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Genetics

HOX Locus Focused CRISPR/sgRNA bibliothèque préalable identifier critique FCCT limites

Published: March 31, 2019 doi: 10.3791/59382
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 3, 1
1Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

Summary

Une bibliothèque CRISPR/sgRNA a été appliquée à interroger des gènes codant pour des protéines. Toutefois, la faisabilité d’une bibliothèque de sgRNA afin de découvrir la fonction d’une limite de la FCCT dans la régulation des gènes reste inexplorée. Nous décrivons ici une bibliothèque de sgRNA spécifiques de locus HOX afin d’élucider la fonction des limites de la FCCT dans loci HOX .

Abstract

Facteur de CCCTC-liaison (FCCT)-médiation stable topologiquement associant des domaines (TADs) jouent un rôle crucial dans les interactions contraignantes des éléments d’ADN qui sont trouvent dans le pays voisin dat. FCCT joue un rôle important dans la régulation de l’expression spatiale et temporelle des gènes HOX qui contrôlent le développement embryonnaire, la structuration du corps, hématopoïèse et leucémogenèse. Cependant, il reste largement méconnue si et comment HOX loci associés FCCT limites réglementent l’organisation de la chromatine et expression du gène HOX . Dans le protocole actuel, une bibliothèque de mise en commun de sgRNA spécifiques ciblant tous les sites de fixation FCCT dans les locus HOXA/B/C/D a été générée afin d’examiner les effets des perturbateurs limites FCCT associées à la chromatine sur la formation de TAD et gène HOX expression. Par le biais de CRISPR-Cas9 dépistage génétique, le site de liaison FCCT situé entre les gènes HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) a été identifié comme un régulateur essentiel du domaine de chromatine oncogènes, comme étant important pour le maintien de gène HOX ectopique modèles d’expression de MLL-réarrangé la leucémie myéloïde aiguë (AML). Ainsi, cette bibliothèque sgRNA dépistage approche donne une idée nouvelle organisation génomique FCCT médiée au locus spécifique et fournit également une base pour la caractérisation fonctionnelle des éléments réglementaires génétiques annotés, les deux codes et non-codantes, au cours d’un processus biologique normal dans l’ère du projet génome humain après.

Introduction

Des études d’interaction du génome récentes ont révélé que les formes du génome nucléaire humain stable topologiquement associant domaines (TADs) qui sont conservées à travers les espèces et les types de cellules. L’organisation du génome dans des domaines distincts facilite et limite les interactions entre les éléments de régulation (par exemple, des promoteurs et des rehausseurs). Le facteur de liaison CCCTC (FCCT) lie aux limites du TAD et joue un rôle crucial dans les interactions contraignantes des éléments d’ADN qui sont trouvent dans la voisine TADs1. Cependant, génome large FCCT liaison de données a révélé que, bien que FCCT interagit principalement avec les mêmes ADN-sites dans différents types de cellules, il fonctionne souvent comme un obstacle de la chromatine dans un site spécifique à un type de cellule, mais pas dans l’autre, ce qui suggère que les fonctions FCCT ainsi que d’autres activités dans la formation de la chromatine limites2. Ce qui reste inconnu, c’est savoir si les éléments de frontière (sites de liaison du FCCT) sont directement liées à la fonction biologique de la FCCT et comment ces liens se produisent. Par conséquent, nous émettons l’hypothèse que les sites de fixation spécifiques FCCT dans le génome directement régulent la formation des dat et contrôlent les interactions de promoteur/enhancer dans ces domaines ou entre les domaines voisins. L’achèvement du homme et projets de séquençage du génome des souris et des analyses subséquentes épigénétiques ont découvert de nouvelles signatures moléculaires et génétiques du génome. Cependant, le rôle des signatures spécifiques/modifications dans la régulation des gènes et la fonction cellulaire, ainsi que leurs mécanismes moléculaires, doivent encore être pleinement compris.

Plusieurs sources de données prend en charge que les DAT induite par le FCCT représentent la chromatine fonctionnelle domaines3,4,5. Bien que le FCCT interagit principalement avec les mêmes ADN-sites dans différents types de cellules, génome large FCCT ChIP-seq données révèlent que FCCT fonctionne souvent comme un obstacle de la chromatine dans un type de cellule, mais pas dans les autres2. FCCT joue un rôle essentiel au cours du développement par la médiation du génome organisation4,6,7. Perturbation des limites de la FCCT altérée des interactions enhancer/promoteur et l’expression des gènes, menant au colmatage du développement. Ceci suggère que FCCT médiée dat sont non seulement des composants structurels, mais aussi des unités réglementaires requises pour enhancer bonne action et gène transcription5,8,9.

Les gènes HOX jouent un rôle crucial durant le développement embryonnaire et ils sont limités dans le temps et dans l’espace dans leurs profils d’expression. Le locus HOXA forme deux dat stable, séparant les gènes antérieurs et postérieurs par un élément de limite associée à FCCT dans les CSEh et de cellules IMR901. Des rapports récents ont démontré que le HoxBlinc, un lncRNA de locus associés HoxB , intervient dans la formation de la FCCT réalisé TADs et interactions enhancer/promoteur dans le locus HOXB . Cela conduit à l’activation de gène HOXB antérieure lors d’engagement et la différenciation ESC10. En outre, au locus spécifique dont le locus HOXA , altération de la FCCT véhiculée par les profils d’expression génique spécifique lignée TAD domaines changés et a été associée au développement de la maladie États11,12. La preuve étaye une fonction primordiale pour FCCT dans la coordination transcription génique et déterminer l’identité de la cellule en organisant le génome en domaines fonctionnels.

Malgré son rôle dans le développement embryonnaire, au cours de l’hématopoïèse, HOX gènes régulent la fonction des cellules (HS/PC) souches et progénitrices hématopoïétique. Cela se fait en contrôlant l’équilibre entre la prolifération et la différenciation10,13,14,15. L’expression des gènes HOX est étroitement contrôlée tout au long de la spécification et la différenciation de cellules hématopoïétiques, avec la plus haute expression dans HS / expression génique PCs. HOX diminue graduellement au cours de la maturation, avec ses niveaux les plus bas se produisant dans différenciés de cellules hématopoïétiques16. Dérégulation du gène HOX est un mécanisme dominant de transformation leucémique par dysregulating des propriétés autorenouvellement et différenciation de HS/PCs, conduisant à une transformation leucémique17,18. Cependant, le mécanisme d’établir et de maintenir normal vs patrons d’oncogènes expression des gènes HOX ainsi que des réseaux de régulation associés reste peu clair.

CRISPR-Cas9 sgRNA criblage a été largement utilisé pour interroger de gènes codant pour des protéines19 comme bien que non codantes des gènes, comme lncRNA20 et miRNA21 chez différentes espèces. Toutefois, le coût d’utilisation de la bibliothèque de sgRNA CRISPR-Cas9 à identifier de nouvelles cibles génomiques demeure élevé, parce que le séquençage du génome de haut débit est souvent appliqué pour vérifier le criblage de sgRNA. Notre sgRNA système de contrôle se concentre sur les loci de génome spécifique et évalue le ciblage sgRNAs par une étape de RT-PCR selon l’expression du gène marqueur, comme HOXA9. En outre, Sanger séquençage a confirmé que le sgRNA a été intégré dans le génome et Indel mutations peut être détecté pour identifier la sgRNA site de ciblage. Par l’intermédiaire du dépistage génétique de la CRISPR-Cas9 locus-spécifiques, la limite de la chromatine CBS7/9 a été identifiée comme un régulateur critique pour l’établissement domaine de chromatine oncogènes et le maintien des modèles d’expression de gène HOX ectopiques dans la pathogenèse de l’AML 12. la méthode peut être largement appliquée pour identifier non seulement la fonction spécifique du contour de la FCCT dans le développement embryonnaire, l’hématopoïèse, leucémogenèse, mais aussi limite FCCT comme cibles thérapeutiques potentielles futures thérapie épigénétique.

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Protocol

1. FCCT sgRNALibrary Design à l’aide d’un outil en ligne

  1. Concevoir la sgRNA ciblant les sites de fixation FCCT dans les locus HOX humains en utilisant l’outil concepteur de la plate-forme (GPP) de perturbation génétique (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  2. Synthétiser un total de 1 070 sgRNAs composé de sgRNAs ciblage 303 gènes ciblage aléatoires, 60 témoins positifs, 500 non-homme-ciblage des contrôles et 207 éléments FCCT ou lncRNA ciblant les gènes (Figure 1, tableau 1). Chaque élément d’ADN ciblage est ciblé par les différentes sgRNAs 5-10.

2. sgRNA bibliothèque clonage

  1. Cloner les oligonucléotides synthétisés dans le vecteur lentiviral épine dorsale CRISPR (lentiCRISPRv2).
    1. Digérer le vecteur LentiCRISPRv2 avec l’enzyme de restriction BsmBI à 37 ° C pendant 2 h.
    2. Recherchez la présence de la bande plus large (environ 12 873 bp) sur le gel après digestion de BsmBI et de le purifier ensuite avec le kit d’extraction de gel.
      Remarque : Un morceau de petit remplissage 2 Ko est également présent sur le gel après digestion, mais cela doit être ignorée.
    3. Ligaturer les oligonucléotides synthétisés et digérées LentiCRISPR vector avec 150 ng de LentiCRISPR ADN, 1 µL de 10 µM oligos, 2 µL de tampon de ligase 10 x T4, 1 µL de T4 ligase, digéré et puis les incuber à 16 ° C durant la nuit.
  2. Transformer la bibliothèque CRISPR/sgRNA des gènes dans des cellules capables d’electro à l’amplification.
    1. Préparer l’électroporateur à 1.8 kV, Ω 200 et 25 µF. Réchauffez la récupération médias SOC dans un bain-marie à 37 ° C, puis réchauffez LB ampicillin antibiotiques plaques à 37 ° C.
    2. Décongeler les cellules compétentes sur la glace pendant 10 min.
    3. Préparer les tubes micro-centrifugeuse de 1,5 mL et 1 mm électroporation cuvettes sur la glace.
    4. Mélanger 1 µL d’une ADN de plasmide de bibliothèque 10 ng/µL dans 25 µL de cellules compétentes dans un tube à centrifuger-micro 1,5 mL et mélanger doucement en effleurant le fond du tube plusieurs fois manuellement.
    5. Une fois que la cuve est assez froide, transvaser le mélange de cellules ADN/compétente dans il. Appuyez deux fois sur le comptoir et essuyer les gouttelettes d’eau de l’extérieur de la cuve avec un papier de soie. Ensuite, placez la cuve dans le module d’électroporation et appuyez sur impulsion.
    6. Immédiatement ajouter 975 µL de 37 ° C préchauffé médias SOC. Mix de pipetage de haut en bas et transférez dans un tube de 15 mL.
    7. Faites pivoter et incuber à 37 ° C pendant 1 h.
    8. Diluer 100 cellules µL dans 900 µL des médias SOC et déposer sur une plaque de gélose antibiotique ampicilline LB 100 µL. Incuber une nuit à 37 ° C.
  3. Extraire l’ADN plasmidique des colonies combinées avec une colonne de maxi-prep comme indiqué dans le protocole du fabricant.
    1. Grattez toutes les colonies de la gélose LB et ensemencer une culture starter 2 ml de milieu d’antibiotique ampicilline LB et incuber une nuit à 37 ° C avec agitation vigoureuse (~ 200 x g).
    2. Diluer au 1/500 de la culture starter dans 100 mL de milieu ampicilline LB et incuber à 37 ° C pendant 12 à 16 h avec agitation vigoureuse (~ 200 x g).
    3. Récolter le culot cellulaire bactérienne par centrifugation à 6 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
    4. Resuspendre le culot bactérien dans 10 mL de tampon de suspension.
    5. Lyse le culot de suspension avec 10 mL de tampon lyse et vigoureusement inverser 4 - 6 fois. Incuber le lysat pendant 5 min à température ambiante.
    6. Neutraliser le lysat avec 10 mL de tampon de neutralisation réfrigérés. Mélanger en retournant délicatement les tubes le 4 - 6 fois et il incuber pendant 20 min sur la glace.
    7. Tournez en bas à 13 500 x g pendant 30 min à 4 ° C. Rapidement transférer le surnageant contenant l’ADN de plasmide dans un nouveau tube.
    8. Répétez l’étape 2.3.7 et transférer rapidement le surnageant contenant l’ADN de plasmide dans un nouveau tube.
    9. Équilibrer la colonne en appliquant 10 mL de tampon d’équilibration et laissez la colonne vide par écoulement gravitaire.
    10. Ajouter le liquide surnageant à la colonne et lui permettre d’entrer la résine par écoulement gravitaire.
    11. Laver la colonne avec 2 x 30 mL de tampon de lavage.
    12. Éluer l’ADN avec 15 mL de tampon d’élution.
    13. Précipiter l’ADN 10,5 ml d’isopropanol à température ambiante à l’ADN éluée. Mix et un essorage descendre immédiatement à 15 000 x g pendant 30 min à 4 ° C et éliminer délicatement le surnageant.
    14. Laver le culot d’ADN avec 5 mL d’éthanol à 70 %, granule d’ADN de centrifugeuse à 15 000 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant clair.
    15. Répétez l’étape 2.5.14 deux fois plus.
    16. Centrifuger le granule d’ADN à 15 000 x g pendant 10 min et éliminer délicatement le surnageant sans déranger le culot d’ADN.
    17. Sécher le culot pendant 5-10 min et dissoudre l’ADN contenu dans un volume de tampon (buffer de TE, pH 8,0) requis.

3. le titre élevé sgRNA bibliothèque Lentivirus génération

  1. Préparation de cellules : les cellules HEK293T Culture dans de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % (vol/vol) sérum fœtal (SVF) et antibiotique de pénicilline-streptomycine de 1 % (vol/vol) (PS) dans des flacons de T-25. Placez-les dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.
  2. Paquet de lentivirus : co transfecter cellules HEK293T avec 20 µg de vecteurs de bibliothèque purifiée de l’étape 2, 15 µg du plasmide paquet (psPAX2) et 10 µg du plasmide enveloppe (pMD2.G) pendant 48 h avant la récolte du virus.
  3. Collection de virus : après 48 h, collectthe virus surnageant et filtrer le surnageant à travers une membrane 0,45 µm hypoprotidique liaison PVDF de virus.
  4. Concentration de virus : concentrer le liquide surnageant des gènes par 50 fois en utilisant le concentrateur et le virus MOI d’essai à l’étape 5.
  5. Stockage de virus : le concentré aliquote virus et magasin dans un congélateur à-80 ° C.

4. optimisé Puromycine Concentration

  1. Culture de cellules de la leucémie : des cellules de Culture MOLM13 AML en RPMI 1640 additionné de 10 % (vol/vol) sérum fœtal (SVF) et 1 x antibiotiques pénicilline-streptomycine (PS) dans une fiole de T-125. Placez-les dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.
    Remarque : Les cellules sont généralement passés chaque 4-5 d à un ratio de partage de 1:4 ou 1:6, jamais permettant aux cellules d’atteindre plus de 70 % confluence.
  2. Mettre en place des cellules de MOLM13 dans une plaque de 12 puits avec une densité de 1,0 x 104 cellules/mL, à un volume total de 2 mL par puits (2,0 x 104 cellules).
  3. Analyse temporelle : cellules MOLM13 de traiter avec la puromycine pendant 7 jours en augmentant les concentrations (µg/mL 0,1, 0,2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1,0 µg/mL et 2,0 µg/mL)
    1. Mettre en place des cellules MOLM13 sans traitement puromycine au jour J0 et mis en place 3 puits répétées sans traitement puromycine comme un contrôle du jour 0 au jour 7.
    2. Traiter les cellules MOLM13 avec 0,1 µg/mL, 0,2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1,0 µg/mL et 2,0 µg/mL, séparément, avec chaque condition expérimentale contenant 3 puits répétées.
    3. Compter le ratio de cellules vivantes et faire une courbe de survie du jour 0 au jour 7, qui contient toutes les conditions.
  4. Courbe de survie : coloration des cellules à Trypan blue comte viabilité et tous les jours pour obtenir les courbes de survie pour chaque concentration de puromycine.
  5. Optimiser la concentration minimale puromycine : déterminer la concentration de la puromycine minime grâce à la coloration bleu Trypan, en qui MOLM13 toutes les cellules sont tuées entre 5-7 jours.

5. titrage d’une bibliothèque des gènes dans les cellules de la leucémie MOLM13

  1. Préparation de cellules AML : prélever des cellules MOLM13 AML avec le milieu de la transduction (RPMI 1640, 10 % SVF et 1 % PS 8,0 µg/mL de milieu de revêtement) à une densité de 1,5 x 106 cellules/ml.
  2. Cellules de lieu MOLM13 dans la plaque de 12 puits avec 1. 5 x 106 cellules dans chaque puits.
  3. Décongeler le lentivirus : Retirez le lentivirus concentré du congélateur-80 ° C et décongelez-le sur la glace.
  4. Mix MOLM13 cellules avec une dose différente du lentivirus concentré dans des puits distincts, y compris 0, 1, 2.5, 5, 7,5 et 10 µL (totales 6 groupes).
  5. Immédiatement, centrifuger ces mélanges à 1 000 x g pendant 2 h à 33 ° C et les plaques de 12 puits de transfert retour à l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 4 h.
  6. Après 4 h, tournez en bas les cellules infectées à 400 x g pendant 5 min à température ambiante.
  7. Doucement aspirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire et remettre en suspension les cellules transduits avec supports neufs (RPMI 1640, PS de SVF et 1 % 10 %) et puis transférez-les sur flacons T-25 et incuber à 37 ° C pendant 48 h sans puromycine.
  8. Après 48 h, diviser ces cellules en 2 flacons (2 groupes) : un groupe expérimental traité avec 1 puromycine µg/mL pendant 5 jours et un groupe témoin sans traitement puromycine pendant 5 jours.
  9. Procéder à la sélection puromycine pendant 5 jours avec 1 puromycine µg/mL après l’étape 4 jusqu'à ce que toutes les cellules de contrôle non-transduites sont morts. Échange pour les supports neufs tous les 2 jours.
  10. Mesurer la valeur optimisée de MOI pour la transduction en divisant le nombre de cellules vivantes, traités avec la puromycine avec le nombre de cellules sans traitement puromycine.

6. la transduction de la bibliothèque de KO CRISPR-Cas9 regroupées

  1. Transduction avec lentivirus : infecter 1,5 x 106 MOLM13 cellules avec 0,3 MOI de lentivirus sgRNA mis en commun dans un milieu (RPMI 1640, 10 % FBS, PS 1 % et 8 µg/mL de milieu de revêtement) en plaque 6 puits et utiliser les cellules sans l’infection lentivirus comme un contrôle.
  2. Immédiatement, centrifuger la plaque 6 puits à 1 000 x g pendant 2 h à 33 ° C à spinfect les cellules et les plaques de transfert retour à l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 4 h.
  3. Tournez en bas les cellules infectées à 400 x g pendant 5 min à température ambiante.
  4. Doucement aspirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire et remettre en suspension les cellules transduits avec supports neufs (RPMI 1640, PS de SVF et 1 % 10 %) et puis transférez-les sur flacons T-25 et incuber à 37 ° C pendant 48 h sans puromycine.
  5. Après 48 h, traiter des cellules avec la 1 puromycine µg/mL pendant 5 jours. Après 2 jours d’échange pour les supports neufs et garder une densité cellulaire optimal.
  6. Le seul clone en plaques 96 puits à limiter les méthodes de dilution des semences et incuber ces clones unique à 37 ° C et 5 % de CO2. Leur culture pendant 3 à 4 semaines.
  7. Après qu’une seule cellule grandit dans une population, la moitié des cellules de transfert en plaques 24 puits pour mise en culture sous sélection puromycine et vérifier ces clones à l’étape suivante. Garder le reste des cellules.

7. sélection de la bibliothèque de KO CRISPR-Cas9 mis en commun avec le One-step RT-qPCR

  1. Déterminer l’efficacité du clone sgRNA intégré de dépistage en évaluant l’expression du gène marqueur HOXA9 avec une seule étape de la transcriptase-inverse PCR (RT-qPCR en une seule étape).
    Remarque : HOXA9 sont fortement exprimés dans les cellules MOLM13 AML leucémogenèse22,23.
  2. Comte le sgRNA intégré MOLM13 cellulaire et transfert 1 x 104 cellules / puits d’une plaque PCR 96 puits.
  3. Centrifuger le tube à 1 000 x g pendant 5 min et ensuite soigneusement retirer et jeter le surnageant avec une pipette sans déranger le culot cellulaire.
  4. Laver les cellules avec 125 µL de tampon PBS et centrifuger le tube à 1 000 x g pendant 5 min. Puis retirez 120 µL du liquide surnageant à l’aide d’une pipette et le conserver environ 5 µL de PBS dans chaque puits.
  5. Ajouter 50 µL du mélange maître lyse cellulaire contenant 48 µL de tampon de lyse cellulaire, 1 µL de solution de protéinase K (10 mg/mL) et 1 µL de solution de DNase (1 mg/mL) dans chaque puits. Puis la pipette et descendre 5 fois pour remettre en suspension le culot cellulaire.
  6. Incuber le mélange pendant 10 min à température ambiante, suivie de 5 min à 37 ° C et puis 75 ° C pendant 5 min.
  7. Stocker le lysat cellulaire au congélateur-80 ° C.
  8. La préparation de la réaction de RT-qPCR one-step : décongeler le mélange en une seule étape de réaction et d’autres composants de réaction à 4 ° C. Ensuite tournez en bas brièvement à collecter des solutions au fond des tubes et placer sur la glace sans lumière. Mélangez et faites tourner doucement.
  9. Ajouter 1 µL de lysat cellulaire dans les puits PCR avec le mélange de réaction de RT-qPCR, y compris 1 µL d’apprêt avant du gène marqueur (300 nM) et amorce de marche arrière (300 nM), 0.125 µL de la transcriptase inverse (10 U/µL) et 5 µL du mélange de réaction en une seule étape (x 2).
  10. Sceller le puits avec film optiquement transparent et doucement vortex et mélanger les composants de la réaction.
  11. Placer la plaque PCR 96 puits sur un appareil de PCR en temps réel.
  12. Exécutez la réaction de transcription inverse pendant 10 min à 50 ° C, suivie d’inactivation de la polymérase et la dénaturation de l’ADN pendant 1 min à 95 ° C.
  13. Réaliser la RT-PCR avec 40 cycles de réaction PCR : dénaturation pendant 15 s à 95 ° C, recuit/extension et plaque fluorescence lecture pour 20 s à 60 ° C, puis analyse des courbes de fusion entre 65 et 95 ° C par incréments de 0,5 ° C à 2-5 s/étape.
  14. Mettre en place surexprimés, réprimés et aucun changement de groupes selon les niveaux d’expression du gène HOXA9 par comparaison au contrôle, séparément. Utiliser β-actin gene comme un contrôle de gène de ménage.

8. vérification des sgRNAs intégré des Clones positifs par le biais de génotypage et séquence de Sanger

  1. Vérifier les clones d’expression HOXA9 diminué par Sanger sequencing et effectuer une PCR avec 50 à 100 ng MOLM13 du génome ADN, 5 µL polymérase réaction de tampon (10 x), 1 µL avant l’apprêt (10 µM) (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) et inverse 1 µL apprêt (10 µM) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 µL dNTP (10mM), la polymérase 1 unité (5 U /µL). Effectuer la réaction de PCR avec la dénaturation initiale 94 ° c pendant 30 s et puis plus dénaturation à 94 ° C pendant 20 s, recuit à 56 ° C pendant 20 s, extension à 68 ° C pendant 20 s (total 30 cycles), ultime prorogation à 68 ° C pendant 10 min et puis maintenant à 4 ° C.
  2. Extraire et purifier les produits PCR (dimensions 285 bp) avec un Kit de Purification de PCR.
  3. Ligaturer les produits PCR purifiés dans le vecteur T avec 2 µL T4 ligature de tampon (10 x), 50 ng T vecteur ADN (50 ng/µL), 25 ng purifiée PCR ADN (285 bp), ligase T4 de 1 µL (3 unités/µL) et place la ligature mélangent dans un incubateur à 16 ° C durant la nuit.
  4. Transférer le mélange de ligation dans la cellule compétente DH5α, poussent sur une plaque de gélose antibiotique ampicilline LB et incuber une nuit à 37 ° C.
  5. Sélectionner les clones unique de la plaque LB et les vérifier par génotypage et Sanger séquençage.

9. détection des sgRNAs Mutation Indel induite par nucléase Digestion dosage

  1. Détecter que le sgRNA intégré unique clone induite Indel taux par un nucléase test test.
  2. Préparer séparément les amplimères PCR avec 50 à 100 ng Indel mutant (test) et ADN de type sauvage (WT, référence) en tant que modèle PCR, 5 µL de tampon de réaction polymérase (x 10), 1 µL dNTP (10mM), polymérase 1 unité (5 U/µL), primer avant 1 µL (10 µM) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') et 1 µ L inverse amorce (10 µM) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). La réaction PCR a été réalisée avec la dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 s, puis la dénaturation à 98 ° C pendant 20 s, recuit à 56 ° C pendant 20 s, extension à 72 ° C pendant 30 s (total 30 cycles) et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min et maintenant à 4 ° C.
  3. Mettre en place le groupe de mélange hétéroduplex avec 200 ng de la « référence » (20 ng/µL) et 200 ng amplimères PCR « test » (20 ng/µL) dans le tube PCR de 0,2 mL, et le groupe de mélange de homoduplex avec seulement 400 ng de « référence » amplimères PCR comme un contrôle.
  4. Séparément, incuber le mélange hétéroduplex homoduplex à 95 ° C pendant 5 min dans un bécher de 1 L rempli avec 800 mL d’eau et ensuite refroidir à température ambiante pour recuire et former des hétéroduplex ou homoduplexes progressivement.
  5. Séparément digest 400 ng du mélange hétéroduplex et homoduplex recuit avec 1 µL indel mutation détection la nucléase (2,5 U/µL) et 2 µL nucléase réaction tampon (10 x) à 42 ° C pendant 60 min.
  6. Analyse des échantillons digérés avec électrophorèse sur gel d’agarose, l’ADN de mélange hétéroduplex devrait être coupé en petits fragments (bp 70-250) et le homoduplex ADN (320 bp) ne doivent pas être coupées.

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Representative Results

CRISPR-Cas9 technologie est un outil de recherche performant pour les études de génomique fonctionnelles. Il supplante rapidement le gène classique techniques d’édition et a haute utilité pour des applications axées sur le gène pangénomique tant qu’individuelles. Ici, la première individuellement clonés locus-spécifiques CRISPR-Cas9-arrayed sgRNA bibliothèque contient 1 070 sgRNAs composé de sgRNAs ciblage 303 gènes ciblage aléatoires, 60 témoins positifs, 500 non-homme-ciblage des contrôles et 207 éléments FCCT ou lncRNA ciblage de gènes dans quatre loci HOX (Figure 1, tableau 1). Cette bibliothèque cible tous les motifs de liaison pour le noyau FCCT, HOX gènes associés lncRNAs, appelés éléments de régulation et plusieurs gènes HOX témoins positifs dans les loci HOX . Il contient également des sgRNAs ciblage aléatoire non - les gènesHOX , gènes non-humains et régions intergéniques comme témoins négatifs. Afin d’améliorer l’efficacité et la spécificité de la FCCT site knock out (KO) par transduction lentiCRISPR, chaque site ciblage contient 5-10 sgRNAs (tableau 1). Le protocole décrit ici, sgRNA bibliothèques sont conçus selon les sites de liaison FCCT au locus HOXA/B/C/D et lncRNAs dans ces lieux, qui est basé sur les outils de sgRNA du Broad Institute (Figure 1, Figure 2). Après transduction à une multiplicité de faible d’infection avec un MOI de 0,3 dans les cellules MOLM13 transportant la fusion de MLL-AF9, le taux d’infection est inférieure à 1 sgRNA/cellule, suivie par la sélection de la puromycine, et puis les clones résistants issues du monocellulaire ensemencé ont été projeté pour créances douteuses de l’expression des gènes HOXA9 .

Le flux de travail pour sgRNA criblage a été brièvement décrit (Figure 3). Tout d’abord, la bibliothèque de sgRNA conteneur de virus ont été générés dans les cellules HEK293T avec l’aide de deux vecteurs (psPAX2 et pMD2.G). sgRNA mis en commun bibliothèque lentivirus ont été concentrées et transduites en cellules de Lam MOLM13 avec polybrane (8,0 µg/mL). Après une transduction de 48 h, les cellules ont été traitées avec la concentration optimale de puromycine. Après 5 jours, les cellules ont été ensemencées une cellule par puits dans les plaques à 96 puits et les clones unique ont été générés en présence de la puromycine. Enfin, sgRNA clones unique intégrés dans le génome ont été identifiés par une étape de RT-PCR, Sanger séquençage et détection de mutations Indel (Figure 3). Les clones unique résistant à la puromycine sont identifiés par l’intermédiaire de gouttelettes en une seule étape numérique RT-qPCR (RT-ddqPCR) selon en modifiant l’expression de l’oncogène HOXA9 (Figure 4). Génotypage et séquence de Sanger ont été réalisés pour sgRNA construction de la bibliothèque et la vérification (Figure 2, Figure 4).

sgRNA ciblage MOLM13 clones positifs dans une plaque à 96 puits PCR ont été confirmées avec la méthode de la RT-qPCR basée sur les gènes desniveaux d’expression des HOXA9 par comparaison avec les cellules du contrôle. Hors le 528 survivant clones projeté, 10 clones présentaient plus de 50 % de réduction dans les niveaux de HOXA9 (Figure 4 a). sgRNAs intégré dans le HOXA9-réduit, HOXA9-inchangé et HOXA9-clones accrues ont été confirmées par l’amplification des séquences sgRNA avec accompagnement vecteur amorces PCR. Les produits PCR purifiés étaient ligaturés dans le système de vecteur T par l’intermédiaire de ligase T4 et envoyés pour l’identification de la séquence de Sanger (voir étape 8). Les données de séquence indiquent que hors 30 clones séquencés, 21 clones inclus unique sgRNA (tableau 2). Les catégories de sgRNA ont été identifiées et analysées selon les niveaux d’expression de HOXA9 . Six des dix clones montrant une réduction en HOXA9 niveaux figurant sgRNAs ciblant le site CBS7/9, mais pas dans les gènes non-humains, des gènes humains au hasard et d’autres contrôles de site FCCT (Figure 4 et tableau 2).

sgRNA intégré positive unique induite par le clone Indel mutations sont déterminées par PCR-based génotypage et nucléase digestion basée sur le dosage de la nucléase (Figure 5). Le test de digestion nucléase a été réalisé afin d’identifier les mutations se sont produites dans la limite de CBS7/9 dans le représentant HOXA9de Indel-réduit, HOXA9 -inchangé, et HOXA9-a augmenté de clones. Les résultats ont révélé que la mutation de CBS7/9 a été trouvée dans 4 sur le 6 HOXA9-réduit les clones : clones #5, 6, 28 et 121, mais pas en clones #15 et #31 (Figure 5). Cependant, clone #15 figure la sgRNA ciblant HOTTIP lncRNA site, , tandis que clone #31 contenait plusieurs sgRNAs ciblant les HOAIRM1 lncRNA, lncRNA HOTAIR et site de liaison HOXD9/10 FCCT (Figures 4 b, 5 et tableau 2).

Figure 1
Figure 1 : Diagramme schématique montrant des sites de fixation de la FCCT et lncRNAs dans quatre HOX locus. Chaque élément ciblage d’ADN contient les différents sgRNAs 5-10. FCCT ChIP-seq dataset a été téléchargé à partir de GEO (GSM1335528) et visualisé avec le Viewer génomiques intégrées (IGV). Ciblage sites FCCT SgRNA loci HOX ont été étiquetés avec des ciseaux orange. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 2
Figure 2 : Diagramme schématique représentant la partie d’intégrer la séquence vecteur sgRNA et amorces PCR amplification. Les amorces d’amplification PCR ont été conçus selon la séquence vide du vecteur lentiviral sgRNA. L’apprêt avant (P1) a été surligné en jaune, l’amorce de marche arrière (P2) a été soulignée en rouge et le sgRNA a été mis en évidence en vert dans le vecteur lentiviral sgRNA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 3
Figure 3 : Diagramme schématique qui représente le flux de travail pour la vérification, la construction et la conception de bibliothèque sgRNAs. Ce flux de travail est la suivante. Tout d’abord, la bibliothèque de sgRNA a été conçue et clonée dans un vecteur lentiviral de CRISPR, et puis le lentivirus a été emballé avec les sgRNA bibliothèque vector, psPAX2 et pMD2.G vecteurs lentiviraux dans les cellules HEK293T. Ensuite, les cellules MOLM13 ont été infectés par un virus MOI (0,3) faible et ces cellules subissent la sélection puromycine. Ensuite, le seul clone a été ensemencé dans une plaque à 96 puits. Enfin, les clones de sgRNA unique intégrés dans un génome ont été identifiés par une étape RT-qPCR, séquence de Sanger et détection de mutations Indel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 4
Figure 4 : Mise en commun CRISPR-Cas9 KO criblage identifié à une étape RT-qPCR et séquence de Sanger. (A) une étape RT-gouttelettes numérique criblage d’ACP de l’expression HOXA9 en simples clones infectés par le lentivirus contenant la bibliothèque de sgRNA. La projection de 528 sgRNA bibliothèque infecté clones pour les niveaux d’expression HOXA9 est montrée (528 points). Dix de 528 clones présentés plus de 50 % de réduction en HOXA9 niveaux (flèches violettes). La ligne rouge indique la limite d’un changement de facteur 2 baisse en comparant avec les cellules de contrôle ; la ligne bleue indique la limite d’un changement de l’augmentation de 2 fois. (B) les six clones #5, 6, 28, 121, 207 et 420 ont été ciblés par la sgRNA spécifique CBS7/9 par le biais de séquences de Sanger (flèches vertes). (C) l’analyse RT-ddqPCR de HOXA9 niveaux de MOLM13 WT et les 21 clones contenant unique sgRNA ciblée. Les données d’expression de HOXA9 ont été regroupées en cinq groupes selon les catégories de séquences sgRNA : site FCCT HOXA7/9 , les cibles de non-humains, les autres sites FCCT dans les locus HOX , HOX associés lncRNAs, et autres cibles humaines. Ce chiffre a été modifié par Luo et al.12. Pour les statistiques, ces données était représentées comme la moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes, avec test-t de l’élève. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Indel mutations de sgRNAs intégrée clone positif confirment avec le test de génotypage et nucléase basées sur la PCR. (A)  L’ADN génomique a été isolé chez les clones représentatifs bibliothèque projeté CRISPR-Cas9 KO qui présentaient des niveaux d’expression de HOXA9 réduites, stables ou en hausse. La suppression hétérozygote du site FCCT situé entre HOXA7 et HOXA9 de gènes (limite CBS7/9) a été identifiée par génotypage basées sur la PCR. Le HOXA9-a diminué de suppression de clones #5, 6, 28 et 121 exposées à l’emplacement de limite CBS7/9 (flèches noires). (B) The Indel mutations dans le site CBS7/9 ont été analysées par la nucléase digestion dosage des clones représentatifs qui présentaient réduit (ligne rouge), inchangé (ligne bleue), ou augmenté les niveaux d’expression HOXA9 (ligne violette). Le HOXA9-a diminué de clones #5, 6, 28 et 121 présenté des mutations à l’emplacement de limite CBS7/9 (flèches orange). Ce chiffre a été modifié par Luo et al.12. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Tableau 1 : sgRNAs poule informations de bibliothèque de ciblage. Ces données sont de Luo et al.12. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Sanger séquençage de résultats de sgRNAs présenté dans les sélectionnés HOXA9 -a diminué, HOXA9 -inchangé, et HOXA9 -a augmenté de clones. HOXA9-une diminution, inchangées et ont augmenté de clones sont surlignés en rouge, bleu et violet, séparément. Ces données sont de Luo et al.12. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Les gènes codant pour des protéines liées sgRNA bibliothèques ont été appliquées dans un système de dépistage fonctionnelle à l’identification des gènes et des réseaux de régulation des fonctions cellulaires spécifiques par le biais de sgRNA enrichissement24,25,26 ,27,28. Plusieurs région non codante associés sgRNA bibliothèques apparaissaient également dans les écrans fonctionnels de gène-spécifique pour distale et proximale de réglementer les éléments, y compris BCL11A, Tdgf1a et la résistance aux médicaments régulation des gènes28, 29,30. Ces bibliothèques de sgRNA ont été tous générés par un bio-informatique détaillée conception, synthèse d’oligonucléotide et clonage sous l’oligonucléotide piscine (s) dans des vecteurs. L’examen préalable du génome entier est très puissante et utile mais a besoin de compétences informatiques pour génome sgRNA conception et financement cohérent pour la synthèse cher ; ainsi, il est toujours difficile pour la plupart des laboratoires. Cependant, notre bibliothèque de locus spécifique sgRNA approche de dépistage est pratique et efficace pour identifier l’élément d’ADN spécifique tels que le site de liaison FCCT impliqué dans l’organisation de la chromatine et la régulation de la transcription (Figure 1 et la Figure 2). En ciblant les limites de la FCCT, nous avons appliqué une RT-PCR en une étape pour évaluer des clones de sgRNA ciblée selon le niveau d’expression d’un gène marqueur spécifique, HOXA9. En outre, nous avons effectué Sanger séquençage pour confirmer ces clones positifs sgRNAs intégré (Figure 2 et Figure 4). Pour fonctionnellement confirmer que ces sgRNAs positifs ciblés de clones, nous avons effectué un PCR génotypage et mutation detection test afin de déterminer si le sgRNA induit les cible site insertion ou suppression des mutations (Figure 5). Cela nous donne une méthode prometteuse pour cibler des éléments d’ADN non codant spécifiques et évaluer leur fonction biologique dans les cellules de mammifères.

Dans notre protocole, nous avons mentionné qu’une conception d’oligonucléotides spécifiques aux assurera plus efficace sous clonage dans des vecteurs de lentiCRIPSRV2 et plus fiable de générer une bibliothèque de sgRNA précis (étapes 1 – 2). Afin d’obtenir le lentivirus de bibliothèque de sgRNA de titre élevé, le surnageant des gènes devrait être concentré 50 fois en utilisant le concentrateur suivant le protocole (étape 3) et stocké dans un congélateur à-80 ° C dans plusieurs parties aliquotes (étapes 3.1 à 3.5). Un autre sujet de préoccupation est de trouver la valeur optimale de MOI pour la transduction. Si le MOI est trop faible, le nombre de cellules infectées va diminuer et conduire à sgRNA échec de dépistage. Si le MOI est trop élevé, il intégrera plus d’un sgRNA dans une seule cellule, et il n’interférera pas avec la bibliothèque sgRNA de dépistage par l’intermédiaire du RT-PCR en une étape et détection de mutations Indel. Par conséquent, avant la projection, trouver l’intérieur optimal pour chaque groupe de cellules par titrage de la bibliothèque des gènes est une étape importante. Titrage de la bibliothèque des gènes dans les cellules de la leucémie de MOLM13 et d’évaluation du ministère de l’intérieur seront effectuera dans le protocole (étapes 5.1 – 5.10). En outre, une lyse complète de cellules pour la transcription inverse peut assurer une étape réussie de RT-PCR. Cela peut être fait en augmentant le temps d’incubation pour la lyse à tous les stades de la température dans le protocole (étapes 7,5 – 7,6). Par conséquent, afin d’améliorer le plus efficace pour le dépistage de la bibliothèque CRISPR-Cas9 KO regroupée, cellule approfondie lyse et la transcriptase inverse jouent un rôle déterminant dans la seule étape RT-qPCR (étapes 7.1 – 7.14). En outre, améliorant la qualité des produits PCR peut assurer succès indel détection de mutations, parce que les produits de PCR de moindre qualité aura une incidence sur le processus de génération hétéroduplex/homoduplex (étapes 9.1 –.6).

En outre, la méthode peut servir à identifier le rôle de la FCCT dans la régulation des gènes HOX dans le début du développement embryonnaire et certaines leucémies avec signature de gène HOX aberrante. Par exemple, les gènes HOX jouent un rôle crucial durant le développement embryonnaire et tous quatre grappes de gens HOX sont temporellement et spatialement limités dans leurs profils d’expression dans le développement embryonnaire. En outre, des mutations NPM1 sont parmi le plus courante anomalie génétique dans AML et représentent 30 % des patients AML avec caryotype cytogénétique normale31. Ce sous-ensemble d’AML exhibe une aberrante HOXA et HOXB gène signature, qui devient un mécanisme dominant de transformation leucémique17. Il est essentiel d’élucider comment les gènes HOX sont réglementées dans développement normal et dysrégulation au cours de la leucémogenèse. Nous et autres avons montré que le FCCT joue un rôle essentiel dans la transcription de la chromatine organisation et gène HOX locus9,12. Ainsi, le criblage de HOX locus axés sgRNA fournit un moyen pratique d’empêtrer la fonction spécifique du site de fixation FCCT dans la régulation des gènes HOX lors du développement et des malignités hématopoïétiques. Toutefois, une limitation de l’approche est la difficulté de trouver un marqueur utile pour le séquençage de nouvelle génération haut débit. Un des objectifs des recherches futures sera de trouver un marqueur très sélectif et réaliser le séquençage de génération suivant de génome-large afin de pouvoir constater les effets du marqueur. Par conséquent, à l’aide d’un gène spécifique de tag de marqueur fluorescent comme le journaliste suivi deviendra un outil essentiel à l’avenir plans de recherche.

Exhausteurs de jouent une multitude de rôles essentiels dans la régulation de l’expression de fonction et gène promoteur. Toutefois, il peut aussi activer activité de promoteur de longue distance d’une manière indépendante position et l’orientation, et exhausteurs souvent régulent l’expression de gène dans une orientation trans . Ainsi, il est difficile de repérer l’enhancer(s) de gènes spécifiques, en particulier dans l’ère post-génomique. Dosages de journaliste traditionnel et corrélatifs analyses fonctionnelles (par exemple, immunoprécipitation de la chromatine et DNase i essais hypersensibles) ont servi à examiner enhancer fonction32,33. De même, petites échelle axés sur le locus projections ont été également appliquées pour découvrir les activités de distales et proximales des éléments régulateurs des gènes spécifiques,34. Récemment, la stratégie de bibliothèque groupés sgRNA-KO qui cible avec succès les éléments régulateurs non codantes dans les locus du gène HOX identifié un site de liaison FCCT situé entre les gènes HOXA7 et HOXA9 , ainsi qu’un lncRNA HOTTIP C’est critique pour le contrôle postérieure organisation de domaine chromatine HOXA , qui entraîne l’expression du gène HOXA ectopique dans la leucémie myéloïde aiguë (LMA)12. Ces études ont montré que le criblage de pool sgRNA-KO est aussi une approche puissante génétique pour identifier et évaluer la fonction biologique des éléments non codantes dans notre génome in situ.

FCCT, comme une protéine d’isolateur de la chromatine, joue un rôle important dans l’organisation du génome en définissant des quartiers de la chromatine des profils d’expression génique spécifique dans la cellule spécifique type11,35. Altération de la structure de domaine topologiquement associé (TAD) modifie les interactions enhancer/promoteur, ce qui entraîne un état malade5,11. FCCT est hautement conservée chez les métazoaires et est enrichie aux limites de la TAD. Toutefois, on ignore si et comment FCCT contribue au maintien de la structure de la chromatine limite et formation de TAD. Bien que la mise en commun FCCT sgRNA-knockout criblage ait porté sur les quatre loci HOX , il s’est avéré être une méthode efficace pour identifier et disséquer les limites de la FCCT et définir domaine TAD comme interaction enhancer/promoteur et transcription dans le domaine TAD12. En outre, cette méthode peut être appliquée efficacement afin d’identifier les éléments lncRNA et les facteurs de transcription qui médient la conformation de la chromatine et l’activité de l’accessibilité en loci HOX . Nous essayons également d’explorer la lithothèque CRISPR/sgRNA contenant les sites de FCCT génome-large par le biais de prochaine génération séquençage l’identification le FCCT ChIP-seq et données Clerbois-PET à l’avenir de la recherche. Par conséquent, cette stratégie peut être étendue à un chromosome entier ou même l’ensemble du génome.

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Disclosures

Nous n’avons aucun conflit d’intérêt concernant ce rapport.

Acknowledgments

Les auteurs remercient également Nicholas Cesari pour l’édition du manuscrit. Le travail a été soutenu par des subventions du National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine 3000 reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Proteinase K Thermo Fisher Scientific 25530049
Puromycin Thermo Fisher Scientific A1113802
Stbl3 cells  Life Technologies  C737303
HEK293T ATCC CRL-3216
MOLM-13 DSMZ ACC 554
lentiCRISPRv2 Addgene 52961
pMD2.G Addgene 12259
psPAX2 Addgene 12260
pGEM®-T Easy Vector Systems  Promega A137A
T4 ligase  New England Biolabs  M0202S
QIAquick Gel Extract kit QIAGEN 28706
QIAuick PCR purification kit QIAGEN 28106
SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit Bio-Rad Laboratories 1725095
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12163
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Thermo Fisher Scientific  11965084
RPMI 1640  Thermo Fisher Scientific 11875093
Fetal bovine serum (FBS)  Thermo Fisher Scientific 10-082-147
Penicillin/streptomycin/L-glutamine  Life Technologies  10378016
Lenti-X Concentrator  Clontech 631232
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific 15250061
Polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Genessee Scientific  25-507
TAE buffer  Thermo Fisher Scientific  FERB49
Surveyor® Mutation Detection Kits Integrated DNA Technologies 706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc System Bio-Rad 170-8126
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5404000138
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Fisher Scientific 88870002
TSX Series Ultra-Low Freezers Thermo Fisher Scientific TSX40086V
Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3308
Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 51022484
Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series Thermo Fisher Scientific 75004506
Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths Thermo Fisher Scientific FSGPD02
Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems Thermo Fisher Scientific 13-762-353
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855195
MiniAmp™ Thermal Cycler Applied Biosystems technology A37834
Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply Thermo Fisher Scientific 7217581
Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fisher Scientific 09-528-178
VWR® Tube Rotator and Rotisseries VWR International 10136-084
VWR® Incubating Mini Shaker VWR International 12620-942
Analytical Balance MS104TS/00 METTLER TOLEDO 30133522
DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer DeNovix Inc. DS-11 FX

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Numéro 145 CRISPR/Cas9 sgRNA criblage limite FCCT génétique loci HOX en une seule étape RT-qPCR détection de mutations Indel leucémie myéloïde aiguë
<em>HOX</em> Locus Focused CRISPR/sgRNA bibliothèque préalable identifier critique FCCT limites
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Luo, H., Sobh, A., Vulpe, C. D., Brewer, E., Dovat, S., Qiu, Y., Huang, S. HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries. J. Vis. Exp. (145), e59382, doi:10.3791/59382 (2019).

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