Summary
臨床線形加速器は、癌細胞に対する幅広い線量率の生物学的効果を決定するために使用することができる。細胞系アッセイおよびがん幹様細胞の線形加速器を設定する方法について、懸濁液中の腫瘍球として増殖し、付着培養培養物として成長した細胞株について議論する。
Abstract
放射線療法は、がん管理の基礎の一つです。ほとんどの癌では、腫瘍を解体する最も効果的な非外科的治療です。ここでは、線形加速器で癌細胞を照射する方法について説明する。線形加速器技術の進歩により、放射線治療の精度と効率が向上しました。広範囲の放射線量と線量率の生物学的影響は、引き続き調査の激しい領域です。線形加速器の使用は、臨床的に関連する用量および線量率を使用してこれらの研究を容易にすることができる。
Introduction
放射線療法は、多くのタイプの癌1、2、3、4に対する効果的な治療法である。超高線量照射は放射線治療において比較的新しく、線形加速器5の最近の技術進歩によって可能にされる。標準的な線量率の照射に対する余分高い線量率の臨床利点は、治療時間の短縮および改善された患者経験を含む。線形加速器はまた、細胞培養ベースの放射線生物学研究のための臨床設定を提供します。放射線量と線量率の生物学的および治療的な意味合いは、放射線腫瘍学者および生物学者の関心の焦点となってきた6,7,8.しかし、超高線量照射とフラッシュ照射の放射線生物学(放射線量が非常に高い)は、まだ徹底的に調査されていない。
ガンマ線照射は、細胞培養ベースの放射線生物学9、10、11で広く使用されている。放射線は、放射性同位元素源の崩壊から放出されるガンマ線(典型的にはセシウム-137)によって達成される。放射性物質の使用は非常に規制されており、しばしば制限されています。ソースベースの照射では、広範囲の線量率を試験することは困難であり、臨床的達成可能用量率12の生物学的効果の分析におけるその有用性を制限する。
用量と線量率の効果の両方を示すいくつかの研究があります12,13,14,15,16,17.これらの研究では、放射性同位元素から発生するガンマ照射と、線形加速器から発生するX線の両方を用いた。肺癌、子宮頸癌、神経膠芽腫、黒色腫を表す様々な細胞株が用いられた。細胞生存、細胞周期停止、アポトーシスおよびDNA損傷に対する放射線影響は、読み出し12、13、14、15、16、17として評価された。.ここでは、線形加速器を用いてX線系放射線を送送ることによって、臨床的に関連する放射線量と線量率の生物学的効果を定義する方法について述べた。これらの研究は、生物学者、放射線腫瘍学者と医学物理学者の間の緊密な協力で行われるべきです。
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Protocol
1. 懸濁細胞培養のための細胞製剤
- 幹細胞培養培地中の神経膠腫様細胞を、細胞培養インキュベーター中の約5x106細胞/10cmプレートで、5%CO2、37°Cで95%相対湿度を用いて培養した。
注:細胞培養条件は、すべての手順を通じて同じです。プロトコルで使用されるメディアは完全なメディアです。 - 定期照射の2日前に、無菌5mLピペットを培養板から15mL遠心管に培養フード内の15mL遠心管に採取する。
- 集めた細胞をカウンタートップ遠心分離機で3分間200xgで遠心分離する。
- 上清を捨て、1mLのトリプシン-EDTAを室温で1mLで消化し、トリプシン-EDTAで単一細胞懸濁液を作ります。消化中に遠心管の底を2分ごとにゆっくりと振り、細胞が完全に消化されていることを確認します。
- トリプシンをクエンチするために幹細胞培養培地の3 mLを追加します(材料の表を参照)。集めた細胞をカウンタートップ遠心分離機で3分間200xgで遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを保存します。
- 5 mLの細胞培養培養培養培養で細胞を再中断し、血球計で細胞を数える。
- 10mLの細胞培養培地を含む2枚の10cmプレート中のプレート5 x 106細胞。
- スケジュールされた照射の直前に、細胞を回収し、ステップ1.3に記載されているように遠心分離後に上清を廃棄する。細胞培養培養培養の5mLで細胞ペレットを再中断する。細胞培養培地の2mLを含む35mmプレートに1mLの細胞懸濁液を移す。
注:メディアの総容積は35 mm版の3 mLであり、液体をプレートの高さ1cmにする。 - プラスチックやフォームボックスなどの二次容器にめっきされた細胞を移し、汚染のリスクを低減し、容器内の細胞をユーティリティカートの照射施設に持ち込みます。
- ステップ4に記載されているように細胞を照射する。
2. 付着細胞培養のための細胞製剤
- 照射の1日前に、細胞培養フード内で、HEK-293細胞などの付着細胞株の細胞培養プレートからDMEM培地を除去する。メディアは真空に接続されたパスツールピペットを使用して吸引することができる。
- 生殖不能PBSの5 mLで細胞を培養皿に洗浄し、残留培養物を洗い流します。
- トリプシン-EDTAのピペット1mLを培養皿に入れ、培養プレートをそっと傾けて、料理全体がトリプシン-EDTAで覆われていることを確認します。
- DMEM培地3mLのトリプシン-EDTA反応を室温で5分間試用し、培養フード内の15mL遠心管に5mLピペットで細胞を集集めます。
- 集めた細胞をカウンタートップ遠心分離機で3分間200xgで遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを保存します。
- DMEM培養体の5 mLで細胞を再中断し、血球計で細胞をカウントします。
- 3mLの細胞培養培地を用いて35mmプレート中のプレート2 x 105セルを1cmの培地の高さにする。
- 37°Cでインキュベーター中の細胞培養の24時間後、二次容器(すなわち、絶縁された泡箱)にめっきされた細胞をユーティリティカート上の照射施設に移す。
- ステップ4に記載されている細胞を照射する。
3. 照射後の免疫染色のための細胞製剤
- 一晩4°Cで氷上の市販の細胞外タンパク質マトリックスを解凍する。一晩4°Cで200 μLピペットの先端および1.5 mL遠心管の前に冷やす。
- アリコート細胞外タンパク質マトリックスは、あらかじめ冷やされたピペットチップと1.5mLの遠心管を1チューブあたり200 μLで使用します。
- 細胞培養培養培養培養培養培養の200μLの細胞外タンパク質マトリックスを希釈し、1%細胞外タンパク質マトリックス培中を作る。
- 35 mm プレートに殺菌カバースリップ (22 mm x 22 mm) を配置します。カバースリップに1%の細胞外タンパク質マトリックスメディアの400 μLを置きます。
- 35mmプレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに1時間置き、細胞外タンパク質マトリックスがカバースリップ上で重合できるようにします。
- 懸濁細胞培養を使用する場合は、ステップ1.1~1.5に記載されている単一細胞懸濁液を作る。
- 35mmプレートに置かれた細胞外タンパク質マトリックスコーティングカバースリップ上のプレート5 x 104細胞。めっきされた細胞を一晩細胞培養インキュベーターに戻し、細胞がタンパク質マトリックスによって支持されることを確認する。プレート内のメディアの総体積は、培養皿でメディアの高さが1cmに達するように3 mLでなければなりません。
- 10倍の倍率対物レンズで明視野顕微鏡下の細胞を観察します。セルは、浮遊するのではなく、カバースリップ上に広がる必要があります。メッキされた細胞を含む培養皿を、発泡箱などの二次容器にユーティリティカート上の照射施設に移し、ステップ4に記載の通り細胞を照射する。
- 付着した細胞培養物(例えば、HEK-293細胞)を使用する場合、ステップ2.1〜2.6に記載の細胞を消化する。照射の1日前に35mmプレートの無菌カバースリップに5 x 104細胞を置き、ステップ3.9のように顕微鏡下で観察して、細胞がカバースリップ表面に完全に取り付けられていることを確認します。DMEMメディアの3 mLを使用して、プレートの高さ1cmの液体を作ります。
- カバー上の細胞を一晩または1日まで成長させた後、二次容器にめっきされた細胞を含む培養皿を照射施設に移す。ユーティリティカートは、こぼれのリスクを減らすために使用できます。ステップ4に記載されている細胞を照射する。
4. 線形加速器(LINAC)での照射
- LINACのコンソールソフトウェアを使用して、アクセラレータガントリーとコリメーターを0°に設定し、XとYの顎を対称20 x 20 cm2フィールドサイズに開き、マルチリーフコリメーター(MLC)が存在する場合は引き込みます。
注:LINACは、非常に高い線量率を可能にする、フラット化フィルタフリー(FFF)モードを持つことができます。名前が示唆するように、この放射線は均一ではない(平坦)、高線量率はビームの中心でのみ達成される。この場合、7 x 7 cm2フィールドが使用されます。 - 処理ソファに少なくとも5cmの水同等の材料を置きます。400 MU/min(標準線量率)で照射するセル皿を水同等材料に置き、LINACクロスヘアの中央に配置します。
- 6 MV X線ビームで最大用量の深さで照射される細胞を置き、約1.5センチメートル、皿の上に水同等の材料の追加1cmを置きます。細胞が懸濁される培地の1cmと組み合わせることで、これは1.5センチメートルの平均深さで細胞を置きます。
- LINAC の先頭に前面ポインターを貼り付します。前面ポインターがビルドアップ マテリアルのサーフェスに接触するまで延長し、距離をメモします。ソースからビルドアップ サーフェスまでの距離が 100 cm になるまで、テーブルの高さを調整します。
注:距離は光学距離インジケーターで確認できます。あるいは、光距離インジケーターは、フロントポインタの代わりに、ソースを100cmに蓄積する表面を設定するために使用されてもよい。 - 適切な数のモニターユニット(MU)を計算して、細胞に所望の放射線量を伝え、400 MU/minで配信するように加速器をプログラムします。
注:最大線量の深さで1 cGy/MUを提供するために校正されたLINAC上のソースから表面距離(SSD)の設定では、必要なモニターユニット数はMU =用量(cGy)/(1 cGy/MU)/OF(20x20)を使用して計算され、OFは出力係数を表します。この計算は、代替キャリブレーション設定を使用して LINAC に対して変更する必要があります。 - 治療室を離れ、他のすべての個人が終了したことを確認します。部屋に他の細胞がないことをVrifify、または彼らは放射線の低用量を受け取ります。金庫室のドアを閉めて
- コンソールでフィールドサイズ、MU、MU/minを確認し、ビームを有効にします。
- より高いまたはより低い用量率で照射される細胞のためのステップ4.3-4.8を繰り返す。
- 加速器で高用量率(例えば、2100 MU/min以上)を達成するために、逆二乗法則に従って細胞への有効用量率を増加させるためにSSDを減少させる:DoseRate=用量酸塩*(100 cm /SSD_New)2。
- 低用量率(例えば、20 MU/min)の場合、ソースから表面距離(SSD_New)を増やして線量率を下げます。例えば、細胞培養皿は、治療室の床に置いてもよい。
- この設定が必要な場合は、MU = 用量(cGy/MU) / (1 cGy/MU) / OF(20x20)/ (100 cm / SSD_New)2を使用して、アクセラレータのモニターユニット設定を再計算します。MU 計算の詳細については、マクダーモットとオートン18のリファレンスを参照してください。
- 用量レート(Gy/Min)=用量(Gy)*(MU/min)/MUでGy/分の線量率を決定します。例えば、400 MU/minで配信される4 Gyは380 MUを必要とするので、4*400/380 = 4.2 Gy/minです。表 1を参照してください。
図 1:線形加速器上の細胞培養皿のセットアップ。(A) 臨床的線形加速器が示されている。(B)5cmの水同等物が処理ソファに置かれる。(C) 細胞培養皿を材料の表面に置く。(D) 皿は、正方形の光フィールドによって示される処理分野の加速器十字線を使用して中央に配置されます。(E)1cmの水同等物は、細胞培養皿の上に置かれる。光距離インジケータ(F、G)またはフロントポインタ(H,I)を使用して、ソースから表面距離(SSD)をチェックします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
5. 照射後の生物学的アッセイ
- 照射後、上記と同様の方法で細胞培養インキュベーターに細胞を戻す(ステップ1.9、2.8および3.10)。
- 必要に応じて、研究プロジェクトに合わせてさまざまな生物学的アッセイを調整します。
注:ここで、照射後の生物学的アッセイの一例として代表的な細胞周期分析16を示す。
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Representative Results
線形加速器による標準線量速度および超高線量照射の細胞周期効果を調べるために、このプロトコルを用いてグリオーマ幹細胞の3つのサンプルを調製し、照射後24時間を採取した17:1つの対照試料照射されなかったもの(図2A)、400 MU/min(モニターユニット、4.2 Gy/min標準線量率、図2B)を4Gyに照射した1つのサンプル、および2100 MU/min(21.2 Gy/minの超高線量量率)を照射した別のサンプル、図 2C)から4 Gyへ。細胞周期プロファイルは、細胞周期の異なる段階における細胞のパーセンテージとともに表示されます。
図 2:線形加速器の4Gy照射後の細胞周期解析の例。G2細胞周期停止は、標準用量率(400 MU/min)または超高用量率(2100MU/min)(C)を非照射対照細胞(A)と比較してグリオーマ幹細胞を照射した後に観察された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 線量率 (MU/分) | SSD (CM) | エネルギー | Mu |
| 20歳 | 250名 | 6倍 | 2380* |
| 400人 | 100人 | 6倍 | 390* |
| 2100年 | 80歳 | 6FFF | 260* |
表1:実験で使用される線量率の設定,4Gy用量を想定する。MUは、他の必要な用量のために直線的にスケーリングすることができます。*これらは、使用した LINAC の例 MU です。MU は、上記の式を使用して、ユーザー固有の LINAC に対して計算する必要があります。
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Discussion
放射線療法はがん管理の不可欠な部分です。放射線治療の有効性と効率性の向上に向けた取り組みが進んでいます。線形加速器技術の進歩は前例のない正確さおよび安全の患者を扱う機会を提供した。ほとんどの患者は線形加速器からの高エネルギーX線で治療されるため、線形加速器に対して行われる広範囲の線量率の生物学的効果を調べる研究は、患者に容易に適用される可能性がある。放射線生物学の研究に線形加速器を適用するいくつかの報告がありましたが、結果は混合され、追加の研究が必要です13,14,15,16,19.
線形加速器は、所定の用量が送達された後にX線が生成されないという意味で比較的安全である。これは、放射線が絶えず放出される放射性同位体とは対照的です。さらに、線形加速器を使用して放射線を提供すると、広範囲の線量および線量率でターゲット体積の形状を制御するための高度なビーム配置を使用できます。この方法の欠点は、線形加速器の入手可能性が患者の使用のために制限され、したがって、臨床医や医学物理学者との高度な計画を必要とするということです。
我々のプロトコルでは、細胞の照射のための基本的な手順を説明する。この方法は、他の研究ニーズを満たすために調整することができます。例えば、併用化学療法と放射線療法の効果を調べるための薬物治療と組み合わせることができる。この方法を特定の細胞株または放射線に続くアッセイに適用する場合、いくつかの変更が期待される必要があります。例えば、照射後のバイオマーカーの早期変化を調べるために、照射後すぐに細胞を採取してもよい。
送達される用量はビームエネルギーに依存し、堆積された用量は浸透の深さの関数として変化するので、所望の用量を達成するために必要な媒体および水同等のボーラスの量は重要である。上述の方法では、単一の前部後梁に6つのMV光子を使用し、培養皿の高さが1cmであることを確認する。細胞培養皿の上に1cmの水同等物を加えて細胞に線量を蓄積します。非常に高い線量率を達成するために、我々は細胞が置かれるソファを上げる。ソファを上げると畑の大きさが小さくなるので、35mmの培養皿を使用し、光原で区切られた照射場内に皿全体が入っていることを確認します。低線量率を達成するために、我々は、治療ソファを下げるか、表面距離にソースを増加させるために部屋の床に細胞培養皿を配置します。より複雑な動物の治療分野の設計は、この記事の範囲を超えています。ここで説明する技術は、懸濁液で成長したり、皿に付着した細胞株を用いて生物学的アッセイに線形加速器を使用する方法を理解する研究者を支援します。生物学者、臨床医、医学物理学者の間の緊密な協力は放射線研究の成功の実行を保障する。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
我々は、線形加速器の使用のための放射線腫瘍学のクリーブランドクリニック部門に感謝します。私たちは、グリオーマ幹細胞の寛大な贈り物のためにジェレミー・リッチ博士に感謝します。この研究は、クリーブランドクリニックによってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| glioma stem-like cell 387 | gift from Dr. Jeremy Rich | ||
| 293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| neuron stem cell culture media | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | NeurobasalTM media |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Recombinant Human EGF Protein | R&D Systems | 236-EG-01M | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 4114-TC-01M | |
| B-27™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030164 | |
| Tripsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | |
| extracellular proten matrix | Corning | 354277 | MatrigelTM |
| Ethanol | Fisher chemical | A4094 | |
| Equipment | |||
| 10 cm cell culture dish | Denville | T1110 | |
| 3.5 cm cell culture dish | USA Scientific Inc. | CC7682-3340 | |
| 22x22mm glass cover slip | electron microscopy sciences | 72210-10 | |
| 15 ml centrifuge tube | Thomas Scientific | 1159M36 | |
| 50 ml centrifuge tube | Thomas Scientific | 1158R10 | |
| 5 ml Pipette | Fisher Scientific | 14-955-233 | |
| pipet aid | Fisher Scientific | 13-681-06 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Linear Accelerator | Varian | n/a | |
| water equivalent material | Sun Nuclear corporation | 557 | Solid waterTM |
| Reagent preparation | |||
| DMEM media | 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 units/mL penicillin G, 100 µg/mL streptomycin in 500 ml DMEM media | ||
| stem cell culture media | 10 ml B27 supplement, 20 µg hFGF, 20 µg hEGF, 2 mM L-glutamine, 100 units/mL penicillin G, 100 µg/mL streptomycin in 500 ml Neurobasal media |
References
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