Summary
אנו מתארים מערכת ניתוח הילוך הרומן, כפה הדפסה ניתוח של הקלטות ניגודיות-משופרת (PrAnCER מנסר), גישה פתוחה מערכת אוטומטית עבור כימות של מאפייני הליכה חולדות העושה שיטה הספר השקוף למחצה הרצפה באופן אוטומטי לכמת הילוך. מערכת זו אומתה באמצעות מודל לופרידול של מחלת פרקינסון.
Abstract
ניתוח הילוך משמש לכמת שינויים בתפקוד מנוע במודלים מכרסמים רבים של מחלות. למרות החשיבות של הערכת הילוך ותפקוד המנוע בתחומים רבים של מחקר, האפשרויות המסחריות הזמינות יש מספר מגבלות כגון עלות גבוהה והעדר נגיש, קוד פתוח. כדי לטפל בנושאים אלה, פיתחנו PrAnCER נסר, כפה להדפיס ניתוח של הקלטות משופרות ניגודיות, עבור כימות אוטומטי של הילוך. ההקלטות המשופרות מופקים על ידי שימוש ברצפה שקופה שאינה מסתירה עצמים שאינם במגע עם פני השטח, ומבודד באופן יעיל את הדפסים של כף היד של העכברוש בזמן ההליכה. באמצעות קטעי וידאו אלה, תוכנית התוכנה הפשוטה שלנו מודד באופן אמין מגוון של פרמטרים הליכה הזמני זמן כדי להדגים כי prancer נסר יכול במדויק לזהות שינויים בתפקוד המנוע, העסקנו מודל לופרידול של מחלת פרקינסון (PD). בדקנו חולדות בשתי מנות של haloperidol: מינון גבוה (0.30 מ"ג/ק"ג) ומינון נמוך (0.15 מ"ג/ק"ג). Haloperidol הגביר באופן משמעותי את משך העמידה ואת האזור האחוריות הקשר במצב מינון נמוך, כפי שניתן לצפות במודל PD. במצב מינון גבוה, מצאנו עלייה דומה באזור המגע, אך גם עלייה בלתי צפויה באורך פסיעה. עם מחקר נוסף, מצאנו כי אורך צעד מוגבר זה תואם את תופעת הגברת לברוח בדרך כלל נצפתה במינונים גבוהים יותר של haloperidol. כך, PrAnCER נסר הצליח לזהות שינויים צפויים ובלתי צפויים בדפוסי הליכה מכרסמים. בנוסף, אנו אישר כי PrAnCER נסר הוא עקבי ומדויק בהשוואה הבקיע ידני של פרמטרים הליכה.
Introduction
מכרסמים משמשים בדרך כלל מודלים ללמוד מגוון רחב של מחלות ופציעות כולל דלקת פרקים1, פרקינסון מחלת (PD)2,3, הפרעות נוירוסקולריות4,5, הידרוצפלוס6 ופגיעה בחוט השדרה7. בתנאים אלה, תסמינים כגון כאב, איזון, פונקציה מוטורית ניתן למדוד על ידי לימוד דפוסי הליכה של בעלי חיים. דפוסים אלה הם כימות באמצעות קבוצה של פרמטרים הילוך ההילוך הזמני המסכמים את המיקום ואת העיתוי של הדפסים כפה, כמו גם את האזור של מגע כפה על הקרקע.
למרות אפשרויות רבות לניתוח הילוך קיים, מערכות נוכחיות יש החסרונות מספר. בדיו מסורתי ובדיקות נייר, כפות הידיים של בעל החיים מצופות בדיו לפני שהוא הולך על פני גיליון של נייר לבן (איור 1A). הדפסים כפה כתוצאה מכך ניתן למדוד לאורך פסיעה ורוחב העמידה, אך פרמטרים מפתח הילוך זמני כגון מהירות או משך צעד לא ניתן להעריך. מערכות מודרניות המבוססות על וידאו אמינות יותר, אבל ניתוח וידאו דורש הבקיע מסגרת על ידי מסגרת, אלא אם מערכת אוטומטית מתאימה משמש8. יש הרבה מערכות הבקיע אוטומטיות מסחריות הזמינות כרגע, אך מערכות אלה יכולות להיות יקרות מאוד. בנוסף, מערכות אלה להסתמך על ריצוף ברור או במקרים מסוימים, הליכונים, שניהם לשנות את התנועה הטבעית. הליכונים הוכחו מסכה להחלי מנוע בכמה דגמי מחלות9, בעוד ריצוף ברור (איור 1b) גורם עכברים לבלות יותר זמן על היקף של שדה פתוח, המציין חרדה מוגברת10. באופן אידיאלי, מנגנון ניתוח הילוך לא היה להסתמך על או, הפקת דפוסי התנועה הטבעית ביותר עם הלחץ הנמוך ביותר לחיה.
אפשרויות מקור פתוח ומסחרי זמינות משתמשות במגוון שיטות כדי להתגבר על הקושי של בידוד טביעת רגל מגוף החיה למרות תנאי תאורה משתנים, צבע בעלי חיים וצורות הדפסה. חלק לשפר את הניגוד של יצירת קשר עם כפות רגליים שחרור אור בתגובה ללחץ7,11,12, אבל אלה יקרים ומבחינה טכנית קשה לבנות. מערכות אחרות לנצל זוויות תצוגה מרובות המאפשרים התבוננות של תאום גוף שלם8,13. בעוד אפשרויות אלה מציעות יתרונות עבור מדידת פרמטרים נוספים מנוע מעבר הילוך, הם מורכבים ללא צורך עבור ניתוח הילוך פשוטה. יתר על כן, כל הטכניקות הללו להסתמך על ריצוף ברור, אשר משנה התנהגות טבעית.
פרנסר מבוסס על מה שאנו מכנים הקלטות חדות-משופרות, אשר משתמשות בשילוב של תאורה ורצפה שקופה למחצה כדי לשפר את הזיהוי של הדפסים. כאשר מתבוננים מלמטה, הדבר יוצר תמונה בעלת ניגודיות גבוהה (כפה הדפסה) תוך כדי טשטוש המראה של אובייקטים שאינם במגע עם המשטח (גוף החיה) (איור 1D). כאשר מתבוננים מלמעלה, הרצפה נראית אטומה. הערבה כתוצאה של כפות הידיים בשיטה שלנו מאפשרת זיהוי מדויק של מגוון של הליכה ומאפיינים locomotor על ידי המערכת החדשה שפיתחנו האוטומטי. במחקר הנוכחי, אנו מתארים את המנגנון, את הפרוטוקול ניתוח הילוך שלנו, ואת מערכת הניקוד האוטומטי שלנו, הפרנסר. המנגנון שלנו הוא התאספו בקלות ו-PrAnCER נסר ניתן להשתמש כדי להעריך את מנועי מנוע מגוון רחב של מחלות ומודלים פציעה.
כדי להדגים כי prancer נסר ניתן להשתמש כדי לזהות דפוסי הליכה חריגים, השתמשנו מודל לופרידול של PD, מודל פשוט עבור אינדוקציה ארעית של שינויים locomotor14. Haloperidol הוא יריב קולטן דופמין בשימוש נרחב כאנטי פסיכוטיות1. היא משפיעה על מערכות מוטוריות על ידי שינוי דופמין איתות בסטריאטום, מרכיב חשוב של מסלול המנוע ב גרעינים בסיס14. אפילו מנה אחת של לופרידול מפחיתה במהירות רמות דופמין החילוץ בסטריאטום, גורם parkinsonian מנוע כמו להפריש15שלה. ההשפעות ההתנהגותית הן קשיחות שרירית, אסקיסיה וקטלאפסי, המוגדרת כחוסר יכולת לחזור לתנוחה נורמלית לאחר ההנחה בתנוחה יוצאת דופן11,16. מינונים חריפה של לופרידול לגרום locomotor לזיהוי במבחן rotarod של פונקציה מוטורית17. היינו מנומקת כי haloperidol-תיווך locomotor ליקויים יהיה גם ברור במספר מאפיינים נגישים לניתוח הילוך אוטומטי.
למרות התגובות לופרידול להשתנות באופן נרחב על פני מחקרים, אפקטים קטלטיים של לופרידול להגיח במינונים של 0.5 מ"ג/ק"ג ומעלה, בעוד תגובתיות מופחתת ליקוי מנוע מתגלה במינונים נמוכים (0.1-0.3 מ"ג/ק"ג)16, 17. במאמץ למנוע את ההשפעות הקטלטיות של haloperidol, החלטנו לבדוק שתי מנות של haloperidol: מינון גבוה (0.30 מ"ג/ק"ג) ומינון נמוך (0.15 מ"ג/ק"ג). כפי שמוצג בטבלה 1, ניסוי 1 בדק את ההשפעות של מינון גבוה haloperidol, בעוד ניסוי 2 בדק את ההשפעות של מינון נמוך הלפרידול. השתמשנו בעיצוב בתוך נושא שבו כל חולדה נבדקה במינון גבוה, במינון נמוך, ובקרה (מלוחים) תנאים. סדר התנאי היה מאוזן. על פני חולדות אנו חזו כי מינהל אקוטי של לופרידול יגרום ליקויי הילוך דומה לאלה שנמצאו במודלים אחרים של משטרת כגון מהירות ירידה, אורך פסיעה ירידה, ועוד עמידה במשך3,14,18 ,19. הבחנו בשינויי התנהגות, כולל כקינססיה בעקבות ממשל הלופריאיידול בשתי המינונים. במצב במינון נמוך, חולדות הגדילו באופן משמעותי את משך העמידה ואת האזור האחוריות המגע, כצפוי. השינויים האלה הילוך הם דומים האיטי, ערבוב צעדים נפוצים בקרב חולי PD2,20. במצב מינון גבוה, עם זאת, ראינו עלייה באורך פסיעה, כמו גם עלייה באזור המגע כפה. למרות העלייה באורך פסיעה היה בלתי צפוי, סקירה נוספת של הספרות עולה כי סביר להניח שהוא חלק מתגובת הגברת המרעננת המושרה-הלפרידול. אנו מסיקים כי PrAnCER נסר הוא אכן מסוגל לזהות שינויים כמו Parkinsonian בהילוך מכרסם עקבי עם שימוש של נוירולפטיקה.
Protocol
כל ההליכים היו לפי הנחיות הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת בראון.
1. מנגנון ניתוח הילוך
- הכן את שביל ניתוח הילוך המורכב של שביל פלקסיגלס סגורים ברור (36 "L x 3" W x 4.5 "H) ממוקם על רצפה פלקסיגלס ברורה (איור 2A). להפוך את הרצפה פלקסיגלס שקוף למחצה על ידי כיסוי אותו עם פיסת 16 ליברות סיבים כותנה שרטוט קלף לחתוך לרוחב זהה למעבר.
הערה: ישנן שיטות נוספות להפיכת הרצפה לשקוף למחצה. - מניחים מצלמה עם קצב מסגרות של לפחות 30 מסגרות לשנייה (fps) ישירות מתחת למעבר כדי ללכוד את אמצע המסלול (איור 2B).
- לאבטח רצועה של 12 הנורות LED עם 18 נוריות/רגל במרחק של כ 2 סנטימטרים מ ו 1 סנטימטר מעל הרצפה של המעבר כדי להאיר את המסלול.
2. הכנה לבעלי חיים
- הרשו לבעלי החיים לעשות האקלים במשך שבוע לפחות לפני הטיפול. לטפל בחולדות לפחות 5 ימים לפני תחילת הניסוי. מחקר זה השתמש 8 עכברים זכר לונג אוונס בערך 3 חודשים.
-
Habituate בעלי החיים לחדר הבדיקות ושביל ההליכה עם אורות החדר כבויים
- מניחים את כלוב הבית של החולדה במפלס פני השטח בקצה שביל ההליכה כדי לשמש כתיבת מטרה. שים לב כי אם כלוב הבית הוא עמוק, מיושן או לקוי חולדות עשוי להפיק תועלת מרמפה או צעד כדי לספק גישה קלה יותר לכלוב הבית.
- הניחו לעכברוש ללכת מהיד הנסבית לאורך השביל להגיע לכלוב הביתי שלו.
- חולדות לעתים קרובות לעצור בסוף השביל להסתכל סביב לפני לקפוץ לתוך כלוב הבית. אם עכברוש לוקח יותר מ 1 דקות כדי לצאת מן המסדרון, לעודד אותו להיכנס לכלוב הבית שלה עם דחיפה עדינה.
- אם העכברוש מסתובב, השתמש בחתיכה קטנה של פלקסיגלס כדי לחסום את הקצה הפתוח של השביל. חזור על הסכום הכולל של 3 ריצות.
- Habituate לפחות יומיים או עד שהעכברושים מרגישים בנוח לחצות את השביל בקצב קבוע בלי לקפוא.
3. הילוך בדיקת הליך
- כוונן את ההגדרות בתוכנת מצלמת האינטרנט כדי להשיג את התמונה הברורה ביותר של הדפסי כף היד. כבה את אורות החדר עבור כל בדיקות הילוך.
- הקלט כל הפעלה בנפרד והתווית כראוי לשימוש עם תוכנית הניתוח האוטומטי.
- ודאו שאין כתמים או שרידים על קלף. התחילו להקליט כמה שניות לפני שהעכברוש נכנס למעבר ולהפסיק ברגע שהעכברוש יוצא מהמסדרון ונכנס לכלוב הבית שלו.
- המשך עד ששלושת הרצפים המקובלים הושלמו או 10 דקות חלפו.
- נגב את השביל עם אתנול בין כל חולדה והחלף את קלף הנייר לפי הצורך.
הערה: המשפט המקובל מוגדר כאחד שבו בעל החיים מתהלך בעקביות וללא הפסקה לארבעת השלבים הראשונים של הריצה. אם קשה להשיג זאת, התאם את הקריטריונים להכללת מבחנים שבהם קיימים 4 שלבים רצופים בכל נקודה בהפעלה המתרחשים ללא הפסקות או האצה פתאומית.
4. מנסר אוטומטי ניתוח
- לשים את כל קטעי וידאו להיות מנותח בתיקיה.
- ההשקה PrAnCER נסר ידי הפעלת התסריט פיתון prancer נסר. PrAnCER נסר ינתח את קטעי וידאו מבוסס על השלבים מאוירים באיור 3 ואיור 4.
- בתפריט הנפתח, בחר בתיקייה שצוינה על-ידי לחיצה על לחצן בחירת תיקיה . בחרו אפשרויות מותאמות אישית לניתוח במקרה הצורך. ניתן למצוא תיאורים מפורטים של כל פרמטר על-ידי לחיצה על סימן השאלה שלצידו. לחץ על המשך כשתסיים.
- הגדר אזור מעניין (ROI) בתמונה של המעבר שמופיע. כדי לעשות זאת, עזב לחץ כדי להגדיר את הקצה העליון ואת הקליק הימני כדי להגדיר קצה תחתון. אם התיבה המופיעה נכונה, הקש על N כדי להמשיך. אם לא, הקש Z כדי לבטל. לאחר N נלחץ, התוכנית תפעל באופן אוטומטי.
- לאחר השלמת PrAnCER נסר, לסיים את התוכנית על ידי לחיצה על Enter בטרמינל.
- כדי לסקור באופן ידני את התפוקה של התוצאות על ידי פרנסר, הפעל את הסקריפט פייתון באמצעות מחשב ובחר את הקובץ המתאים. mp4 עבור כל וידאו. במידת הצורך, תקן הדפסים לא מזוהים או ממוזגים.
- כדי לחלץ פרמטרים ההילוך המרחבי הזמני, להפעיל את הסקריפט פיתון מנתח. בחר את מספר ההדפסות האחוריות כדי לנתח את התיקיה של קטעי וידאו לנתח, ולאחר מכן לחץ על המשך. פעולה זו תגרום להפקת קובץ. csv עבור כל וידאו המכיל מספר פרמטרי הילוך נפוצים, המתוארים בטבלה 2 ומאוירים באיור 5.
הערה: הסקריפטים המלאים, כמו גם הוראות קריאה וניתוח נתונים, זמינים ב GitHub של המחבר (www.github.com/hayleybounds). אנו מיושמים אלגוריתם זה באמצעות בחינם, פתוח מקור הספרייה פיתון OpenCV21. כלולים גם על GitHub הם הוראות לבניית שביל ניתוח ההילוך שלנו.
Representative Results
נוהל הלפרידול
פיתחנו את המערכת ניתוח הילוך להשוות פרמטרים הילוך בחולדות שליטה לאלה חולדות ניסיוני צפוי להראות מגוון של locomotor, הילוך, ואיזון ליקויים. השתמשנו בעיצוב בתוך הנושא שבו כל חולדה נבדקה בתמיסת מלח, במינון גבוה הלופרידול ומינון נמוך בתנאי הלפריאיידול. חולדות הופרדו לשתי קבוצות (A ו-B) כדי לאפשר איזון נגדי; בדיקות הילוך היה מאוזנת נגד זמן של יום וסדר של תנאי. כל בדיקה היתה מופרדת על ידי 48 h. חולדות היו מורדם בקלות עם isofלפני קבלת הזריקות הצפק (IP) של או תמיסת מלח או הלופרידול. הילוך נבדק 1 h לאחר ההזרקה, בשלב זה הלפריאיידול צריך להיות ברמות שיא15,16,17.
תוצאות התנהגותיות
הבחנו בשינוי התנהגותי בולט בבעלי חיים שטופלו בהלופרידול. במצב של מינון גבוה, חמישה משמונת העכברושים היו תקופות של חוסר ניידות בתחילת המעבר, שבמהלכה הם לא הגיב לניסויים שנוגעים בהם ועמידים בפני העברתם. במקרים מסוימים, מדינה זו נמשכה מספר דקות עד להסרת החולדה מהמסדרון. במקרים אחרים, העכברוש השותק לפתע זז במהירות או "מאוגד" לאורך המעבר ולאחר מכן חוזר אל המדינה הקפואה לקראת הסוף. במצב מינון נמוך, 3 מתוך 8 חולדות היו תקופות דומות של חוסר ניידות. במינון זה, היה רק מופע אחד של התנהגות תוחמת. התוחמת לא נצפתה כאשר החיות טופלו בתמיסת מלח.
ניתחנו את ההשפעות של לופרידול על הפרמטרים הבאים הילוך: בסיס של תמיכה, אורך פסיעה, מהירות פסיעה, משך העמידה, העמדה ליחס הנדנדה, אזור הקשר המקסימלי, ומרחק interlimb. בגלל הרבה פרמטרים הילוך לחזית הגפיים האחוריות זהים ו לופרידול בדרך כלל יש השפעות אחידה על כל הגפיים, אנו מחושבים פרמטרים רק הגפיים האחוריות ולא הפרידו נתונים עבור הגפיים השמאלית והימנית. עבור כל חולדה, אנו מחושבים את המשמעות של כל פרמטר הילוך מכל הרצפים שמיש מכל מיום בדיקה. כל הפרמטרים (מלבד השתנות מהירות) חושבו כממוצע עבור 4 השלבים הניתנים לשימוש הראשונים של הפעלה. כדי להעריך אם כל מינון של הלופרידול השפיעו באופן משמעותי, השתמשנו במבחן t לדוגמה מזווג. בניסוי 1, הייתה עלייה משמעותית באורך פסיעה (איור 6A; t (7) =-2.962, p = 0.021) ואזור הקשר המקסימלי (איור 6a; t (7) =-2.51, p = 0.04) בבעלי חיים שטופלו במינון גבוה הלופרידול. בסיס התמיכה, המהירות, משך העמידה והעמידה ביחס הסווינג לא היו משמעותיים. בניסוי 2, בעלי חיים שניתנו במינון נמוך לופרידול הראו עלייה משמעותית במשך העמידה (איור 6b; t (7) =-2.444, p = 0.044) ואזור הקשר המקסימלי (איור 6b; t (7) =-3.085, p = 0.018) בהשוואה למצב מלוחים. שום פרמטרים הליכה אחרים לא היו משמעותיים. בנוסף, היה הבדל משמעותי בין המינון הגבוה לבין מינון נמוך במינון התנאים בבסיס של תמיכה (איור 6C; t (7) = 2.651, p = 0.033), אזור הקשר המקסימלי (איור 6c; t (7) = 4.635, p = 0.002) ומרחק בין הגפיים ( איור 6C; t (7) = 3.098, p = 0.017).
הדיוק במיקום שלך ושגיאות במערכת האוטומטית
כדי להעריך את הדיוק של PrAnCER נסר, השוונו את הניתוח האוטומטי שלה לניקוד ידני של 21 קטעי וידאו שנבחרו באקראי מקבוצה נפרדת של 6 חולדות שליטה. למטרות הבקיע יד, הסרטונים הומרו לרצף של תמונות, ששימשו לאחר מכן לסימון ידני של מיקומי ההדפסות. למען היעילות, התמקדנו בניתוח שלנו בנתונים מרחביים הנמדדים מתדפיסים אחוריים בלבד. לחלץ את אורך פסיעה מרושע BOS עבור כל וידאו והשווה אותו לערכים האוטומטיים. בעוד מתכוון אורך הפסיעה לא היה שונה באופן משמעותי בין ניקוד ידני ניתוח PrAnCER נסר (איור 7B; t (20) =-0.01, p = 0.99), בסיס התמיכה היה משמעותי (איור 7b(20) =-2.21, p = 0.038). למרות הניקוד אוטומטי וידני היה מתואם בדרך כלל, המערכת האוטומטית דיווחה על 5% בוס גדול יותר בממוצע. הבדל זה עשוי לנבוע מסטיות בבחירת הסנטאיד ולא משגיאות זיהוי. לקבלת ניקוד ידני, מיקום ההדפסה היה מסומן לצייר אליפסה סביב הבסיס של כל הדפסה האחוריות, כפי שיהיה קשה לשכפל באופן ידני את שיטת PrAnCER של הערכה המוני. המגמה הבהירה היתה עבור PrAnCER נסר ליתר בעלי חיים, אולי בגלל כמה בעלי המקום וזר את הבהונות שלהם החוצה בצורה אסימטרית, גורם PrAnCER נסר להתבונן מסנטרואידים קיצוניים יותר מאשר הבקיע ידני. מערכות אחרות ציינו גם עליות משמעותיות ב-BOS בין הבקיע ידני ואוטומטי למרות אורך פסיעה עקבית מדדים17. בהתחשב ההבדלים הקטנים שנצפו ואת עקביות עם מערכות אחרות, אנו מסיקים כי PrAnCER נסר הוא מידה אמינה של הליכה פרמטרים.
חשוב לציין כי כל ניתוח דיוק התרחשה לאחר תיקון ידני של הפלט האוטומטי בוצעה באמצעות GUI של PrAnCER. כמו במערכות מסחריות קיימות, שלב זה נחוץ הן לתיקון שגיאות בניקוד והן לביטול רצפים שאינם עומדים בקריטריונים22. אנחנו מכוונים את הפרנסר לטעות בצד של תוצאות חיוביות כוזבות, כמו אלה קל יותר לתקן לאחר-הוק. מעולם לא ראינו PrAnCER נסר להיכשל לזהות הדפסה אמיתית במהלך תיקון ידני של מעל 500 קטעי וידאו. סוגים אחרים של שגיאות, עם זאת, נצפו. אלה נפלו לתוך 3 קטגוריות: מיקוד שווא (זיהוי של אי-הדפסה כהדפסה), לא סיווגים (הדפסה לא מתויג כחזית/העורף או שמאלה/ימינה), ו שילובים שווא (שתי הדפסים ממוזג באופן שגוי). שגיאות אלה מתוקנות בקלות ב-GUI המלווה, ובדרך כלל מתרחשות באחוז קטן של קטעי וידאו שצולמו בתנאים רגילים. אפילו עם תיקונים כאלה, מקטין במידה ניכרת מפחיתה את כמות העבודה הידנית מעורב בניתוח הילוך. אנו מעריכים כי עבור כל וידאו זה לוקח כ 3 דקות להפעיל PrAnCER נסר ולתקן כל שגיאות פלט (אם יש צורך), בעוד זה ייקח כמעט 10 דקות להבקיע באופן ידני ולנתח את אותו וידאו.
איור 1. השוואה בין שיטות לניתוח הילוך. (א) שיטת הדיו והנייר המסורתית מייצרת הדפסים בלתי מדויקים של צורת כפה ומיקום. (ב) הקלטת וידאו עם רצפה שקופה מעניקה תצוגה מפורטת של הדפסים של כפה, אך מכיל תכונות בולטות רבות מגוף החולדה, אשר מסבך את הניקוד האוטומטי. (ג) נייר קל על רצפה ברורה יוצר תמונה רועשת ומאבד פרטים. (ד) השימוש בקלף כדי ליצור קומה שקופה מייצרת הדפסים מפורטים ביותר בעת הסרת הגוף באופן חזותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. איור סכימטי של מנגנון שביל ההליכה והקלטת וידאו. (א) העכברוש הולך דרך שביל ברור עם רצפה שקופה לתיבת המטרה של כלוב הבית בעת שנרשם מלמטה. במקרה זה, הקלף מכסה רצפה שקופה כדי להפוך אותו לשקוף. המעבר מואר על ידי רצועות LED הממוקם לאורך אורכו ברמה בין הרגליים של החיה והגוף. (ב) צילום מסך של הקלטת וידאו הממחיש את ההשפעות של הרצפה השקופה. אבל הגוף של החולדה הוא. למעשה לא ניתן לגילוי אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. תהליך זיהוי עבור מסגרת אחת של הדפסת כפה. (א) התמונה המקורית היא דה-noised ולאחר מכן נתון לחיסור הרקע (ב). (ג) מוחל אלגוריתם לזיהוי קצוות והתוצאות מומרות לסדרה של נקודות ציון של X, Y הנקראות קווי מיקום (D). (ה) קווי המתאר מקובצים לפי הסמיכות והגוף הקמור (התיבה התוחמת) של הקבוצה נלקח להפקת מתאר יחיד המקיף את ההדפסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. המרת הסדר הפרטני. לתוך טביעת אצבע מסווגת (א) הדפסים של כפה מזוהים לראשונה בסדרה של מסגרות. (ב) הוראות אובייקט בודדות ניתנות מספר המזהה אותם כתדפיס, המייצג מיקום אחד של כפה אחת (ג). (ד) לבסוף, הם מסווגים שמאלה או ימינה בהתבסס על המיקום שלהם יחסית לקו האמצע של השביל של בעל החיים, הקדמי או האחוריות בהתבסס על מיקומם ביחס הדפסים כף היד הקודם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. איור של פרמטרים הליכה שנותחו. (א) לדוגמה פלט המציג את הזיהוי והמיקום של הדפסים כפה. הקצוות המקוריים שזוהו מוצגים בשחור. הכפות האחרונות שזוהו והאזור המשוער מוצגים בצבעים המציינים את הסיווג של כפה. באיור זה, צהוב: משמאל לימין, ירוק: משמאל לימין, ציאן: מימין לחזית ומגנטה: מימין. עם זאת, ניתן לשנות את הצבעים בסקריפט פייתון בהתאם להעדפות המשתמש. (ב) מזימה הממחישות שני פרמטרים עיקריים: כמות הזמן כל כפה היא במגע עם הקרקע (שלב העמידה) ובאוויר (שלב הנדנדה). קוביות צבעוניות מציינות את שלב העמידה ואת החללים הלבנים מצביעים על שלב הנדנדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6. ההשפעות של לופרידול על הילוך. (א) תוצאות של ניסוי 1: במינון גבוה לופרידול (HalH) הגביר באופן משמעותי אורך פסיעה ואזור הקשר המקסימלי לעומת מצב מלוחים (סל). (ב) הניסוי 2 הביא הסימפטומים קיבלו טיפוסי יותר; מינון נמוך של הלופרידול (הלל) משך העמידה באופן משמעותי ואזור יצירת קשר מקסימלי. (ג) בעת השוואת התנאים שטופלו לופרידול משני הניסויים, במינון גבוה לופרידול בסיס של תמיכה, אזור הקשר המקסימלי מרחק האיבר בהשוואה למצב במינון נמוך. נתונים משמעו ± SEM, n = 8. לזווג דגימות t-test הבדלים היו כדלקמן: p < 0.05, p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7. דיוק של ניתוח אוטומטי. (א) המערכת האוטומטית שונה באופן משמעותי מניקוד ידני בעת מדידת BOS, אם כי הדבר עשוי לנבוע מווריאציות בחירת סנטאיד ידני ולא שגיאות זיהוי. (ב) המערכת האוטומטית אינה שונה באופן משמעותי מניקוד ידני עבור אורך פסיעה. תוצאות דיוק אלה מתאימות לאלה ממערכות זמינות אחרות. נתונים משמעו ± SEM, n = 21. לזווג דגימות t-test הבדלים היו כדלקמן: p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8. . השוואת הפרמטרים הטמפורלית דפוסי הליכה טמפורלית לבעלי חיים שטופלו בתמיסת מלח (A) ובמינון נמוך (ב). (ג) המחשה של התגובה מרענן-לברוח מחולדה נתן במינון גבוה haloperidol. כמו באיור 5, קוביות צבעוניות מצביעים כאשר כפה היה במגע עם הקרקע (שלב העמידה) ואת החללים הלבנים מצביעים כאשר כפה היה באוויר (הנדנדה שלב). קיצורים: FL, משמאל לפנים ; הל, האחוריות שמאל ; FR, מימין לחזית ; . שעות, ימין האחוריות אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ניסוי 1 | הניסוי השני | |||||||
| מבחן 1 | מבחן 2 | מבחן 3 | מבחן 4 | מבחן 5 | מבחן 6 | מבחן 7 | מבחן 8 | |
| קבוצה א | הלה | סאל | הלה | סאל | סאל | האלL | סאל | האלL |
| קבוצה ב' | סאל | הלה | סאל | הלה | האלL | סאל | האלL | סאל |
. שולחן 1 . תכנון ניסיוני שולחן זה ממחיש את העיצוב הניסיוני המשמש במחקר זה. השתמשנו בעיצוב בתוך הנושא שבו כל חולדה נבדקה במינון גבוה לופרידול (האלH), במינון נמוך לופרידול (הלל) ו מלוחים (סאל) תנאים. חולדות חולקו לשתי קבוצות; הבדיקה הייתה מאוזנת לזמן מה של היום וסדר התנאי.
| פרמטר | גדרת |
| אורך פסיעה | מרחק בין אנשי קשר רצופים של אותו כפה |
| אורך פסיעה | מרחק בין המגעים הרצופים של החזית או כפות הרגליים האחוריות לאורך ציר הכיוון של תנועה |
| בסיס תמיכה (BOS) | מרחק בין כפות קדמיות רצופות או רגליים אחוריות בניצב לציר הכיוון של התנועה |
| אזור אנשי קשר מרבי | האזור המרבי שאותר בהדפסה האחוריות |
| מרחק בין הגפיים | המרחק בין החזית הקדמית וכפות הרגליים האחוריות |
| משך העמידה | . משך הזמן שכפה היה במגע עם האדמה |
| משך הנדנדה | . משך הזמן שהכף לא היה על הקרקע |
| עמידה ביחס מתנדנד (SSR) | משך עמידה/משך הנדנדה |
| מהירות דיסקרטית | אורך פסיעה/(משך העמידה + משך הנדנדה) עבור כפה |
| מהירות ממוצעת | ממוצע מהירויות נפרדות בתקופה המשמשת לניתוח |
| השתנות מהירות | אחוז שינוי במהירויות נפרדות במהלך הפעלה |
| מהירות הפעלה | הזמן לחצות את המנהרה/אורך של מנהרה |
. שולחן 2 תיאור של פרמטרים הליכה. טבלה זו מתארת את פרמטרי ההילוך הנפוצים ביותר; אלה המשמשים במחקר זה מצוינים בהדגשה.
Discussion
במחקר זה, בדקנו את PrAnCER נסר, מערכת חדשה אוטומטית ניתוח הילוך המשתמש ניגודיות משופרת קטעי וידאו המיוצר באמצעות רצפה שקופה להסתיר את הגוף של בעל החיים כדי להניב הדפסים מוגדרים בבירור כפה עבור זיהוי אוטומטי פשוט. PrAnCER נסר מזהה במדויק הדפסים כפה רגיש לשינויים בתפקוד המנוע. השתמשנו בפרמנסר כדי להעריך שינויים הילוך במודל של הלופריאיידול חריפה של PD. למרות לופרידול לא לזרז את המנועים הצפויים של מודל PD חזקה, היינו בכל זאת מסוגלים להדגים כי prancer נסר יכול במדויק לזהות שינויים דפוסי הליכה. בסופו של דבר, אנו לכמת את הדיוק של PrAnCER והפגינו כי המדידה שלה של פרמטרים מפתח הילוך הוא דומה לזה של ניקוד ידני.
בשני התנאים שטופלו על ידי לופרידול, הבחנו בשכיחות גבוהה של התנהגות הקפאה (הקנקיסיה) ואחריו תגובה בריחה של ריצה או התוחמת קדימה. בעוד akinesia נצפתה במינון דומה (0.25 mg/ק"ג) במספר מחקרים16,23, התנהגות זו תוחמת אינה עקבית עם סימפטומים parkinsonian האופייני3,14,19, . עשרים וארבע מעניין, מצאנו כי מינון גבוה הטיפול לופרידול הביא אורך פסיעה משמעותית מוגברת. ממצא זה היה מפתיע בתחילה, כי מודלים אחרים לופרידול של המשטרה הראו ירידה באורך פסיעה3,19. עם זאת, הם הגיוני לאור התנהגות ' הגברת לברוח ' דפוס ההתנהגות המתוארת על ידי De ryck ואח ' (1980), מי דיווח כי חולדות לרוץ לברוח אחרי תקופות הקינטית, וכי מהירות גבוהה ילוך כגון ריצה ותוחמת משויכים צעד מוגבר אורך4,25 (איור 8c). טיפול במינון גבוה גם הביא באופן משמעותי הגדלת האזור המרבי של הכפות האחוריות. במינון נמוך טיפול לופרידול הביא שינויים אופייני PD הילוך כולל עלייה משמעותית במשך העמידה ואזור הקשר המקסימלי (איור 8a-B). תוצאות אלו עשויות להיות השתקפות של קשיחות השריר הקשורה לקיקינסזיה הנגרמת על ידי הלואופרל.
למרות התנהגות יוצאת דופן-escape, היינו מסוגלים להדגים כי PrAnCER נסר באמת יכול לזהות שינויים בהילוך. הצגנו כי בתנאי תאורה נכונה, קומה שקופה יכולה לייצר תמונה מאוד בניגוד ומפורט של הכפות. במחקר הנוכחי, עשינו רצפה שקופה שקופה על ידי כיסוי אותו עם קלף. ניתן להשיג את אותה השפעה על-ידי הצבת כיסוי שקוף נוסף, כגון יילר, בקומה שקופה. לחילופין, הרצפה עצמה יכולה להיות שקופה למחצה באמצעות, למשל, חלבית פלקסיגלס. הרצפה השקופה ושביל הפלקסיגלס הפשוטים הינם זולים, וניתן לבנות אותן בשעות אחר הצהריים. מערכת הניתוח המבוסס על זיהוי קצוות שלנו היא גמישה לווריאציות רבות במנגנון ומציעה סף מתכוונן להתאמת המערכת לכיוונונים שונים, למודלים של מחלות או לבעלי חיים קטנים יותר כגון עכברים.
כמה ניתוחים הילוך הליכה שונו מנוסחאות קונבנציונליות בשל היבטים של המעבר. לדוגמה, השיטה שלנו לחישוב מהירות שונה ממחקרים הליכה אחרים; הרצפה שקופה בשילוב עם תאורת LED מטשטש את התצוגה של הגוף, כך לא ניתן לעקוב אחר מיקום הגוף כדי לחשב מהירות כפי שנעשה בדרך כלל. עבור מחקר זה, המהירות חושבה על-ידי חלוקת המרחק בין שני אנשי קשר של אותו כפה בזמן המגע הראשון לקשר השני. כמובן, ניתן להשתמש בנוסחאות אחרות. לדוגמה, אם יש צורך במדידה כוללת של מהירות, ניתן לחלק את המרחק מהממוצע של מיקומי הקדמי בהתחלה ובסיום של ההפעלה במהלך ההפעלה.
האנליזה שלנו מאשרת כי, בעוד לא זהה לניקוד ידני, המערכת האוטומטית שלנו מבצעת עם דיוק גבוהה ומייצר אמצעים אמינים של הליכה. המנגנון המתואר כאן היה אופטימיזציה עבור ניתוח פשוט, בעלות נמוכה של תפקוד המנוע. עם זאת, שינויים מספר יכול להתבצע כי יהיה להרחיב את התועלת של PrAnCER. מגבלה אחת של המערכת שלנו היא כי הרצפה השקוף למחצה, תוך מתן המאפשר לזיהוי כף יד מעולה, מטשטש את ציר הגוף של בעלי החיים. למרות שאנחנו לא מצאנו את זה הכרחי, זה יכול להיות ממוען על ידי הוספת מצלמה תקורה למערכת. שיפור נוסף יהיה שימוש במצלמת וידאו עם קצב מסגרות גבוה יותר. בעוד הצלחנו להשיג הערכות עקבית של פרמטרים הזמן, את הדיוק של הצעדים האלה הוא נפרץ בשערי מסגרת מתחת 100 fps8. הוספת מצלמת וידאו במהירות גבוהה לא תדרוש שינוי בתוכנת הניתוח תוך הגברת דיוק ודיוק של הצעדים הטמפורלית. בנוסף, מספר מערכות הליכה אחרות להשתמש במראה כדי להקליט בו את הנוף לרוחב והגחוני של החולדה2,8,13. הוספת תכונה זו למנגנון שלנו יאפשר קוונפיקציה מדויקת יותר של מהירות ותצפית טובה יותר על התנהגות במהלך הריצות.
במחקר זה, הראנו כי השימוש ברצפה שקופה למחצה מבודד באופן יעיל הדפסים של כף היד על ידי חסימת הנראות של אובייקטים לא במגע עם הרצפה המסדרון. פיתחנו מערכת הבקיע אוטומטית כי מנצל את כף הניגודיות הגבוהה הזאת להדפיס כדי לזהות במדויק את הכפות. הראנו כי מערכת זו, המנסר, פרמטרים הילוך הליכה עם דיוק דומה למערכות מסחריות. קבענו כי הממשל של מנה גבוהה של לופרידול מוגברת אורך פסיעה ואזור הקשר המקסימלי לעומת תמיסת מלח. למרות ששינוי זה הוא ההיפך ממה שציפינו, סקירה נוספת של הספרות הקיימת מצביעה על כך שסביר להניח שהוא חלק מהתנהגות הבריחה שנצפתה בתגובה לניהול אקוטי של הלופרידול. במינון נמוך טיפול לופרידול הביא סימפטומים יותר אופייני PD כגון משך העמידה מוגברת ואזור הקשר המקסימלי. אנו מסיקים כי בעוד מינון גבוה חריפה הממשל הלאופרל הוא מודל עני כדי ללמוד הילוך ליקויים הקשורים PD, המחקר שלנו בכל זאת הפגינו את היכולת של PrAnCER נסר לזהות במדויק שינויים בתפקוד המנוע. בעתיד, אנו מקווים לשוב לאמת PrAnCER נסר ידי לימוד שינויים locomotor במודלים של מחלות אחרות.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מכון קרני למדעי המוח באוניברסיטת בראון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gait Walkway Apparatus | |||
| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 1 piece cut to 3 1/2" W x 36" L; 2 pieces cut to 4 1/2" W x 36" L Note: We made our walkway 36" long based off of an exisiting plexiglass table we had in house, it could easily be made longer if desired. |
|
| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $10 4 pieces, cut to 1" W by 4" L These will be used to keep the tunnel in place |
|
| 10 series 80/20 framing pieces, 1" x 1" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1010-S | Approximate Price: $16 2 pieces cut to 36" L |
| 12V Flexible LED Strip Lights, 16.4ft/5m LED Light Strips, Daylight White | Amazon | Approximate Price: $10 | |
| Bostik Blu-Tack Adhesive | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Clearprint 1000H drafting vellum, 16 LB cotton fiber | Dick Blick Art Supplies | 11101-1046 | Approximate Price: $50 Cut to 4" W x 36" L Note: This particular vellum comes as a roll; we kept it on the roll and cut it to 4" W. Mylar or frosted plexiglass could also be used in place of the vellum, but the camera software detection settings would need to be adjusted. |
| Logitech HD Pro Webcam C920, 1080p | Amazon | Approximate Price: $50 | |
| Mobile Laptop Computer Desk Cart Height-Adjustable | Amazon | Approximate Price: $40 Small table to place the animals' home cage on at the end of the walkway. |
|
| Plastic ramp | Pets Warehouse | Approximate Price: $6 Optional: Ramp to assist the animals descend into home cage |
|
| RetiCAM Tabletop Tripod with 3-Way Pan/Tilt Head | Amazon | Approximate Price: $30 | |
| SCIGRIP #16 solvent cement for acrylic - clear, medium bodied | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Plexiglass table | Approximate Price: $ | ||
| 15 series 80/20 framing pieces, 1.5" x 1.5" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1515 | Approximate Price: $110 6 pieces cut to 36" L, 2 pieces cut to 12" With both ends tapped with standard 5/16-18 threads Framing for the plexiglass table top and table legs |
| 15 series 3 Way - Light Squared Corner Connector | 80/20 Inc. | 14177 | Approximate Price: $24 4 connectors To connect the table top and legs |
| 1/4" clear plexiglass sheet | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 Cut at 15" W x 39" L |
|
| 5/16-18 x 1" Button Head Socket Cap Screw | 80/20 Inc. | 3118 | Approximate Price: $5 Quantity = 12 |
| Deluxe Leveling Feet, 5/16-18 x 2" | 80/20 Inc. | 2194 | Approximate Price: $50 Quantity = 4 For table legs |
| “T” Handle Ball End Hex Wrench, 3/16" | 80/20 Inc. | 6000 | Approximate Price: $5 |
References
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Lee, H. Y., Hsieh, T. H., Liang, J. I., Yeh, M. L., Chen, J. J. Quantitative video-based gait pattern analysis for hemiparkinsonian rats. Medical & Biological Engineering & Computing. 50 (9), 937-946 (2012).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson’s disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Batka, R. J., Brown, T. J., Mcmillan, K. P., Meadows, R. M., Jones, K. J., Haulcomb, M. M. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical Record. 297 (10), 1839-1864 (2014).
- Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. W. Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson’s disease or amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Motor Behavior. 40 (6), 568-577 (2008).
- Williams, M. T., et al. Kaolin-induced ventriculomegaly at weaning produces long-term learning, memory, and motor deficits in rats. International Journal of Developmental Neuroscience. 35, 7-15 (2014).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Kloefkorn, H. E., et al. Automated Gait Analysis Through Hues and Areas (AGATHA): A Method to Characterize the Spatiotemporal Pattern of Rat Gait. Annals of Biomedical Engineering. 45 (3), 711-725 (2017).
- Pereira, J. E., et al. A comparison analysis of hindlimb kinematics during overground and treadmill locomotion in rats. Behavioural Brain Research. 172 (2), 212-218 (2006).
- Nakamura, A., et al. Low-cost three-dimensional gait analysis system for mice with an infrared depth sensor. Neuroscience Research. 100, 55-62 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Mendes, C. S., Bartos, I., Márka, Z., Akay, T., Márka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (50), (2015).
- Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
- Duty, S., Jenner, P. Animal models of Parkinson’s disease: a source of novel treatments and clues to the cause of the disease. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1357-1391 (2011).
- Kulkarni, S. K., Bishnoi, M., Chopra, K. In vivo microdialysis studies of striatal level of neurotransmitters after haloperidol and chlorpromazine administration. Indian Journal of Experimental Biology. 47 (2), 91-97 (2009).
- Jain, N. S., Tandi, L., Verma, L. Contribution of the central histaminergic transmission in the cataleptic and neuroleptic effects of haloperidol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 139 (Part A), 59-66 (2015).
- Steinpreis, R. E., Anders, K. A., Branda, E. M., Kruschel, C. K. The Effects of Atypical Antipsychotics and Phencyclidine (PCP) on Rotorod Performance. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 63 (3), 387-394 (1999).
- Baptista, P. P. A., et al. Physical exercise down-regulated locomotor side effects induced by haloperidol treatment in Wistar rats. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 104, 113-118 (2013).
- Chuang, C. S., Su, H. L., Cheng, F. C., Hsu, S., Chuang, C. F., Liu, C. S. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson’s disease. Journal of Biomedical Science. 17 (9), (2010).
- Bugalho, P., Alves, L., Miguel, R. Gait dysfunction in Parkinson’s disease and normal pressure hydrocephalus: a comparative study. Journal of Neural Transmission. 120 (8), 1201-1207 (2013).
- Bradski, G. The OpenCV Library. , (2000).
- Chen, H., Du, J., Zhang, Y., Barnes, K., Jia, X. Establishing a Reliable Gait Evaluation Method for Rodent Studies. Journal of Neuroscience Methods. 283, 92-100 (2017).
- De Ryck, M., Hruska, R. E., Silbergeld, E. K. Estrogen and haloperidol-induced versus handling-related catalepsy in male rats. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 17 (5), 1027-1035 (1982).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic Characterization of Speed-Associated Gait Changes in Mice Reveals Modular Organization of Locomotor Networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- De Ryck, M., Schallert, T., Teitelbaum, P. Morphine versus haloperidol catalepsy in the rat: a behavioral analysis of postural support mechanisms. Brain Research. 201 (1), 143-172 (1980).
