Summary
We beschrijven een nieuw gang analysesysteem, Paw-Print analyse van contrast-Enhanced opnames (Prancer), een Open-Access geautomatiseerd systeem voor de kwantificering van gang karakteristieken bij ratten die een roman semi-transparante vloer gebruikt om automatisch Kwantificeer Gait. Dit systeem werd gevalideerd met behulp van het Haloperidol-model van de ziekte van Parkinson.
Abstract
Gait-analyse wordt gebruikt voor het kwantificeren van veranderingen in de motorische functie in veel knaagdieren modellen van de ziekte. Ondanks het belang van het beoordelen van de gang en de motorische functie op veel onderzoeksgebieden, hebben de beschikbare commerciële opties verschillende beperkingen, zoals hoge kosten en gebrek aan toegankelijke, open code. Om deze problemen aan te pakken, ontwikkelden we PrAnCER, Paw-Print analyse van contrast-Enhanced opnames, voor geautomatiseerde kwantificering van Gait. De contrast-verbeterde opnames worden geproduceerd door gebruik te maken van een doorschijnende vloer die objecten die niet in aanraking komen met het oppervlak verduisteren, waardoor de poot van de rat tijdens het wandelen effectief wordt geïsoleerd. Met behulp van deze Video's, onze eenvoudige softwareprogramma betrouwbaar meet een verscheidenheid van spatiotemporele gang parameters. Om aan te tonen dat PrAnCER nauwkeurig veranderingen in de motorische functie kan detecteren, hebben we een Haloperidol-model van de ziekte van Parkinson (PD) gebruikt. We testten ratten bij twee doses Haloperidol: hoge dosis (0,30 mg/kg) en lage dosis (0,15 mg/kg). Haloperidol aanzienlijk toegenomen houding duur en Hind paw contactgebied in de lage dosis voorwaarde, zoals kan worden verwacht in een PD-model. In de hoge doserings toestand vonden we een vergelijkbare toename van het contactgebied, maar ook een onverwachte toename van de paslengte. Met verder onderzoek vonden we dat deze verhoogde staplengte consistent is met het bracing-Escape-fenomeen dat vaak wordt waargenomen bij hogere doseringen van Haloperidol. Dus, Prancer was in staat om zowel verwachte als onverwachte veranderingen in de gang patronen van knaagdieren te detecteren. Daarnaast hebben we bevestigd dat PrAnCER consistent en nauwkeurig is in vergelijking met handmatige scoring van parameters.
Introduction
Knaagdieren worden vaak gebruikt als modellen om een breed scala aan ziekten en verwondingen te bestuderen, waaronder artritis1, de ziekte van Parkinson (PD)2,3, neuromusculaire aandoeningen4,5, Hydrocefalus6 en ruggenmergletsel7. In deze omstandigheden kunnen symptomen zoals pijn, balans en motorische functie worden gemeten door de gang-patronen van de dieren te bestuderen. Deze patronen worden gekwantificeerd met behulp van een set spatiotemporele gang parameters die de locatie en timing van paw prints evenals het gebied van paw contact op de grond samenvatten.
Hoewel er veel opties voor analyse van de gang bestaan, hebben de huidige systemen verschillende nadelen. Bij traditionele inkt-en papier tests worden de poten van een dier bedekt met inkt voordat het over een vel wit papier loopt (Figuur 1a). De resulterende paw prints kunnen vervolgens worden gemeten voor staplengte en Stance breedte, maar belangrijke temporele gang parameters zoals snelheid of stap duur kan niet worden beoordeeld. Moderne video-gebaseerde systemen zijn betrouwbaarder, maar video analyse vereist bewerkelijk frame-voor-frame scoring, tenzij een geschikt geautomatiseerd systeem wordt gebruikt8. Er zijn veel commerciële geautomatiseerde scoring systemen momenteel beschikbaar, maar deze systemen kunnen buitensporig duur zijn. Daarnaast zijn deze systemen afhankelijk van heldere vloeren of in sommige gevallen, loopbanden, die beide de natuurlijke beweging veranderen. Loopbanden hebben aangetoond dat ze de motorische tekorten in sommige ziekte modellen9maskeren, terwijl heldere vloeren (Figuur 1b) ervoor zorgt dat muizen meer tijd besteden aan de omtrek van een open veld, wat duidt op verhoogde angst10. Idealiter zou een gang-analyseapparaat niet afhankelijk zijn van ofwel de meest natuurlijke bewegingspatronen produceren met de minste stress voor het dier.
Beschikbare open-source en commerciële opties gebruiken een verscheidenheid aan methoden om de moeilijkheid te overwinnen van het isoleren van een voetafdruk uit het lichaam van het dier, ondanks variabele lichtomstandigheden, dierlijke kleur en print vormen. Sommige versterken het contrast van het contact met poten met behulp van oppervlakken die licht vrijgeven als reactie op druk7,11,12, maar deze zijn duur en technisch moeilijk te construeren. Andere systemen maken gebruik van meerdere kijkhoeken, die de observatie van de coördinatie van het hele lichaam op8,13toelaten. Hoewel deze opties voordelen bieden voor het meten van extra motorparameters buiten gang, zijn ze onnodig complex voor eenvoudige analyse van de gang. Verder vertrouwen al deze technieken op een heldere vloer, die het natuurlijke gedrag verandert.
PrAnCER is gebaseerd op wat we contrast-Enhanced opnames noemen, die een combinatie van verlichting en een semi-transparante vloer gebruiken om de detectie van prints te verbeteren. Dit maakt een afbeelding met een hoog contrast (Paw Print), waarbij de weergave van objecten die niet in aanraking komen met het oppervlak (het lichaam van het dier) wordt verduisteren (figuur 1d). Wanneer bekeken van bovenaf, de vloer lijkt ondoorzichtig. De resulterende Salience van de poten in onze methode maakt een nauwkeurige identificatie mogelijk van een verscheidenheid aan loop-en bewegings eigenschappen door ons nieuw ontwikkelde geautomatiseerde systeem. In de huidige studie beschrijven we het apparaat, ons gang-analyse protocol en ons geautomatiseerde scorings systeem, Prancer. Ons apparaat is eenvoudig te monteren en PrAnCER kan worden gebruikt om motorische tekorten te beoordelen in een breed scala van ziekte-en letsel modellen.
Om aan te tonen dat PrAnCER kan worden gebruikt om abnormale gang patronen te detecteren, gebruikten we een Haloperidol model van PD, een eenvoudig model voor voorbijgaande inductie van motorische veranderingen14. Haloperidol is een dopamine receptor antagonist die op grote schaal wordt gebruikt als een antipsychoticum1. Het beïnvloedt motorsystemen door het veranderen van dopamine signalering in het striatum, een belangrijk onderdeel van de motorische route in de basale ganglia14. Zelfs een enkele dosis Haloperidol vermindert snel extracellulaire dopamine spiegels in het striatum, waardoor Parkinsoniaanse motor ontlasting15. De gedragseffecten zijn spierstijfheid, Akinesie en catalepsy, die wordt gedefinieerd als een onvermogen om terug te keren naar een normale houding na te zijn geplaatst in een ongewone positie11,16. Acute doses Haloperidol veroorzaken motorische tekorten die identificeerbaar zijn in de rotarod test van de motorische functie17. We redeneerde dat Haloperidol-bemiddelde motorische beperkingen ook duidelijk zouden zijn in een aantal kenmerken die toegankelijk zijn voor geautomatiseerde analyse van de gang.
Hoewel de reacties op Haloperidol sterk verschillen in studies, ontstaan de cataleptische effecten van Haloperidol bij doses van 0,5 mg/kg en hoger, terwijl verminderde responsiviteit en motorische stoornissen bij lagere doseringen aantoonbaar zijn (0,1-0,3 mg/kg)16, 17. in een poging om de cataleptic effecten van Haloperidol te vermijden, hebben we besloten om twee doses Haloperidol te testen: een hoge dosis (0,30 mg/kg) en een lage dosis (0,15 mg/kg). Zoals weergegeven in tabel 1, onderzocht experiment 1 de effecten van de hoge dosis Haloperidol, terwijl experiment 2 de effecten van lage dosis Haloperidol testte. We gebruikten een binnen-onderwerp ontwerp waarin elke rat werd getest in de hoge dosis, lage dosis, en controle (fysiologische) voorwaarden. De volgorde van de aandoening was tegen de ratten tegenverdeeld. We voorspelden dat acute toediening van Haloperidol een gang-beperking zou veroorzaken die vergelijkbaar is met die in andere modellen van PD, zoals verminderde snelheid, verminderde lengte van de stap en langere koers duur3,14,18 ,19. We waargenomen gedragsveranderingen met inbegrip van Akinesie na Haloperidol administratie bij beide doseringen. In de lage dosis voorwaarde, ratten hadden significant toegenomen Stance duur en Hind paw contactgebied, zoals verwacht. Deze veranderingen in de gang zijn vergelijkbaar met de langzame, schuikende stappen die gebruikelijk zijn bij PD-patiënten2,20. In de hoge dosis toestand zagen we echter een toename van de paslengte en een toename van het Paw contactgebied. Hoewel de toename van de paslengte onverwacht was, gaf verder onderzoek van de literatuur aan dat het waarschijnlijk deel uitmaakt van een Haloperidol-geïnduceerde bracing-Escape Response. We concluderen dat Prancer is inderdaad geschikt voor het opsporen van Parkinsonian-achtige veranderingen in knaagdieren gang consistent met het gebruik van neuroleptica.
Protocol
Alle procedures waren in overeenstemming met de richtlijnen voor de institutionele Dierenzorg-en gebruiks Commissie van Brown University.
1. apparatuur voor het analyseren van gangen
- Bereid de gang analyse loopbrug bestaande uit een afgesloten voetpad met een heldere plexiglas (36 "L x 3" W x 4,5 "H) op een heldere plexiglas vloer (Figuur 2a). Maak de plexiglas vloer semi-doorzichtig door het te bedekken met een stuk van 16 LB katoen Fiber redactie vellum knippen tot dezelfde breedte als de loopbrug.
Opmerking: er zijn andere methoden voor het maken van de vloer semitransparent. - Plaats een camera met een framesnelheid van ten minste 30 frames per seconde (fps) direct onder de loopbrug om het midden van het spoor vast te leggen (Figuur 2b).
- Beveilig een strook van 12 V LED-lampjes met 18 LEDs/voet ongeveer 2 inches afstand van en 1 inch boven de vloer van de loopbrug om de baan te verlichten.
2. voorbereiding van dieren
- Laat de dieren gedurende ten minste 1 week voorafgaand aan de behandeling aan de Vivarium acclimeren. Behandel de ratten gedurende ten minste 5 dagen voorafgaand aan het begin van het experiment. Deze studie gebruikt 8 mannelijke Long Evans ratten ongeveer 3 maanden oud.
-
Wennen de dieren aan de testkamer en gang loopbrug met de verlichting van de kamer uitgeschakeld
- Plaats de huis kooi van de rat op het oppervlakte niveau aan het einde van de loopbrug om als doel doos te dienen. Houd er rekening mee dat als de thuis kooi diep is, verouderde of motorische verstoorde ratten baat kunnen hebben bij een helling of stap om gemakkelijker toegang te krijgen tot de huis kooi.
- Laat de rat lopen van de hand van de experimenteerder door de lengte van de loopbrug om zijn huis kooi te bereiken.
- Ratten zullen vaak stoppen aan het einde van de loopbrug om rond te kijken voordat ze naar beneden springen in de huis kooi. Als een rat langer dan 1 minuut duurt om de loopbrug af te sluiten, moedig hem dan aan om zijn huis kooi in te voeren met een zachte duw.
- Als de rat draait, gebruik dan een klein stukje plexiglas om het "Start" einde van de loopbrug te blokkeren. Herhaal dit voor een totaal van 3 runs.
- Gewennen gedurende ten minste 2 dagen of totdat de ratten zijn comfortabel oversteken van de loopbrug in een gestaag tempo zonder bevriezing.
3. testprocedure voor gangen
- Pas de instellingen op de webcam software aan om het duidelijkste beeld van de paw prints te bereiken. Schakel kamer verlichting uit voor alle gang testen.
- Noteer elke run afzonderlijk en label op de juiste manier voor gebruik met het geautomatiseerde analyseprogramma.
- Zorg ervoor dat er geen vlekken of vuil op de vellum zitten. Begin een paar seconden voordat de rat de loopbrug binnenkomt en stop zodra de rat de loopbrug verlaat en zijn huis kooi binnenkomt.
- Ga door totdat drie acceptabele runs zijn voltooid of 10 min is verstreken.
- Veeg de loopbrug af met ethanol tussen elke rat en vervang het vellum indien nodig.
Opmerking: een acceptabele proef wordt gedefinieerd als één waarin het dier consistent en zonder onderbreking loopt voor de eerste 4 stappen van de run. Als dit moeilijk te bereiken is, past u de criteria aan om proefversies op te nemen waarin er 4 opeenvolgende stappen zijn op elk punt in de uitvoering die plaatsvinden zonder pauzes of abrupte versnelling.
4. PrAnCER geautomatiseerde analyse
- Zet alle Video's om te worden geanalyseerd in een map.
- Start PrAnCER door het uitvoeren van de python script Prancer. PrAnCER zal de Video's analyseren op basis van de stappen geïllustreerd in Figuur 3 en Figuur 4.
- Selecteer in het pop-upmenu de opgegeven map door op de knop een map kiezen te drukken. Selecteer desgewenst aangepaste opties voor analyse. Gedetailleerde beschrijvingen van elke parameter u vinden door op het vraagteken ernaast te klikken. Klik op Doorgaan als u klaar bent.
- Definieer een regio van belang (ROI) op de afbeelding van de loopbrug die wordt weergegeven. Om dit te doen, klik met de linkermuisknop om een bovenrand te definiëren en klik met de rechtermuisknop om een onderrand te definiëren. Als het vakje dat wordt weergegeven juist is, drukt u op N om door te gaan. Zo niet, druk dan op Z om ongedaan te maken. Zodra N is ingedrukt, wordt het programma automatisch uitgevoerd.
- Nadat de PrAnCER is voltooid, beëindigt u het programma door op Enter in de Terminal te drukken.
- Om handmatig de resultaten uitvoer door PrAnCER te controleren, voert u het python-script Gaiteditorgui uit en selecteert u het juiste. MP4-bestand voor elke video. Corrigeer indien nodig eventuele verkeerd geïdentificeerde of samengevoegde afdrukken.
- Om te extraheren ruimtelijke en temporele gang parameters, voer de python script parameteranalyzer. Kies het aantal Hind-afdrukken dat u wilt analyseren en de map met Video's die u wilt analyseren en klik vervolgens op Doorgaan. Hiermee wordt een CSV-bestand uitgevoerd voor elke video met een aantal algemene parameters voor de gang, die worden beschreven in tabel 2 en geïllustreerd in Figuur 5.
Opmerking: de volledige scripts, evenals instructies voor het lezen en analyseren van gegevens, zijn beschikbaar op GitHub (www.github.com/hayleybounds) van de auteur. We hebben dit algoritme geïmplementeerd met behulp van de gratis, open-source Python Library OpenCV21. Ook opgenomen op de GitHub zijn instructies voor het bouwen van onze gang analyse loopbrug.
Representative Results
Haloperidol-procedure
We ontwikkelden dit gang-analysesysteem om de gang-parameters in controle ratten te vergelijken met die in experimentele ratten die naar verwachting een verscheidenheid aan motorische, gang-en evenwichtsstoornissen zouden vertonen. We gebruikten een binnen-onderwerp ontwerp waarin elke rat werd getest in de zoutoplossing, hoge dosis Haloperidol en lage dosis Haloperidol voorwaarden. Ratten werden gescheiden in twee groepen (A en B) om contra-balancing mogelijk te maken; het testen van de gangen was tegenwicht voor de tijd van de dag en de volgorde van voorwaarden. Elke test werd gescheiden door 48 h. ratten waren licht verdoofd met Isofluraan voordat ze intraperitoneale (IP) injecties van zout of Haloperidol kregen. Gait werd getest 1 h na injectie, op welk punt de Haloperidol moet op piek niveaus15,16,17.
Gedrags resultaten
We observeerden prominente gedragsveranderingen bij dieren die behandeld werden met Haloperidol. In de hoge dosis toestand hadden vijf van de acht ratten perioden van onbeweeglijkheid aan het begin van de loopbrug, waarbij ze niet reageerde op het aanraken van hen en bestand tegen verplaatsing. In sommige gevallen, deze status bleef enkele minuten totdat de rat werd verwijderd uit de loopbrug. In andere gevallen zou de immobiele rat plotseling snel bewegen of "gebonden" zijn over de loopbrug en vervolgens terugkeren naar de immobiele toestand aan het einde. In de lage doserings toestand hadden 3 van de 8 ratten vergelijkbare perioden van immobiliteit. Bij deze dosering was er slechts één exemplaar van het begrenzings gedrag. Er werd geen begrenzings waargenomen wanneer de dieren met zoutoplossing werden behandeld.
We analyseerden de effecten van Haloperidol op de volgende gang-parameters: basis van ondersteuning, stap length, stap-snelheid, koers duur, koers-naar-Swing ratio, maximaal contactgebied en interledematen afstand. Omdat veel gang parameters voor voor-en achterledematen identiek zijn en Haloperidol over het algemeen uniforme effecten heeft op alle ledematen, berekenten we parameters voor alleen de achterpoten en hebben we geen gegevens gescheiden voor linker-en rechter ledematen. Voor elke rat, we berekend het gemiddelde van elke gang parameter van alle bruikbare runs van elke testdag. Alle parameters (anders dan snelheids variabiliteit) werden berekend als het gemiddelde voor de eerste 4 bruikbare stappen van een run. Om te beoordelen of elke dosering van Haloperidol significant beïnvloed Gait, we gebruikten een gepaarde monster t-test. In experiment 1 was er een significante toename in staplengte (Figuur 6a; t (7) =-2,962, p = 0,021) en een maximaal contactgebied (Figuur 6a; t (7) =-2,51, p = 0,04) bij dieren die werden behandeld met een hoge dosis Haloperidol. Basis van ondersteuning, snelheid, Stance duur en koers-naar-Swing ratio waren niet significant. In experiment 2 vertoonden dieren die een lage dosis Haloperidol kregen een significante toename in de duur van de houding (Figuur 6b; t (7) =-2,444, p = 0,044) en het maximale contactgebied (Figuur 6b; t (7) =-3,085, p = 0,018) in vergelijking met de zoute aandoening. Geen andere gang parameters waren significant. Daarnaast was er een significant verschil tussen de hoge dosis en de lage dosis Haloperidol voorwaarden in de basis van de steun (figuur 6c; t (7) = 2,651, p = 0,033), maximaal contactgebied (figuur 6c; t (7) = 4,635, p = 0,002) en interledematen afstand ( Figuur 6C; t (7) = 3,098, p = 0,017).
Uw locatienauwkeurigheid en fouten in het geautomatiseerde systeem
Om de nauwkeurigheid van PrAnCER te beoordelen, hebben we de geautomatiseerde analyse vergeleken met de handmatige Score van 21 willekeurig geselecteerde Video's van een afzonderlijke groep van 6 controle ratten. Voor de hand scoren werden de Video's omgezet in een reeks afbeeldingen, die vervolgens werden gebruikt om de locaties van prints handmatig te markeren. Voor de efficiëntie hebben we onze analyse gericht op ruimtelijke gegevens die alleen van Hind prints zijn gemeten. We hebben de gemiddelde stap length en bos voor elke video uitgepakt en vergeleken met de geautomatiseerde waarden. Hoewel de gemiddelde staplengte niet significant verschilt tussen handmatige scoring en Prancer-analyse (figuur 7b; t (20) =-0,01, p = 0,99), was de basis van de steun significant (figuur 7A; t (20) =-2,21, p = 0,038). Hoewel de geautomatiseerde en handmatige scoring over het algemeen goed gecorreleerd was, meldde het geautomatiseerde systeem gemiddeld een 5% groter BOS. Dit verschil kan te wijten zijn aan afwijkingen in de selectie centroïde in plaats van detectiefouten. Voor het handmatig scoren, de afdruklocatie was gemarkeerd tekenen van een ovaal rond de basis van elke Hind afdrukken, omdat het moeilijk zou zijn om de methode van het middelpunt van massa schatting van de PrAnCER handmatig te repliceren. De duidelijke trend was voor de Prancer te overschatten bos, misschien omdat sommige dieren kunnen figuur hun tenen uit op een asymmetrische manier, waardoor Prancer te observeren meer extreme zwaartepunten dan handmatige scoring. Andere systemen hebben ook aanzienlijke verhogingen in BOS opgemerkt tussen handmatige en geautomatiseerde scoring ondanks consistente staplengte maatregelen17. Gezien de kleine verschillen waargenomen en de consistentie met andere systemen, concluderen we dat PrAnCER een betrouwbare meting van de parameters van de gang is.
Het is belangrijk op te merken dat alle nauwkeurigheids analyse is opgetreden na handmatige correctie van de geautomatiseerde uitvoer werd uitgevoerd met behulp van PrAnCER de GUI. Net als in bestaande commerciële systemen is deze stap noodzakelijk voor het corrigeren van fouten bij het scoren en voor het elimineren van runs die niet voldoen aan criteria22. We tuned PrAnCER naar het onzekere van de kant van valse positieven, als deze zijn gemakkelijker te corrigeren post-hoc. We hebben nooit waargenomen PrAnCER falen om een echte print te detecteren tijdens handmatige correctie van meer dan 500 Video's. Andere soorten fouten werden echter waargenomen. Deze vielen in 3 categorieën: valse detecties (detectie van een niet-print als een print), misclassificaties (afdrukken verkeerd gelabeld als voor/achterd of links/rechts), en valse combinaties (twee afdrukken onjuist samengevoegd). Deze fouten zijn gemakkelijk te corrigeren in de bijbehorende GUI, en meestal optreden in slechts een klein percentage van de Video's gefilmd onder normale omstandigheden. Zelfs met dergelijke correcties, Prancer aanzienlijk vermindert de hoeveelheid handarbeid die betrokken zijn bij de analyse van de gang. We schatten dat het voor elke video ongeveer 3 minuten duurt om PrAnCER uit te voeren en eventuele uitvoer fouten te corrigeren (indien nodig), terwijl het bijna 10 minuten duurt om dezelfde video handmatig te scoren en te analyseren.
Figuur 1. Vergelijking van de analysemethoden voor gangen. A) de traditionele inkt-en papier methode produceert onnauwkeurige afdrukken van de vorm en de plaats van de poot. (B) video-opname met een transparante vloer geeft een gedetailleerd beeld van de paw prints, maar bevat veel opvallende kenmerken van het lichaam van de rat dat de geautomatiseerde scoring compliceert. C) lichtgewicht papier over een heldere vloer creëert een lawaaierige afbeelding en verliest Details. D) het gebruik van vellum om een doorschijnende vloer te creëren produceert zeer gedetailleerde afdrukken terwijl het lichaam visueel wordt geëlimineerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Schematische illustratie van het gang apparaat en video-opname. (A) de rat loopt door een duidelijke loopbrug met een doorschijnende vloer naar het huis kooi doel vak terwijl wordt opgenomen van onderen. In dit geval bedekt het vellum een transparante vloer om het doorschijnend te maken. De loopbrug wordt verlicht door ledstrips die langs de lengte worden geplaatst op een niveau tussen de voeten en het lichaam van het dier. (B) een screenshot van een video-opname die de effecten van de doorschijnende vloer aantoont. Twee poten zijn duidelijk zichtbaar, maar het lichaam van de rat is in wezen niet detecteerbaar. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Detectieproces voor één frame van een Paw Print. A) het oorspronkelijke beeld is niet-noised en wordt vervolgens onderworpen aan achtergrond aftrekken (B). (C) een Edge-detectie algoritme wordt toegepast en de resultaten worden omgezet in een reeks X-, Y-coördinaten met de naam contouren (D). E) de contouren zijn gegroepeerd op nabijheid en de bolle romp (omsluitend kader) van de groep wordt genomen om een enkele contour te produceren die de afdruk omvat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Conversie van afzonderlijke detecties in een geclassificeerde afdruk. A) paw-afdrukken worden eerst in een set frames geïdentificeerd. (B) afzonderlijke object detecties krijgen een nummer dat hen identificeert als een afdruk, wat een enkele plaatsing van één poot (C)vertegenwoordigt. D) ten slotte worden ze geclassificeerd als links of rechts op basis van hun locatie ten opzichte van de middellijn van het pad van het dier, en de voor-of achtervoet op basis van hun locatie ten opzichte van de vorige paw-afdrukken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5. Afbeelding van de geanalyseerde parameters. A) een voorbeelduitvoer die de identificatie en locatie van paw prints weergeeft. De oorspronkelijke gedetecteerde randen worden zwart weergegeven. De laatste gedetecteerde poten en het geschatte gebied worden weergegeven in kleuren die de Paw-classificatie aangeven. In deze afbeelding geel: voor links, groen: linksom, cyaan: voor rechts en magenta: Hind rechts. De kleuren kunnen echter worden gewijzigd in het python-script op basis van de voorkeur van de gebruiker. B) een perceel ter illustratie van twee belangrijke temporele parameters: de hoeveelheid tijd die elke poot in contact staat met de grond (Stance fase) en in de lucht (swing fase). Gekleurde blokken geven de Stance fase aan en de witte ruimten geven de swing fase aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6. Effecten van Haloperidol op Gait. A) resultaten van experiment 1: hoge dosis Haloperidol (halH) significant verhoogde staplengte en maximaal contactgebied in vergelijking met de zout aandoening (Sal). B) experiment 2 resulteerde in meer typische symptomen van parkinsonien; lage dosis Haloperidol (halL) significant verhoogde houding duur en maximale contactgebied. C) bij het vergelijken van de Haloperidol behandelde voorwaarden van beide experimenten, hoge dosis Haloperidol verhoogde basis van ondersteuning, maximale contactgebied en interledemaat afstand in vergelijking met de lage dosis conditie. Gegevens zijn gemiddelden ± SEM, n = 8. Gekoppelde monsters t-test verschillen waren als volgt: # p < 0,05, # # p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7. Nauwkeurigheid van de geautomatiseerde analyse. (A) het geautomatiseerde systeem verschilt aanzienlijk van handmatige scoring bij het meten van bos, hoewel dit kan te wijten zijn aan variaties in handmatige centroïde selectie in plaats van detectiefouten. B) het geautomatiseerde systeem verschilt niet significant van de handmatige scoring voor de staplengte. Deze nauwkeurigheids resultaten zijn consistent met die van andere beschikbare systemen. Gegevens zijn gemiddelden ± SEM, n = 21. Gekoppelde monsters t-test verschillen waren als volgt: # p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8. Vergelijking van tijdelijke parameters. Temporale gang patronen voor een dier behandeld met zoutoplossing (A) en lage dosis Haloperidol (B). C) een illustratie van de bracing-Escape-respons van een rat die een hoge dosis Haloperidol heeft gekregen. Zoals in Figuur 5geven gekleurde blokken aan wanneer de poot in contact was met de grond (Stance fase) en de witte ruimten aangeven wanneer de poot in de lucht was (swing fase). Afkortingen: FL, voor links; HL, Hind links; FR, voor recht; HR, Hind rechts. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Experiment 1 | Experiment 2 | |||||||
| Test 1 | Test 2 | Test 3 | Test 4 | Test 5 | Test 6 | Test 7 | Test 8 | |
| Groep A | HalH | Sal | HalH | Sal | Sal | HalL | Sal | HalL |
| Groep B | Sal | HalH | Sal | HalH | HalL | Sal | HalL | Sal |
Tabel 1. Experimenteel ontwerp. Deze tabel illustreert het experimentele ontwerp dat in deze studie wordt gebruikt. We gebruikten een binnen-onderwerp ontwerp waarin elke rat werd getest in de hoge dosis Haloperidol (halH), lage dosis Haloperidol (halL) en zoutoplossing (Sal) voorwaarden. Ratten werden verdeeld in twee groepen; het testen werd gecompenseerd voor de tijd van de dag en de volgorde van voorwaarden.
| Parameter | Definitie |
| Stride length | Afstand tussen opeenvolgende contacten van dezelfde poot |
| Staplengte | Afstand tussen opeenvolgende contacten van contralaterale voor-of achterpoten langs de as van de bewegingsrichting |
| Basis van ondersteuning (BOS) | Afstand tussen opeenvolgende contralaterale voor-of achterpoten loodrecht op de as van de bewegingsrichting |
| Maximaal contact gebied | Het maximaal gedetecteerde gebied van een Hind-print |
| Afstand tussen ledematen | Afstand tussen ipsilaterale voorzijde en achterpoten |
| Duur van de koers | De lengte van de tijd dat een poot in contact was met de grond |
| Swing duur | De lengte van de tijd die een poot was niet op de grond |
| Koers-naar-zwenk ratio (SSR) | Koers duur/Swing duur |
| Discrete snelheid | Stride lengte/(Stance duur + Swing duur) voor een poot |
| Gemiddelde snelheid | Gemiddelde van discrete snelheden in de periode die wordt gebruikt voor analyse |
| Snelheids variabiliteit | Procentuele verandering in discrete snelheden tijdens het hardlopen |
| Hardloopsnelheid | Tijd om de tunnel/lengte van de tunnel over te steken |
Tabel 2. Beschrijving van de parameters voor de gang. Deze tabel beschrijft de meest gebruikte gang parameters; de in deze studie gebruikte middelen zijn vet aangegeven.
Discussion
In deze studie, We testten Prancer, een nieuwe geautomatiseerde gang analysesysteem dat gebruik maakt van contrast-verbeterde Video's geproduceerd met behulp van een doorschijnende vloer om het lichaam van het dier te verduisteren en duidelijk gedefinieerde paw prints voor eenvoudige geautomatiseerde detectie opleveren. PrAnCER identificeert de paw prints nauwkeurig en is gevoelig voor veranderingen in de motorische functie. We gebruikten PrAnCER om gang veranderingen te beoordelen in een acuut Haloperidol model van PD. Hoewel Haloperidol niet de verwachte motorische tekorten van een robuust PD-model induceerde, konden we toch aantonen dat PrAnCER veranderingen in gang patronen nauwkeurig kan detecteren. Ten slotte hebben we de nauwkeurigheid van de PrAnCER gekwantificeerd en aangetoond dat het meten van de belangrijke parameters vergelijkbaar is met die van handmatige scoring.
In beide Haloperidol behandelde aandoeningen, we waargenomen een hoge incidentie van bevriezing gedrag (akinesia) gevolgd door een ontsnappings reactie van het lopen of het kader voorwaarts. Hoewel Akinesie is waargenomen bij een vergelijkbare dosis (0,25 mg/kg) in verschillende onderzoeken16,23, is dit begrenzings gedrag niet consistent met de typische symptomen van Parkinsonian3,14,19, 24. Interessant, we vonden dat hoge dosis Haloperidol behandeling resulteerde in significant toegenomen staplengte. Deze bevinding was in eerste instantie verrassend omdat andere Haloperidol-modellen van PD een afname van de staplengte3,19hebben aangetoond. Echter, ze zijn zinvol in het licht van de ' bracing-Escape ' gedragspatroon beschreven door de Ryck et al. (1980), die meldde dat ratten lopen om te ontsnappen na akinetische periodes, en dat hoge snelheid gangen zoals rennen en begrenzings worden geassocieerd met verhoogde stap lengte4,25 (figuur 8c). Een hoge dosis behandeling resulteerde ook in een significant verhoogd contactoppervlak van de achterpoten. De behandeling met Haloperidol in lage doses resulteerde in meer karakteristieke PD-gang veranderingen, waaronder een significante toename van de Stance duur en het maximale contactgebied (figuur 8a-B). Deze resultaten kunnen een afspiegeling zijn van de spierstijfheid geassocieerd met Haloperidol-geïnduceerde Akinesie.
Ondanks het ongewone bracing-Escape gedrag, konden we aantonen dat PrAnCER inderdaad veranderingen in gang kan detecteren. We toonden dat in de juiste lichtomstandigheden een doorschijnende vloer een sterk contrasteerd en gedetailleerd beeld van de poten kan produceren. In de huidige studie maakten we een transparante vloer doorschijnend door het te bedekken met vellum. Hetzelfde effect kan worden bereikt door een andere doorschijnende bekleding, zoals Mylar, op een transparante vloer te plaatsen. Als alternatief kan de vloer zelf doorschijnend zijn door bijvoorbeeld matte plexiglas te gebruiken. De doorschijnende vloer en eenvoudige plexiglas loopbrug zijn goedkoop en kunnen worden gebouwd in een middag. Ons op de randdetectie gebaseerde analysesysteem is bestendig tegen vele variaties in het apparaat en biedt instelbare drempels om het systeem aan te passen aan verschillende opstellingen, ziekte modellen of kleinere dieren zoals muizen.
Sommige gang parameter analyses werden gewijzigd van conventionele formules vanwege aspecten van de loopbrug. Onze methode voor het berekenen van de snelheid verschilt bijvoorbeeld van andere gang-studies; de doorschijnende vloer in combinatie met LED-verlichting bedekt het zicht van het lichaam, dus het is niet mogelijk om de lichaamspositie te volgen om de snelheid te berekenen zoals gewoonlijk gebeurt. Voor deze studie werd de snelheid berekend door de afgelegde afstand tussen twee contacten van dezelfde poot te delen door de tijd vanaf het eerste contact tot het tweede contact. Natuurlijk kunnen andere formules worden gebruikt. Bijvoorbeeld, als een algemene meting van snelheid nodig is, kan men de afstand van het gemiddelde van forepaw locaties aan het begin en het einde van de uitvoering door de duur van de uitvoering verdelen.
Onze analyse bevestigt dat, hoewel niet identiek aan handmatig scoren, ons geautomatiseerde systeem zeer nauwkeurig presteert en betrouwbare maatregelen van Gait genereert. Het hier beschreven apparaat is geoptimaliseerd voor een eenvoudige, goedkope analyse van de motorische functie. Echter, verschillende wijzigingen kunnen worden aangebracht die het nut van de PrAnCER zou uitbreiden. Een beperking van ons systeem is dat de semi-transparante vloer, terwijl het toestaan van uitstekende poot detectie, de lichaams as van de dieren bedekt. Hoewel we het niet nodig hebben gevonden, kan dit worden aangepakt door een overhead camera aan het systeem toe te voegen. Een andere verbetering zou het gebruik van een videocamera met een hogere frame rate zijn. Hoewel we in staat waren om consistente schattingen van temporele parameters te verkrijgen, is de nauwkeurigheid van deze maatregelen aangetast bij framesnelheden onder 100 fps8. Het toevoegen van een High-Speed videocamera vereist geen wijziging van de analyse software en verhoogt tegelijkertijd de nauwkeurigheid en precisie van tijdelijke maatregelen. Daarnaast maken verschillende andere gang-systemen gebruik van een spiegel om tegelijkertijd de laterale en ventrale standpunten van de rat2,8,13op te nemen. Het toevoegen van deze functie aan ons apparaat zou een nauwkeurigere kwantificering van de snelheid en een betere observatie van gedrag tijdens runs mogelijk maken.
In deze studie toonden we aan dat het gebruik van een semi-transparante vloer de paw prints effectief isoleert door de zichtbaarheid te blokkeren van objecten die niet in contact staan met de loopbrug vloer. We ontwikkelden een geautomatiseerd scoresysteem dat profiteert van deze hoge contrast Paw Print om poten nauwkeurig te identificeren. We toonden aan dat dit systeem, PrAnCER, gekwantificeerde parameters met een nauwkeurigheid vergelijkbaar met commerciële systemen. We bepaalden dat toediening van een hoge dosis Haloperidol de paslengte en het maximale contactoppervlak verhoogde in vergelijking met zoutoplossing. Hoewel deze verandering het tegenovergestelde is van wat we hadden verwacht, geeft verder onderzoek van bestaande literatuur aan dat het waarschijnlijk een deel van het ontsnappings gedrag is dat wordt waargenomen in reactie op acute toediening van Haloperidol. De behandeling met Haloperidol bij lage doses resulteerde in meer typische PD-symptomen zoals een verhoogde Stance duur en een maximaal contactgebied. We concluderen dat, terwijl acute hoge dosis Haloperidol toediening een slecht model is om gang-beperkingen in verband met pd te bestuderen, onze studie niettemin het vermogen van de Prancer toonde om nauwkeurig veranderingen in de motorische functie te detecteren. In de toekomst, we hopen verder te valideren PrAnCER door het bestuderen van de motorische veranderingen in andere ziekte modellen.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het Carney Institute for Brain Science aan de Brown University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gait Walkway Apparatus | |||
| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 1 piece cut to 3 1/2" W x 36" L; 2 pieces cut to 4 1/2" W x 36" L Note: We made our walkway 36" long based off of an exisiting plexiglass table we had in house, it could easily be made longer if desired. |
|
| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $10 4 pieces, cut to 1" W by 4" L These will be used to keep the tunnel in place |
|
| 10 series 80/20 framing pieces, 1" x 1" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1010-S | Approximate Price: $16 2 pieces cut to 36" L |
| 12V Flexible LED Strip Lights, 16.4ft/5m LED Light Strips, Daylight White | Amazon | Approximate Price: $10 | |
| Bostik Blu-Tack Adhesive | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Clearprint 1000H drafting vellum, 16 LB cotton fiber | Dick Blick Art Supplies | 11101-1046 | Approximate Price: $50 Cut to 4" W x 36" L Note: This particular vellum comes as a roll; we kept it on the roll and cut it to 4" W. Mylar or frosted plexiglass could also be used in place of the vellum, but the camera software detection settings would need to be adjusted. |
| Logitech HD Pro Webcam C920, 1080p | Amazon | Approximate Price: $50 | |
| Mobile Laptop Computer Desk Cart Height-Adjustable | Amazon | Approximate Price: $40 Small table to place the animals' home cage on at the end of the walkway. |
|
| Plastic ramp | Pets Warehouse | Approximate Price: $6 Optional: Ramp to assist the animals descend into home cage |
|
| RetiCAM Tabletop Tripod with 3-Way Pan/Tilt Head | Amazon | Approximate Price: $30 | |
| SCIGRIP #16 solvent cement for acrylic - clear, medium bodied | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Plexiglass table | Approximate Price: $ | ||
| 15 series 80/20 framing pieces, 1.5" x 1.5" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1515 | Approximate Price: $110 6 pieces cut to 36" L, 2 pieces cut to 12" With both ends tapped with standard 5/16-18 threads Framing for the plexiglass table top and table legs |
| 15 series 3 Way - Light Squared Corner Connector | 80/20 Inc. | 14177 | Approximate Price: $24 4 connectors To connect the table top and legs |
| 1/4" clear plexiglass sheet | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 Cut at 15" W x 39" L |
|
| 5/16-18 x 1" Button Head Socket Cap Screw | 80/20 Inc. | 3118 | Approximate Price: $5 Quantity = 12 |
| Deluxe Leveling Feet, 5/16-18 x 2" | 80/20 Inc. | 2194 | Approximate Price: $50 Quantity = 4 For table legs |
| “T” Handle Ball End Hex Wrench, 3/16" | 80/20 Inc. | 6000 | Approximate Price: $5 |
References
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Lee, H. Y., Hsieh, T. H., Liang, J. I., Yeh, M. L., Chen, J. J. Quantitative video-based gait pattern analysis for hemiparkinsonian rats. Medical & Biological Engineering & Computing. 50 (9), 937-946 (2012).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson’s disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Batka, R. J., Brown, T. J., Mcmillan, K. P., Meadows, R. M., Jones, K. J., Haulcomb, M. M. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical Record. 297 (10), 1839-1864 (2014).
- Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. W. Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson’s disease or amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Motor Behavior. 40 (6), 568-577 (2008).
- Williams, M. T., et al. Kaolin-induced ventriculomegaly at weaning produces long-term learning, memory, and motor deficits in rats. International Journal of Developmental Neuroscience. 35, 7-15 (2014).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Kloefkorn, H. E., et al. Automated Gait Analysis Through Hues and Areas (AGATHA): A Method to Characterize the Spatiotemporal Pattern of Rat Gait. Annals of Biomedical Engineering. 45 (3), 711-725 (2017).
- Pereira, J. E., et al. A comparison analysis of hindlimb kinematics during overground and treadmill locomotion in rats. Behavioural Brain Research. 172 (2), 212-218 (2006).
- Nakamura, A., et al. Low-cost three-dimensional gait analysis system for mice with an infrared depth sensor. Neuroscience Research. 100, 55-62 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Mendes, C. S., Bartos, I., Márka, Z., Akay, T., Márka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (50), (2015).
- Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
- Duty, S., Jenner, P. Animal models of Parkinson’s disease: a source of novel treatments and clues to the cause of the disease. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1357-1391 (2011).
- Kulkarni, S. K., Bishnoi, M., Chopra, K. In vivo microdialysis studies of striatal level of neurotransmitters after haloperidol and chlorpromazine administration. Indian Journal of Experimental Biology. 47 (2), 91-97 (2009).
- Jain, N. S., Tandi, L., Verma, L. Contribution of the central histaminergic transmission in the cataleptic and neuroleptic effects of haloperidol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 139 (Part A), 59-66 (2015).
- Steinpreis, R. E., Anders, K. A., Branda, E. M., Kruschel, C. K. The Effects of Atypical Antipsychotics and Phencyclidine (PCP) on Rotorod Performance. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 63 (3), 387-394 (1999).
- Baptista, P. P. A., et al. Physical exercise down-regulated locomotor side effects induced by haloperidol treatment in Wistar rats. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 104, 113-118 (2013).
- Chuang, C. S., Su, H. L., Cheng, F. C., Hsu, S., Chuang, C. F., Liu, C. S. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson’s disease. Journal of Biomedical Science. 17 (9), (2010).
- Bugalho, P., Alves, L., Miguel, R. Gait dysfunction in Parkinson’s disease and normal pressure hydrocephalus: a comparative study. Journal of Neural Transmission. 120 (8), 1201-1207 (2013).
- Bradski, G. The OpenCV Library. , (2000).
- Chen, H., Du, J., Zhang, Y., Barnes, K., Jia, X. Establishing a Reliable Gait Evaluation Method for Rodent Studies. Journal of Neuroscience Methods. 283, 92-100 (2017).
- De Ryck, M., Hruska, R. E., Silbergeld, E. K. Estrogen and haloperidol-induced versus handling-related catalepsy in male rats. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 17 (5), 1027-1035 (1982).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic Characterization of Speed-Associated Gait Changes in Mice Reveals Modular Organization of Locomotor Networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- De Ryck, M., Schallert, T., Teitelbaum, P. Morphine versus haloperidol catalepsy in the rat: a behavioral analysis of postural support mechanisms. Brain Research. 201 (1), 143-172 (1980).
