze alternatieve hypotheses is het valideren van hun onderliggende veronderstellingen. Hier demonstreerden we het nut van ons protocol bij het identificeren van de rol die een bepaalde zintuiglijke functie kan hebben bij het begeleiden van directionele beslissingen.

We geïsoleerd hoe individuen van een sociale vissoorten, de gouden Shiner, reageerden op veranderingen in de relatieve snelheid van visuele stimuli ontworpen om condetails in een school na te bootsen. Gouden Shiner directionele nauwkeurigheid verbeterd met stijgingen van de relatieve snelheid van de visuele stimuli, maar de functionele relatie tussen deze variabelen was slechts marginaal onevenredig. De relatie tussen beslissings snelheid en stimulus snelheid, hoewel significant, was zeer variabel en inconsistent. De resultaten tonen echter aan dat een snelheidsverschil in beelden verspreid over het gezichtsveld van deze vis een belangrijke rol speelt in het triggeren van een reactie en het begeleiden van hun overt-aandacht. Apart plagen hoe individuen kiezen tussen de acties van specifieke buren kan worden geprobed met het huidige ontwerp door het introduceren van conflicterende richtingen in de stimuli.

In een recent experiment met zebravissen, Danio rerio, vonden we geen bewijs van besluiteloosheid in eenzame Trials⁷, maar Golden shiner in deze demonstratie heeft een grotere terughoudendheid getoond om het vasthoud gebied te verlaten. De verschillen tussen deze twee soorten kunnen worden verklaard door hun levensgeschiedenis strategieën en de relatieve kracht van hun sociale tendensen (of afhankelijkheid). Zebravis lijkt meer variabele sociale coherentie te vertonen dan Golden shiners (bijv. de faculatieve VS. verplicht kleuters³). Het is waarschijnlijk dat de sterkere sociale coherentie in Golden shiner mogelijk heeft bijgedragen aan onderwerpen die hogere niveaus van verlegenheid of aarzelendheid binnen het domein vertonen dan hun zebravis-tegenhangers.

De volgorde van de stappen is subtiel en toch kritisch in het protocol. Het proces van het balanceren van de lichten, de projector en het programma filter kan meer tijd in beslag nemen dan vaak wordt verwacht voor nieuwe domeinen. In dit protocol zijn geleerde lessen opgenomen om de instellingen en de lichtbalans tijd te verminderen, zoals het gebruik van spoor lichten die de wand reflecteren (niet op het domein), instelbare licht regelaars en door het programma gegenereerde filters voor de projector. Bedenk ook dat wat visueel aanvaardbaar lijkt te zijn voor het menselijk oog niet door de camera en software op dezelfde manier zal worden bekeken, dus uw lichtomstandigheden kunnen extra aanpassingen vereisen. Zelfs kleine wijzigingen in de monitor hoeken resulteren in wijzigingen in de achtergrond gradiënt. Dus, gedetailleerde nota nemen en opslaan van bestandsinstellingen zal sterk verminderen de kans op veranderingen die zich voordoen tijdens het experiment. Door het proces van fysiek naar filtering te verplaatsen, zoals hier wordt weergegeven, levert de snelste stappen naar succes.

Het gebruik van een ST-projector maakt meer ruimtelijke flexibiliteit mogelijk via een monitor, maar deze aanpak creëert een ongewenste visuele anomalie die een "hotspot" wordt genoemd. Een hotspot is een licht plekje op het projectie oppervlak dat wordt gecreëerd door de nabijheid van de lamp van de projector. In het protocol was sectie 4 gewijd aan het creëren van achtergrond filters en het controleren op homogene bliksem in het hele domein. De stappen die hier worden beschreven, helpen gebruikers de ongewenste effecten van de hotspot te vermijden of te minimaliseren door ongewenst verloop te modelleren en het model te gebruiken om een inverse verloop te reproduceren om de effecten tegen te gaan. Ten slotte kan het model van de ST-projector variëren, maar beeldaanpassingen (roteren, omdraaien, voor-of achterscherm projectie) en trapeziumcorrectie (± 3-5 graden) zijn nuttige functies om ervoor te zorgen dat het beeld van de wens past bij het domein en kan worden aangepast voor vervorming.

Na verloop van tijd werden de experimentele kamers voor het gemak bijgewerkt door veranderingen in de hardware (d.w.z. camera's, bekabeling, videokaarten, monitoren). Het is opmerkelijk om te vermelden dat wijzigingen in de hardware waarschijnlijk resulteren in extra opstarttijd om verlichting te balanceren en te werken door middel van potentiële programma problemen. Daarom wordt aanbevolen dat alle hardware worden toegewezen aan een systeem tot de voltooiing van de gewenste experimenten. De meeste uitdagingen zijn gekoppeld aan prestatieverschillen tussen monitoren, videokaarten en de camera's die soms leiden tot wijziging van de programmeercode. Sinds de tijd van dit werk, nieuwe domeinen zijn ontwikkeld waarin de binnenste testdomein kan worden verwijderd en overgeschakeld voor andere test domeinen. We raden aan dat deze flexibiliteit wordt overwogen bij het ontwerpen van de experimentele domeinen en ondersteunende structuren.

Het huidige protocol stelt onderzoekers in staat om visuele kenmerken te isoleren en te manipuleren op een manier die zowel de visuele omgeving die verwacht wordt binnen een school weerspiegelt, terwijl ook controle op verstorende factoren die gepaard gaan met blootstelling aan echte condetails (bijv. , honger, vertrouwdheid, agressie)⁷. In het algemeen is computeranimatie (CA) van virtuele vissen (dat wil zeggen, silhouetten) een praktijk die steeds vaker voorkomt vanwege de duidelijke voordelen in het stimuleren van gedrags responsen^19,20,21. CA maakt het mogelijk om visuele aanwijzingen (richting, snelheid, coherentie of morfologie) aan te passen, terwijl de invoering van een niveau van standaardisatie en herhaalbaarheid in de gewenste stimulans die hoger is dan wat kan worden bereikt bij het gebruik van levende dieren als de stimulerende middelen. Het gebruik van Virtual Reality in gedrags studies, op beide dieren²² en mensen²³, neemt ook gestaag toe en belooft een krachtig empirisch instrument te worden, omdat de technologie meer beschikbaar en Tractable wordt. Samen vervangen en verminderen deze virtuele benaderingen ook de eisen van de dierenethiek in de wetenschap (bijv. IACUC, AAALAC en ACURO)²⁴, waarbij tegelijkertijd de kosten en lasten van het laboratorium worden verlaagd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black and white IP camera	Noldus, Leesburg, VA, USA		https://www.noldus.com/
Extruded aluminum	80/20 Inc., Columbia City, IN, USA	3030-S	https://www.8020.net 3.00" X 3.00" Smooth T-Slotted Profile, Eight Open T-Slots
Finfish Starter with Vpak, 1.5 mm extruded pellets	Zeigler Bros. Inc., Gardners, PA, USA		http://www.zeiglerfeed.com/
Golden shiners	Saul Minnow Farm, AR, USA		http://saulminnow.com/
ImageJ (v 1.52h) freeware	National Institute for Health (NIH), USA		https://imagej.nih.gov/ij/
LED track lighting	Lithonia Lightening, Conyers, GA, USA	BR20MW-M4	https://lithonia.acuitybrands.com/residential-track
Oracle 651 white cut vinyl	651Vinyl, Louisville, KY, USA	651-010M-12:5ft	http://www.651vinyl.com. Can order various sizes.
PowerLite 570 overhead projector	Epson, Long Beach CA, USA	V11H605020	https://epson.com/For-Work/Projectors/Classroom/PowerLite-570-XGA-3LCD-Projector/p/V11H605020
Processing (v 3) freeware	Processing Foundation		https://processing.org/
R (3.5.1) freeware	The R Project for Statistical Computing		https://www.r-project.org/
Ultra-white 360 theater screen	Alternative Screen Solutions, Clinton, MI, USA	1950	https://www.gooscreen.com. Must call for special cut size
Z-Hab system	Pentair Aquatic Ecosystems, Apopka, FL, USA		https://pentairaes.com/. Call for details and sizing.