Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Interfaciale moleculaire-niveau structuren van polymeren en biomacromoleculen onthuld via Sum frequentie generatie Vibrationele spectroscopie

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/59380
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University

Summary

Wordt uitgebreid gebruikt, Sum Frequency Generation (sfg) Vibrationele spectroscopie kan helpen om te onthullen keten conformationele order en secundaire structurele verandering gebeurt op polymeer en biomacromolecule interfaces.

Abstract

Als een tweede-orde niet-lineaire optische spectroscopie, is Sum Frequency Generation (SFG) Vibrationele spectroscopie op grote schaal gebruikt bij het onderzoeken van verschillende oppervlakken en interfaces. Deze niet-invasieve optische techniek kan de lokale informatie op moleculair niveau bieden met monolaag of submonolayer gevoeligheid. We bieden hier een experimentele methodologie voor het selectief detecteren van de begraven interface voor zowel macromoleculen als biomacromoleculen. Met dit in gedachten, worden interfaciaal secundaire structuren van zijde aan en water structuren rond model korte-keten oligonucleotide duplex besproken. De eerste toont een keten overlapping of ruimtelijke opsluiting effect en de laatste toont een bescherming functie tegen de CA2 + ionen die voortvloeien uit de chirale wervelkolom bovenbouw van water.

Introduction

Ontwikkeling van de som frequentie generatie (sfg) Vibrationele spectroscopie kan worden gedateerd terug naar het werk van Shen et al. dertig jaar geleden1,2. De uniciteit van de Interfaciale selectiviteit en sub-monolayer gevoeligheid maakt sfg Vibratie spectroscopie gewaardeerd door een groot aantal onderzoekers op het gebied van fysica, chemie, biologie, en materiaalkunde, etc3,4 ,5. Momenteel wordt een breed scala aan wetenschappelijke vraagstukken met betrekking tot oppervlakken en interfaces onderzocht met behulp van SFG, met name voor complexe interfaces met betrekking tot polymeren en biomacromoleculen, zoals de ketting structuren en structurele ontspanning in de begraven polymeer interfaces, de eiwit secundaire structuren, en de Interfaciale water structuren9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26.

Voor polymeer oppervlakken en interfaces worden dun-film samples over het algemeen bereid door een spin coating om de gewenste oppervlakken of interfaces te verkrijgen. Het probleem ontstaat door de signaalstoring van de twee interfaces van de as-prepared films, wat leidt tot ongemak voor het analyseren van de verzamelde sfg Spectra27,28,29. In de meeste gevallen is het trillationeel signaal alleen van een enkele interface, hetzij film/substraat of film/het andere medium, wenselijk. Eigenlijk is de oplossing voor dit probleemvrij eenvoudig, namelijk om de licht velden op de wenselijke interface te maximaliseren en de licht velden op de andere interface te minimaliseren. Vandaar dat de Fresnel-coëfficiënten of de lokale veld coëfficiënten moeten worden berekend via het dunne film model en moeten worden gevalideerd met betrekking tot de experimentele resultaten3,9,10,11, 12,13,14,15,30.

Met de bovenstaande achtergrond in het achterhoofd, kunnen sommige polymeer-en biologische interfaces worden onderzocht om de fundamentele wetenschap van het moleculaire niveau te begrijpen. In het volgende, het nemen van drie interfaciaal problemen als voorbeelden: indringende poly (2-hydroxyethyl methacrylaat) (phema) oppervlak en begraven interface met substraat9, vorming van zijde aan (SF) secundaire structuren op het polystyreen (PS) oppervlak en water structuren omringende model korte-keten oligonucleotide duplex16,21, we zullen laten zien hoe de sfg Vibrationele spectroscopie helpt om de interfaciaal moleculaire structuren te onthullen in verband met de onderliggende wetenschap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SFG experimentele

  1. Gebruik een commercieel Pico sfg-systeem (tabel met materialen), dat een fundamentele 1064 nm-straal biedt met een pulsbreedte van ~ 20 PS en een frequentie van 50 Hz, gebaseerd op een ND: YAG-laser.
  2. Zet de fundamentele 1064 nm Beam om in een 532 nm Beam en een 355 nm Beam met behulp van de tweede en derde harmonische modules. Leid de 532 nm Beam direct als een ingangs lichtbundel en Genereer de andere input mid-Infrared (IR) Beam die het frequentiebereik beslaat van 1000 tot 4000 cm-1 door de optische parametrische generatie (OPG)/optische parametrische versterking (opa)/ proces van verschil frequentie genereren (DFG).
  3. Stel de incident hoeken van twee invoer balken in op respectievelijk 53 ° (IR) en 64 ° (zichtbaar) versus het oppervlak normaal.
  4. Om de polymeer-Interfaciale structuren (film/substraat interface of film/de andere medium Interface) te detecteren, gebruikt u SSP (s-gepolariseerde Sum-Frequency Beam, s-gepolariseerde zichtbare straal en p-gepolariseerde infraroodstraal) en PPP-polarisatie combinaties.
  5. Om de Interfaciale proteïne-secundaire structuren en water structuren rondom het DNA te detecteren, worden naast SSP en PPP gebruik gemaakt van chirale spp-en PSP-polarisatie combinaties.
  6. Om ervoor te zorgen dat de monsters niet beschadigd zijn, controleert u de infrarood en zichtbare puls energieën respectievelijk ~ 70 en ~ 30 mJ. Een schematische weergave van het SFG-proces met het energieniveaudiagram werd getoond in Figuur 1. Figuur 2 toont het sfg-systeem in onze clean room.

2. Fresnel coëfficiënten

  1. Gebruik de rechterhoek prisma's als substraten voor alle hier besproken experimenten. Er bestaan twee interfaces voor een polymeer film op het vaste substraat, d.w.z. polymeer oppervlak in lucht en polymeer/substraat interface. Beide kunnen sfg-signalen genereren, omdat inversie-symmetrie op beide interfaces is verbroken. Daarom is een verzameld sfg-spectrum een verstoord. De lokale veld coëfficiënten of de Fresnel-coëfficiënten op de twee interfaces kunnen echter worden instelbaar door de incident hoeken of de filmdikte één voor een te variëren of tegelijkertijd31,32. Dit biedt ons de mogelijkheid om het SFG-trilsignaal van slechts één interface te sonde. Hier, de PHEMA film op de CaF2 prisma werd genomen als een voorbeeld9.
  2. Zoals weergegeven in Figuur 3, gebruik maken van de rechter-hoek prisma geometrie voor het detecteren van de sfg signalen gegenereerd uit de bodem phema film. De uitgangs intensiteit van de SFG in de weerkaatste modus wordt uitgedrukt als
    Equation 11
    waar Equation 2 de effectieve tweede-orde niet-lineaire gevoeligheids tensor wordt aangeduid.
    Equation 2bestaat uit drie delen, namelijk de prisma/polymeer-interface, de polymeer/onderste medium interface (onderste medium omvat gas, vloeibaar of vast) en de niet-resonante achtergrond, zoals getoond in de volgende vergelijking.
    Equation 32
    Hier kan het onderste medium lucht, water of iets anders zijn. F staat voor de corresponderende Fresnel-coëfficiënt die verantwoordelijk is voor de lokale veld correctie.
  3. Pas een dun film model toe om de Fresnel-coëfficiënten in dit geval te berekenen. Hier worden slechts korte berekeningsprocedures gepresenteerd.
    1. Gebruik voor de prisma/polymeer-interface
      Equation 43
      Equation 54
      Equation 65
      De betekenis van elke getoonde parameter wordt hieronder weergegeven.
      1. ωi duidt de stralings frequentie aan.
      2. tp en ts duiden de totale transmissie coëfficiënten aan en kunnen worden uitgedrukt als
        Equation 76
        Equation 87
      3. tP12 en tS12 duiden de lineaire transmissie coëfficiënten van de lichtstraal aan op de prisma/polymeer-interface.
      4. rP23 en rS23 duiden de lineaire reflectie coëfficiënten van de lichtstraal aan op de polymeer/medium interface.
      5. α vertegenwoordigt het faseverschil tussen een reflecterende straal en de secundaire reflecterende straal nadat deze zich over de polymeer dunne film voortverspreidt en vervolgens weer reflecteert, wat kan worden uitgedrukt als
        Equation 98
      6. λ staat voor de golflengte van de lichtstraal en d is de polymeer filmdikte.
      7. Φ1 en φ2 vertegenwoordigen de incident hoeken bij de prisma/Polymer interface en de polymeer/medium interface respectievelijk.
      8. n1 en n2 vertegenwoordigen respectievelijk de brekingsindices van de prisma en de polymeer film.
      9. n12 vertegenwoordigt de brekingsindices van de polymeer-Interfaciale lagen voor het prisma/polymeer.
    2. Voor de polymeer/medium interface gebruikt u
      Equation 109
      Equation 1110
      Equation 1211
      1. Δ vertegenwoordigt het faseverschil van de lichte elektrische velden op twee interfaces.
      2. Omdat de pulsbreedte voor onze invoer balken ~ 20 PS is, kan de fout van de tijdvertraging die gepaard gaat met het dispersie-effect worden verwaarloosd.
      3. De uitdrukking van een dergelijk faseverschil voor de output SFG, de ingang zichtbaar en de input infraroodstralen kunnen afzonderlijk worden geschreven als
        Equation 1312
        Equation 1413
        Equation 1514
         
  4. Uit de bovenstaande discussie, voor het prisma-polymeer film-medium (1-2-3) systeem, de totale Fresnel coëfficiënten voor de prisma/polymeer en polymeer/medium interfaces als de volgende vergelijkingen, voor SSP en PPP polarisatie combinaties . Natuurlijk worden beide interfaces beschouwd als azimutale isotropic.
    1. Voor de prisma/polymeer-interface worden de uitdrukkingen van de totale Fresnel-coëfficiënten voor zowel SSP -als PPP -polarisatie combinaties als volgt weergegeven.
      1. Voor SSPis de vergelijking
        Equation 1615
      2. En voor PPPis de vergelijking
        Equation 516
        Equation 517
        Equation 518
        Equation 519
         
      3. t10 en t01 duiden de lineaire transmissie coëfficiënten aan op respectievelijk de lucht/prisma-en prisma/lucht-interfaces.
    2. Voor de polymeer/medium-interface worden de uitdrukkingen van de totale Fresnel-coëfficiënten voor zowel SSP -als PPP -polarisatie combinaties als volgt beschreven.
      1. Voor SSPis de vergelijking
        Equation 2120
      2. Voor PPPzijn de vergelijkingen
        Equation 521
        Equation 522
        Equation 523
        Equation 524
           
         
  5. Na het berekenen van de Fresnel coëfficiënten met behulp van het ingeklemd model, plot ze als een functie van de filmdikte, zoals weergegeven in Figuur 4.
    Opmerking: in dit geval bestaat er een diktebereik voor het verzamelen van het SFG-signaal van de CaF2 Prism/phema-interface met verwaarte bare bijdrage van de andere interface, die rond 150 Nm. Evenzo kan een geschikte dikte worden gekozen voor de detectie van de PHEMA/bottom medium-interface met verwaarte bare bijdrage van de CaF2 Prism/phema-interface.

3. CRonald sfg polarisatie combinatie

  1. Voor de normale achirale interface, meestal, gebruik C∞ v symmetrie in termen van het ensemble gemiddelde33,34. Met de werking van inversie symmetrie kunnen de niet-nulzijnde tweede-orde niet-lineaire gevoeligheids componenten worden afgeleid, die cxxz-, cxzx, cZXX, cYYZ, cyzy, czyy en czzz zijn (de bestaande termen kunnen verder worden verlaagd als een isotrope interface wordt verondersteld, wat betekent dat x en y hetzelfde zijn). Voor de chirale interface zal de situatie echter verschillend zijn. De chirale interface bezit de C ∞-symmetrie, alleen de rotatie symmetrie bewerking is toegestaan. In dit geval, naast de normale achirale termen, zullen meer tweede-orde niet-lineaire susceptibiliteiten niet nul zijn, wat kan worden aangeduid als de chirale termen, namelijk cZYX, czxy en cyzx onder de behandeling van niet-elektronische Resonantie. Door gebruik te maken van PSP-, PPS -en spp -polarisatie combinaties, kan chirale sfg spectra worden verzameld33,34.

4. monstervoorbereiding

  1. Voorbereiding van de PHEMA film
    1. Los PHEMA Powder (Zie tabel met materialen) op in watervrij ethanol om de oplossing voor te bereiden met respectievelijk 2 gew.% en 4 gew.%.
    2. Vóór de afzetting van de PHEMA films, weken de CaF2 haakse prisma's in het tolueen oplosmiddel in de eerste plaats en was ze vervolgens met ethanol en ultrapuur water (18,2 MΩ · cm).
    3. Daarna, bloot de substraten (CaF2 rechter-hoek prisma's) aan zuurstof plasma om mogelijke organische verontreinigingen door plasma Cleaner verwijderen (Zie tabel van materialen).
      1. Zet eerst de plasma reiniger aan en zet de substraten erin.
      2. Schakel vervolgens de vacuümpomp in om de reiniger te vacuumiseren. Voer de zuurstof erin.
      3. Stel ten slotte 4 minuten in voor reiniging. Bewaar daarna de schone ondergronden voor de sequentiële PHEMA film voorbereiding.
      4. Bereid vervolgens de PHEMA films voor op de CaF2 prisma's door een spin-coater (Zie tabel met materialen). Pas de film diktes aan door de oplossings concentratie en de spin snelheid.
        1. Immobiliseer de CaF2 Prisma op de zuig schijf van spin-coater.
        2. Druppel één druppel van de PHEMA-oplossing die vóór 1 min op de schone ondergronden werd bereid bij 1.500 rpm (filmdikte 2 gew.% voor 100 nm en 4 gew. voor 200 nm).
      5. Alle geprepareerde PHEMA films in een vacuüm oven bij 80 °C overnachten.
  2. Bereiding van zijde aan (SF)
    Opmerking: het protocol dat werd voorgesteld door Kaplan et al.35 werd aangenomen.
    1. Plaats 7,5 g zijde cocoonen van B. Mori in het kokend natriumcarbonaat (na2co3, 0,02 M) waterige oplossing (3 L) gedurende 30 min. Verwijder de vezelhoudende SF naar een schone container.
    2. Was de verkregen vezelige SF met gedeïoniseerd water driemaal onder roeren om de sericin-moleculen te verwijderen en alleen de SF-moleculen in het vezelige monster te laten.
    3. Droog het vezelachtige SF-monster in een vacuüm oven bij 60 °C 's nachts.
    4. Daarna, los het ontgomde vezel SF-monster op in een lithiumbromide (LiBr, 9,3 M) waterige oplossing (1 g van SF werd opgelost in ~ 4 ml libr-oplossing) en incuberen het bij 60 °c gedurende 2 uur onder roeren.
    5. Dialyze de SF-oplossing tegen gedeïoniseerd water (3.500 da dialyse zakjes) gedurende 3 dagen om de opgeloste LiBr te verwijderen. Verander nieuw gedeïoniseerd water drie keer per dag. Bewaar tenslotte de verwerkte SF-oplossing bij 4 °C voor latere SFG-experimenten.
  3. Voorbereiding van korte-keten oligonucleotide duplex
    1. Bestel het enkelvoudig-gestrande oligonucleotide monster met zijn 3 '-end gemodificeerd door cholesterol-triethyleen glycol (Chol-TEG) (5 '-GCTTCCGAAGGTCGA-3 ') van een commercieel bedrijf (Zie tabel van de materialen) en de complementaire één. Los voor elke enkele streng 10 nmol van het monster poeder op in 0,5 ml ultrapuur water. Meng ze vervolgens samen om de duplex-oligonucleotide-oplossing (10 nmol/mL) te vormen.
    2. Meng 2 mg 1,2-Dipalmitoyl-SN-glycero-3-fosfocholine (DPPC) en 2 mg HDO DPPC (d-DPPC) en los ze op in 1 ml chloroform om de lipide-oplossing te bereiden.
    3. Bereiding van de DPPC & d-DPPC monolaag door een Langmuir − Blodgett (lb) trog
      1. Bevestig de rechter-hoek CaF2 Prisma aan een zelfgemaakte monsterhouder met een prisma gezicht loodrecht ondergedompeld in de waterige omgeving van de LB trog.
      2. Injecteer daarna de gemengde lipide-oplossing die eerder op het wateroppervlak is bereid, totdat de oppervlaktedruk een bepaalde waarde heeft bereikt onder 34 mN · m− 1.
      3. Na de oppervlaktedruk niveaus uit, gebruik twee Teflon barrières om de lipide monolaag te comprimeren in een verhouding van 5 mm/min tot een oppervlaktedruk van 34 MN · m− 1 werd bereikt.
      4. Til het prisma met een lipide monolaag uit het water met een snelheid van 1 mm/min verticaal.
    4. Bereiding van de andere lipide monolaag
      1. Om de assemblage van het duplex oligonucleotide en de lipide moleculen via de hydrofobe interactie (cholesterol en een lipide-alkyl keten) te vergemakkelijken, meng u de duplex-oligonucleotide-oplossing met de lipide-oplossing in een molaire verhouding van 1:100 (oligonucleotide tot lipide).
      2. Injecteer de gemengde lipide-en duplex-oligonucleotide-oplossing op het wateroppervlak in een zelfgemaakte Teflon-container tot een oppervlaktedruk van 34 mN · m− 1 werd bereikt.
    5. Ten slotte, zet de lipide monolaag aan de onderkant van het prisma in contact met de lipide monolaag met geplaatste duplex oligonucleotiden op het wateroppervlak om het uiteindelijke monster voor de sfg-meting te vormen.
  4. Lorentz-vergelijking
    1. Gebruik de Lorentz-vergelijking om de SFG-Spectra aan te passen om de trillinggegevens voor een specifieke trilmodus te extraheren.
      Equation 2625
      waar Equation 27 staat voor de intensiteit van de QTH vibratie mode Equation 28 , vertegenwoordigt de resonante frequentie Equation 29 , geeft de halve breedte op halve maximum (hwhm) Equation 30 en vertegenwoordigt de scanfrequentie van de incident IR Beam.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In de Fresnel coëfficiënt deel van protocol sectie, we hebben aangetoond dat, theoretisch, het haalbaar is om selectief te detecteren slechts één enkele interface in één keer. Hier, experimenteel, hebben we bevestigd dat deze methodologie in principe correct is, zoals weergegeven in Figuur 5 en Figuur 6.

Figuur 5 toont de begraven INTERFACIALE phema structuur na water inbraak met een ~ 150 Nm phema hydrogel film en Figuur 6 toont de oppervlaktestructuur in water met een ~ 430 nm phema hydrogel film. Panelen A en B corresponderen met respectievelijk de CH-en CO-bereiken voor beide figuren. Bij de begraven interface zijn alle waargenomen vibrationele pieken scherp en helder. De reden is dat de CaF2 substraat is glad en kan niet worden gepenetreerd door phema moleculen, wat leidt tot een scherpe CaF2/phema interface. Echter, aan de oppervlakte, omdat watermoleculen kunnen interageren met PHEMA en diffuus in de bulk, de PHEMA/water-interface zou niet zo scherp als de begraven. Daarom worden voor deze twee interfaces verschillende spectrale profielen waargenomen.

Figure 1
Figuur 1 . Schematische voorstelling van het SFG-proces (linkerpaneel) met het energietransitie diagram (rechter paneel). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 . Het SFG-systeem in het lab. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3 . Schematische weergave van het licht propagatie pad in prisma voor SFG experiment. De getallen 0, 1, 2 en 3 representeren de lucht, het prisma, de PHEMA en het bodem medium (het onderste medium kan lucht, vast of vloeibaar zijn.), respectievelijk. Gereproduceerd van Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. macromoleculen 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Dit cijfer is gewijzigd van [9]. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 . Berekende Fresnel-coëfficiënten als functie van de filmdikte voor de prisma geometrie in water voor SSP -en PPP -polarisatie combinaties. De deelvensters a1 tot en met C1 CORRESPONDEREN met het CH-bereik en de panelen a2 tot C2 corresponderen met het co-bereik. Gereproduceerd van Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. macromoleculen 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Dit cijfer is gewijzigd van [9].

Figure 5
Figuur 5 . SSP -en PPP -spectra van de CaF2/phema-interface na blootstelling aan water. A: CH en OH bereik; B: CO-bereik. De zwarte curven zijn de aansluitende resultaten met behulp van de Lorentz-vergelijking. De spectra zijn voor de duidelijkheid gecompenseerd. Gereproduceerd van Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. macromoleculen 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Dit cijfer is gewijzigd van [9].

Figure 6
Figuur 6 . SSP en PPP spectra van het phema-oppervlak op CaF2 prisma. A: CH en OH bereik; B: CO-bereik. Het monster werd in contact gebracht met water. De zwarte curven zijn de aansluitende resultaten met behulp van de Lorentz-vergelijking. De spectra zijn voor de duidelijkheid gecompenseerd. Gereproduceerd van Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. macromoleculen 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Dit cijfer is gewijzigd van [9].

Figure 7
Figuur 7 . Genormaliseerde chirale (PSP) sfg spectra in de amide I (panel A) en N-H (panel B) bereiken voor de PS/SF-oplossing (90 mg/ml) interface voor en na toevoeging van methanol. De stippen zijn experimentele gegevens en de massieve lijnen zijn de aansluitende bochten. Spectra zijn voor de duidelijkheid gecompenseerd. Gereproduceerd van Li, X.; Deng, G.; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453 − 9459 (Ref 16). Copyright 2018 American Chemical Society. Dit cijfer is gewijzigd van [16].

Figure 8
Figuur 8 . Genormaliseerde chirale (PSP) sfg spectra in de amide I (panel A) en N-H (panel B) bereiken voor de PS/SF-oplossing (1 mg/ml)-interface voor en na toevoeging van methanol. De stippen zijn experimentele gegevens en de massieve lijnen zijn de inbouw Curves (blauw). Spectra zijn voor de duidelijkheid gecompenseerd. Gereproduceerd van Li, X.; Deng, G.; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453 − 9459 (Ref 16). Copyright 2018 American Chemical Society. Dit cijfer is gewijzigd van [16].

Figure 9
Figuur 9 . Achiral (SSP, A) en chirale (spp, B) sfg Spectra voor de duplex oligonucleotide-verankerde lipide dubbellaag in contact met de CA2 + oplossingen met verschillende concentraties (van 0,6 mm tot 6 mm). De gegevenspunten werden ongeveer gemonteerd met behulp van de Lorentz-vergelijking. De verandering van het geïntegreerde gebied voor de trillingssignalen van het water als functie van de CA2 + -concentratie werd gepresenteerd (SSP, C; spp., D). Alle Spectra zijn genormaliseerd en verschoven voor de duidelijkheid. Gereproduceerd van Li, X.; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 14774 − 14779 (Ref 21). Copyright 2018 American Chemical Society. Dit cijfer is gewijzigd van [21].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Om de structurele informatie op moleculair niveau te onderzoeken, heeft sfg zijn inherente voordelen (d.w.z. monolaag-of submonolayer-gevoeligheid en Interfaciale selectiviteit), die kunnen worden toegepast om verschillende interfaces te bestuderen, zoals de vaste/vaste, vaste/ vloeistof, vaste/gas, vloeistof/gas, vloeistof/vloeibare interfaces. Hoewel het onderhoud van de apparatuur en de optische uitlijning nog steeds tijdrovend zijn, is de uitbetaling belangrijk omdat de gedetailleerde moleculaire informatie op de oppervlakken en interfaces kan worden verkregen.

Probing poly (2-hydroxyethyl methacrylaat) oppervlak en begraven interface in oplossing: zoals we hierboven hebben aangetoond, kunnen de coëfficiënten van het lichtveld worden aangepast. Dat kunnen we experimenteel bevestigen. Op de begraven interface met het substraat, omdat de CaF2 substraat oppervlak is glad en kan niet worden gepenetreerd door phema moleculen, deze interface is een scherpe. Echter, aan de oppervlakte met water, watermoleculen kunnen interageren met PHEMA moleculen en diffuus in de bulk. Vandaar dat deze interface wazig is en niet zo scherp als de begraven. Daarom zouden verschillende SFG spectrale profielen worden waargenomen voor deze twee interfaces. Onze experimentele SFG-gegevens bewijzen dit, met vermelding van de mogelijkheid om selectief de begraven interface te sonde met de ondergrond of het oppervlak in oplossing.

Interchain-interactie of opsluiting effect op de vorming van zijde Fibroin secundaire structuren: een belangrijke factor is de kritische overlappende concentratie (C *). Voor SF, C * is ~ 1,8 mg/mL. Experimenteel, voor de SF-oplossing van ~ 90 mg/mL (boven C *) werden geen chirale (PSP) sfg-trilsignalen gedetecteerd bij de SF-oplossing/PS-interface, tenzij een inducerende agent-methanol werd toegevoegd, zoals weergegeven in Figuur 7. Maar voor de SF-oplossing van ~ 1 mg/mL (onder C *) kunnen chirale (PSP) sfg-trilsignalen direct worden gedetecteerd zonder methanol toe te voegen, zoals weergegeven in Figuur 8, wat aangeeft dat de bestelde secundaire structuren al zijn gevormd bij de SF oplossing/PS-interface. Aangezien C * een drempel concentratie is voor de overlap van de keten keten, moet de keten interactie of de ruimtelijke opsluiting worden opgevat als een regulerende factor voor de vorming van SF-secundaire structuren op de interface.

Moleculaire water structuren rondom korte-keten oligonucleotide duplex: voor een korte-keten oligonucleotide duplex in de wateroplossing, chirale water sfg trilsignalen corresponderen met de hydratatie laag van de chirale wervelkolom in de kleine groef . Achiral water SFG vibrationele signalen komen meestal overeen met de waterlaag rond de oligonucleotide duplex keten en de dubbellaagse (de chirale wervelkolom van de waterlaag draagt ook bij)33. In een CA2 + concentratiebereik van 0,6 tot 6 mm, zoals weergegeven in Figuur 9, vonden we, er was geen duidelijke verandering voor de chirale water vibrationele signalen in termen van de CA2 + concentratie. Echter, de achiraal water vibrationele signalen werden sterk beïnvloed toen de CA2 + concentratie werd veranderd. Dit geeft aan dat de chirale wervelkolom van de waterlaag die nauw verbonden is met de oligonucleotide duplex het oligonucleotide van de CA2 + ionen kan beschermen, in de normale biologische toestand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd gesteund door het State Key Development Program voor fundamenteel onderzoek van China (2017YFA0700500) en de National Natural Science Foundation of China (21574020). De fundamentele onderzoeksfondsen voor de centrale universiteiten, een project gefinancierd door de prioritaire academische programma ontwikkeling van de Jiangsu hogeronderwijsinstellingen (PAPD) en het National demonstratie Center for experimental Biomedical Engineering Onderwijs (Zuidoost-Universiteit) werden ook zeer gewaardeerd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)  Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P-1g
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 100092680 ≥99.7%
CaF2 prism Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Calcium chloride anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10005817 ≥96.0%
deuterated DPPC (d-DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 860345P-100mg
Electromagnetic oven Zhejiang Supor Co., Ltd C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) trough KSV NIMA Co., Ltd. KN 2003
Lithium bromide anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 20056926
Milli-Q synthesis system Millipore Ultrapure water
Plasma cleaner Chengdu Mingheng Science&Technology Co., Ltd PDC-MG Oxygen plasma cleaning
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) Sigma-Aldrich Co., LLC. 192066 MSDS Mw = 300 000
Polystyrene Sigma-Aldrich Co., LLC. 330345 MSDS Mw = 48 kDa and Mn = 47 kDa
Silk cocoons From Bombyx mori
Single complementary strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H03596 5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
Single strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H04936  3¢-end modified by cholesterol-triethylene glycol(Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Sodium carbonate anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019260 ≥99.8%
Spin-coater Institute of Microelectronics of the Chinese Academy of Sciences KW-4A For the prepartion of ploymer films 
Step profiler Veeco DEKTAK 150 For the measurement of film thickness
Sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy system EKSPLA A commercial picosecond SFG system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, Y. R. Optical Second Harmonic Generation at Interfaces. Annual Review of Physical Chemistry. 40, 327-350 (1989).
  2. Shen, Y. R. Surface properties probed by second-harmonic and sum-frequency generation. Nature. 337, 519-525 (1989).
  3. Lu, X., et al. Studying Polymer Surfaces and Interfaces with Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (1), 466-489 (2017).
  4. Chen, X., Clarke, M. L., Wang, J., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Molecular Conformation and Orientation of Biological Molecules at Interfaces. International Journal of Modern Physics B. 19 (4), 691-713 (2005).
  5. Eisenthal, K. B. Liquid Interfaces Probed by Second-Harmonic and Sum-Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 96 (4), 1343-1360 (1996).
  6. Richmond, G. L. Molcular Bonding and Interactions at Aqueous Surfaces as Probed by Vibrational Sum Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 102 (8), 2693-2724 (2002).
  7. Wang, H., Gan, W., Lu, R., Rao, Y., Wu, B. Quantitative spectral and orientational analysis in surface sum frequency generation vibrational spectroscopy(SFG-VS). International Reviews in Physical Chemistry. 24 (2), 191-256 (2007).
  8. Shultz, M. J., Schnitzer, C., Simonelli, D., Baldelli, S. Sum frequency generation spectroscopy of the aqueous interface: Ionic and soluble molecular solutions. International Reviews in Physical Chemistry. 19 (1), 123-153 (2010).
  9. Li, X., et al. Detecting Surface Hydration of Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) in Solution in situ. Macromolecules. 49, 3116-3125 (2016).
  10. Li, X., Lu, X. Evolution of Irreversibly Absorbed Layer Promotes Dewetting of Polystyrene Film on Sapphire. Macromolecules. 51, 6653-6660 (2018).
  11. Lu, X., Spanninga, S. A., Kristalyn, C. B., Chen, Z. Surface Orientation of Phenyl Groups in Poly(sodium 4-styrenesulfonate) and in Poly(sodium 4-styrenesulfonate): Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) Mixture Examined by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. 26 (17), 14231-14235 (2010).
  12. Lu, X., Clarke, M. L., Li, D., Wang, X., Chen, Z. A Sum Frequency Generation Vibrational Study of the Interference Effect in Poly(n-butyl methacrylate) Thin Films Sandwiched between Silica and Water. Journal of Physical Chemistry C. 115, 13759-13767 (2011).
  13. Lu, X., et al. Directly Probing Molecular Ordering at the Buried Polymer/Metal Interface 2: Using P-Polarized Input Beams. Macromolecules. 45, 6087-6094 (2012).
  14. Lu, X., Myers, J. N., Chen, Z. Molecular Ordering of Phenyl Groups at the Buried Polystyrene/Metal Interface. Langmuir. 30, 9418-9422 (2014).
  15. Li, B., Lu, X., Ma, Y., Han, X., Chen, Z. Method to Probe Glass Transition Temperatures of Polymer Thin Films. ACS Macro Letters. 4, 548-551 (2015).
  16. Li, X., Deng, G., Ma, L., Lu, X. Interchain Overlap Affects Formation of Silk Fibroin Secondary Structure on Hydrophobic Polystyrene Surface Detected via Achiral/Chiral Sum Frequency Generation. Langmuir. 34, 9453-9459 (2018).
  17. Kai, S., Li, X., Li, B., Han, X., Lu, X. Calcium-dependent hydrolysis of supported planar lipids was triggered by honey bee venom phospholipase A2 with the right orientation at the interface. Physical Chemistry Chemical Physics. 20, 63-67 (2018).
  18. Wang, J., Buck, S., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Protein Adsorption. Journal of Physical Chemistry B. 106, 11666-11672 (2002).
  19. Wang, J., et al. Detection of Amide I Signals of Interfacial Proteins in Situ Using SFG. Journal of American Chemical Society. 125, 9914-9915 (2003).
  20. Nguyen, K. T., et al. Probing the Spontaneous Membrane Insertion of a Tall-Anchored Membrane Protein by Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 132, 15112-15115 (2010).
  21. Li, X., Ma, L., Lu, X. Calcium Ions Affect Water Molecular Structures Surrounding an Oligonucleotide Duplex as Revealed by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  22. Sartenaer, Y., et al. Sum-frequency generation spectroscopy of DNA monolayers. Biosensors & Bioelectronics. 22, 2179-2183 (2007).
  23. Asanuma, H., Noguchi, H., Uosaki, K., Yu, H. Metal Cation-induced Deformation of DNA Self-Assembled Monolayers on Silicon: Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 130, 8016-8022 (2008).
  24. Howell, C., Schmidt, R., Kurz, V., Koelsch, P. Sum-frequency-generation spectroscopy of DNA films in air and aqueous environments. Biointerphases. 3 (3), FC47 (2008).
  25. Walter, S. R., Geiger, F. M. DNA on Stage: Showcasing Oligonucleotides at Surfaces and Interfaces with Second Harmonic and Vibrational Sum Frequency Generation. Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 9-15 (2010).
  26. Li, Z., Weeraman, C., Azam, M. S., Osman, E., Gibbs-Davis, J. The thermal reorganization of DNA immobilized at the silica/buffer interface: a vibrational sum frequency generation investigation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 12452-12457 (2015).
  27. Lambert, A. G., Neivandt, D. J., Briggs, A. M., Usadi, E. W., Davies, P. B. Interference Effects in Sum Frequency Spectra from Monolayers on Composite Dielectric/Metal Substrates. Journal of Physical Chemistry B. 106, 5461-5469 (2002).
  28. Tong, Y., et al. Interference effects in the sum frequency generation spectra of thin organic films. I. Theoretical modeling and simulation. Journal of Chemical Physics. 133, 034704 (2010).
  29. McGall, S. J., Davies, P. B., Neivandt, D. J. Interference Effects in Sum Frequency Vibrational Spectra of Thin Polymer Films: An Experimental and Modeling Investigation. Journal of Physical Chemistry B. 108, 16030-16039 (2004).
  30. Li, B., et al. Interfacial Fresnel Coefficients and Molecular Structures of Model Cell Membranes: From a Lipid Monolayer to a Lipid Bilayer. Journal of Physical Chemistry C. 118, 28631-28639 (2014).
  31. Zhou, J., Anim-Danso, E., Zhang, Y., Zhou, Y., Dhinojwala, A. Interfacial Water at Polyurethane-Sapphire Interface. Langmuir. 31 (45), 12401-12407 (2015).
  32. Gautam, K. S., et al. Molecular Structure of Polystyrene at Air/Polymer and Solid/Polymer Interfaces. Physical Review Letters. 85 (18), 3854-3857 (2000).
  33. Yan, E. Y., Fu, L., Wang, Z., Liu, W. Biological Macromolecules at Interfaces Probed by Chiral Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Chemical Reviews. 114, 8471-8498 (2014).
  34. Belkin, M. A., Kulakov, T. A., Ernst, K. H., Yan, L., Shen, Y. R. Sum-Frequency Vibrational Spectroscopy on Chiral Liquids: A Novel Technique to Probe Molecular Chirality. Physical Review Letters. 85, 4474 (2000).
  35. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6, 1612-1631 (2011).

Tags

Biochemie uitgave 150 analytische diagnostische en therapeutische technieken en apparatuur onderzoekstechnieken verschijnselen en processen fysische fenomenen chemie en materialen chemie en materialen (algemeen) anorganische organische en fysische Chemie fysica Atoom-en moleculaire fysica optica sfg Fresnel-coëfficiënten interfaciaal moleculaire structuren polymeren biomacromoleculen chirale structuur ruimtelijke opsluiting
Interfaciale moleculaire-niveau structuren van polymeren en biomacromoleculen onthuld via Sum frequentie generatie Vibrationele spectroscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial… More

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. J. Vis. Exp. (150), e59380, doi:10.3791/59380 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter