Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En Mikrovæskebasert plattform for stimulerende chondrocytes med dynamisk kompresjon

Published: September 13, 2019 doi: 10.3791/59676
Automatic Translation
1, 2, 1, 3,4
1Department of Genetics, Cell Biology and Anatomy, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, 3Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 4Nebraska Center for Materials and Nanoscience, University of Nebraska-Lincoln

Summary

Denne artikkelen inneholder detaljerte metoder for fabrikere og karakteriserer en pneumatisk actuating mikrovæskebasert enhet for chondrocyte komprimering.

Abstract

Mekaniske stimuli er kjent for å modulere biologiske funksjoner av celler og vev. Nyere studier har antydet at kompresjons stress endrer vekst plate brusk arkitektur og resultater i vekst modulering av lange bein av barn. For å bestemme hvilken rolle kompresjons stress i bein vekst, skapte vi en mikrovæskebasert enhet betjenes av pneumatisk trykk, til dynamisk (eller statisk) komprimere vekst plate chondrocytes innebygd i alginat hydrogel sylindere. I denne artikkelen beskriver vi detaljerte metoder for fabrikere og karakteriserer av denne enheten. Fordelene med vår protokoll er: 1) fem forskjellige magnitudes av kompresjons stress kan genereres på fem tekniske replikerer i en enkelt plattform, 2) det er lett å visualisere celle morfologi via en konvensjonell lys mikroskop, 3) celler kan raskt isoleres fra enheten etter komprimering for å lette nedstrøms analyser, og 4) plattformen kan brukes til å studere mechanobiology av enhver celle type som kan vokse i hydrogeler.

Introduction

Mikro-konstruert plattformer er verdifulle verktøy for å studere molekylær, cellular, og vev nivå biologi fordi de gir dynamisk kontroll av både fysiske og kjemiske microenvironments1,2,3 ,4,5,6,7,8. Dermed kan flere hypoteser testes samtidig på en strengt kontrollert måte. I tilfelle av vekst plate brusk, det er økende bevis på en viktig rolle kompresjons stress i modulerende bein vekst gjennom aksjon på veksten plate brusk9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Men virkningsmekanismen av kompresjons stress – spesielt, hvordan stress guider dannelsen av chondrocyte søyler i vekst platen – er dårlig forstått.

Målet med denne protokollen er å skape en pneumatisk actuating mikrovæskebasert chondrocyte komprimering enhet26 til belyse mekanismer for mechanobiology i vekst plate chondrocytes (figur 1a-c). Enheten består av to deler: den pneumatiske aktiverings enheten og den alginat gel. Den mikrovæskebasert pneumatiske aktiverings enheten er fabrikkert ved hjelp av Polydimethylsiloxan (PDMS) basert på foto-og Soft-litografi. Denne enheten inneholder en 5 x 5 rekke tynne PDMS membran ballonger som kan blåses opp forskjellig basert på deres diameter. Den alginat gel konstruere består av chondrocytes innebygd i en 5 x 5 rekke alginat gel sylindere, og hele alginat-chondrocyte konstruksjoner er montert med aktivering enhet. De alginat gel konstruerer er komprimert av pneumatisk oppblåst PDMS ballonger (figur 1B). Den mikrovæskebasert enheten kan generere fem forskjellige nivåer av kompresjons stress samtidig i en enkelt plattform basert på forskjeller i PDMS ballong diameter. En høy gjennomstrømmings test av chondrocyte mechanobiology under flere kompresjonsforhold er således mulig.

Mikrovæskebasert-enheten som beskrives i denne protokollen, har mange fordeler i forhold til den konvensjonelle komprimerings enheten, for eksempel eksterne fixators14,21,23 og makroskopisk komprimerings enheter16, 19 andre priser , 27 andre priser , 28 for å studere chondrocyte mechanobiology: 1) mikrovæskebasert enheten er kostnadseffektiv fordi den bruker mindre volum av prøver enn makroskopisk komprimerings enhet, 2) mikrovæskebasert enheten er tid effektiv fordi den kan teste flere kompresjonsforhold samtidig, 3) den mikrovæskebasert enheten kan kombinere mekaniske og kjemiske stimuli ved å danne en konsentrasjon gradient av kjemikalier basert på begrenset miksing i microchannels, og 4) ulike mikroskopi teknikker (time-lapse mikroskopi og fluorescens konfokalmikroskopi mikroskopi) kan påføres med mikrovæskebasert enhet laget av transparent PDMS.

Vi vedtok og modifisert metoden for Moraes et al.7,29 for å skape ulike kompresjons stress nivåer i en enkelt enhet for å muliggjøre høy gjennomstrømming mechanobiology studier av chondrocyte kompresjon. Vår tilnærming er hensiktsmessig for celler (f. eks, chondrocytes) som trenger tre-dimensjonale (3D) kulturmiljø og for biologiske analyser etter komprimere celler. Selv om noen mikrovæskebasert celle komprimerings enheter kan komprimere celler kultivert på to-dimensjonale (2D) underlag30,31,32, kan de ikke brukes til chondrocytes fordi 2D kultivert chondrocytes dedifferentiate. Det er mikrovæskebasert plattformer for å komprimere 3D kulturperler celler i photopolymerized hydrogeler7,33, men de er begrenset i isolere celler etter komprimering eksperimenter fordi isolere celler fra photopolymerized hydrogel er ikke lett. I tillegg kan effektene av ultrafiolett (UV) eksponering og foto Cross Linking initiativtakerne på celler må evalueres. I kontrast, vår metode tillater rask isolering av celler etter komprimering eksperimenter for innlegg biologiske analyser fordi alginat hydrogeler kan depolymeriseres raskt av kalsium chelater. De detaljerte metodene for fremstilling og karakterisering av enheter er beskrevet i denne protokollen. En kort prosedyre for fabrikere av mikrovæskebasert chondrocyte komprimerings enhet vises i figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Bruk personlig verneutstyr (PPE) som hansker og Laboratoriefrakk for hvert trinn i denne protokollen.

1. master mold fabrikasjon

Merk: Utfør trinn 1,1-1,3 i en avtrekks hette.

  1. Glass behandling
    Merk: Bruk et ansiktsskjerm, hansker og en Laboratoriefrakk for trinn 1,1.
    1. Make Piranha Solution (60 mL) ved å blande svovelsyre (H2så4) og hydrogen peroxide (h2O2) med et volumforhold på 3:1.
      FORSIKTIG: ikke bruk Piranha-oppløsning og aceton i samme avtrekks hette på grunn av eksplosjonsfare.
    2. Plasser en glassplate (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) i Piranha-løsning i 30 minutter ved 40 ° c.
    3. Skyll glassplaten med deionisert vann (di2O).
    4. Plasser glassplaten i aceton ved romtemperatur i 10 minutter.
    5. Skyll glassplaten med isopropanol og tørk den med nitrogen (N2) gass.
    6. Stek glassplaten ved 200 ° c i 20 min på en kokeplate. Alle påfølgende baking trinn bruke en varm plate.
  2. SU-8 frø lag formasjon på glassplaten
    1. Spre SU-8 5 på glassplaten med en en gangs pipette for å dekke rundt 2/3 av platens overflateareal.
    2. Spinn glassplaten med SU-8 5 photoresists ved 500 RPM for 35 s (første spinning syklus) og deretter 2 500 RPM for 40 s (siste spinning syklus) ved hjelp av en spin elektrostatisk. Alle påfølgende spin coating trinn inkluderer den samme første spinning syklus.
    3. Stek SU-8 5 belagt glassplate ved 65 ° c i 2 min og deretter ved 95 ° c i 5 min.
    4. Utsett SU-8 5 belagt glassplate for UV-lys (60 mW/cm2, avstanden mellom UV-lampen og photomask er 20 cm, total mengde UV-lys energi = 60 mJ/cm2) for 1 s.
      Merk: UV eksponeringstiden bør justeres i henhold til kraften i et brukt UV-lys.
    5. Stek SU-8 5 belagt glassplate ved 65 ° c i 2 min og ved 95 ° c i 5 min.
    6. Plasser bakt glassplate i SU-8 utbygger i 2 min.
    7. Stek SU-8 5 belagt glass ved 180 ° c i 20 min.
  3. SU-8-kanals mønster fabrikasjon ved hjelp av foto litografi (fig. 2a trinn 1-3)
    1. Hell SU-8 100 på SU-8 5 seeded glassplate for å dekke rundt 2/3 av tallerkenen overflateareal.
    2. Snurr glassplaten med SU-8 100 ved 3 000 RPM for 38 s (≈ 90 μm tykk).
    3. Stek SU-8 100 belagt glassplate ved 65 ° c i 10 min og deretter ved 95 ° c i 30 min. Hvis SU-8 100 er fortsatt klebrig etter denne prosedyren, bake glassplaten for en lengre tid ved 95 ° c til SU-8 100 blir ikke-klebrig.
    4. Plasser en høyoppløselig MicroChannel photomask (25 400 dpi, se supplerende figur 1) på SU-8 100 belagt glassplate og utsett den photomask dekket glassplaten til UV-lys for 4 s (total mengde UV-lys energi = 240 mJ/cm2).
      Merk: UV eksponeringstiden bør justeres i henhold til kraften i et brukt UV-lys.
    5. Fjern photomask fra glassplaten og stek glassplaten ved 65 ° c i 2 min og deretter 95 ° c i 20 min.
    6. Hold bakt glassplate i en container, som er innpakket med aluminiumsfolie for å blokkere noe lys, for natten herding.
    7. Utvikle SU-8 100 kanal mønstre på glassplaten i SU-8-utvikleren i 15 minutter.
    8. Vask SU-8 mønstret glassplate (Master mold) med isopropylalkohol alkohol og tørk den med N2 gass. Hvis det fortsatt er hvite partikler under denne prosessen, gjentar du trinn 7 i 5 minutter.

2. pneumatisk aktiverings enhet

  1. MicroChannel lag (lag 1)
    Merk: Utfør trinn 2.1.1-2.1.2 i en avtrekks hette.
    1. Drop 200 μL av (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl) -1-Trichlorosilane på en dekkglass og plassere den i et vakuum kammer med Master mold.
    2. Påfør vakuum for 2 min i kammeret og vente i 6 timer (eller over natten) for silanisering av mold.
    3. Bland PDMS med et vekt forhold på 10:1 (prepolymer: herding agent) i 5 min.
      Merk: alle påfølgende PDMS avstøpning trinn inneholder samme prepolymer og herding agent vekt forhold (10:1).
    4. Hell PDMS på master mold og Degas PDMS i et vakuum kammer i 30 min.
    5. Sandwich PDMS med et stykke åpenhet film.
    6. Klem den over klemt forsamlingen med en glassplate, skum puter og plexiglass plater (figur 2a trinn 4).
    7. Cure PDMS i en ovn ved 80 ° c for 6 h.
    8. Isoler PDMS-laget (lag 1) med transparent filmen fra den klemt strukturen (figur 2a trinn 5).
    9. Aktiver overflater på lag 1 og en ren glassplate (glassplate 1; 50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) med en plasma renere i 1 min.
      Merk: plasma rense tiden kan variere avhengig av kraften i en brukt plasma renere.
    10. Bond Layer 1 på glass plate 1 og legg dem i ovnen ved 80 ° c i 30 min.
    11. Fjern transparent filmen fra lag 1.
  2. Tynn PDMS-membran (lag 2)
    1. Spin coat uherdet PDMS på en transparentfilm på 1 000 RPM i 1 min for å få en 60 μm tykt PDMS lag.
    2. Delvis kur spin belagt PDMS (Layer 2) i ovnen ved 80 ° c for 20-30 min.
    3. Aktiver Layer 1 på glass plate 1 og Layer 2 ved hjelp av plasma renere i 1 min.
      Merk: plasma rense tiden kan variere avhengig av kraften i en brukt plasma renere.
    4. Bond Layer 2 til Layer 1 og legg dem i ovnen ved 80 ° c over natten.
  3. Rør blokk
    1. Plasser metallrør vertikalt på en Petri parabolen.
    2. Hell forsiktig PDMS i fatet for å senke ca 3/4 av metall rørene.
    3. Cure PDMS i ovnen ved 60 ° c i 6 timer (eller over natten).
    4. Skjær et stykke PDMS blokk som inneholder ett metallrør.
    5. Punch et hull på Layer 2 for innløpet.
    6. Aktiver PDMS-blokken og Layer 2 ved hjelp av plasma renere i 1 min.
    7. Fest PDMS-blokken på inntaksdelen av Layer 2 og plasser hele aktiverings enheten i ovnen ved 80 ° c over natten.

3. alginat-chondrocyte (eller perle) konstruksjoner

  1. Silanized glassplate
    1. Skjær en glassplate (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) i to halv-sized glassplater (50,8 mm × 38,1 mm × 1,2 mm) ved hjelp av en diamant scriber.
    2. Plasser glass platene i 0,2 M Hydrogenklorid (HCl) og rist forsiktig (f.eks. 55 RPM) dem over natten.
    3. Skyll glass platene med di2O.
    4. Rist glass platene i 0,1 M natriumhydroksid (NaOH) i 1 time ved 55 RPM og skyll dem med di2O.
    5. Rist glass platene i 1% (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) for 1 t ved 55 RPM og skyll dem med di2O.
    6. Tørk de silanized glass platene i en avtrekks hette over natten.
  2. Agarose gel mold for alginat gel konstruksjoner
    1. Bland 5% (w/v) agarose og 200 mM kalsiumklorid (CaCl2) i di2O.
    2. Kok den agarose gel-løsningen med en mikrobølgeovn (eller en kokeplate). Koketiden varierer basert på volumet av den agarose gel løsning og kraften i mikrobølgeovnen (eller temperaturen på den varmeplaten).
    3. Hell kokt agarose gel-løsningen på en aluminiums form (se supplerende figur S2), og smør den med en glassplate.
    4. Vent i 5 min og unmold den befestet agarose gel fra aluminium mold.
  3. Vekst plate chondrocyte innhøsting
    1. Isoler vekst platene fra bakbena på nyfødte mus.
    2. Plasser vekst platene i 1 mL 0,25% kollagenase for 3 timer i en inkubator ved 37 ° c og 8% karbondioksid (CO2), for å fjerne ekstracellulære MATRISE (ECM).
    3. Sentrifuger den fordøyd prøven i 5 min på 125 x g for å lage en chondrocyte pellet og fjerne supernatanten fra prøven. Her er 1 x g akselerasjonen av tyngdekraften.
    4. Resuspend den chondrocyte pellet i 1 mL av Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM).
    5. Tell antall chondrocytes i DMEM ved hjelp av en celle teller.
    6. Sentrifuger chondrocytes i DMEM i 5 min ved 125 x g for å lage en chondrocyte pellet igjen og fjerne supernatanten fra prøven.
    7. Alternativt, resuspend den chondrocyte pellet i chondrocyte kultur Media (CCM)34 inneholder 2 ΜM calcein am, og ruge prøven ved 37 ° c i 30 min. Gjenta trinn 3.3.6 og gå til trinn 3.3.8.
    8. Resuspend den chondrocyte pellet i et ønsket volum av CCM og oppbevar dem i inkubator ved 37 ° c og 8% CO2 før bruk.
  4. Alginat-chondrocyte (eller perle) konstruksjoner (figur 2C)
    1. Bland 1,5% (w/v) alginat i fosfat-bufret saltvann (PBS) med 5 mg/mL sulfo-NHS, 10 mg/mL 1-etanol-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC).
    2. Tilsett 8 x 106 chondrocytes i 1 ml alginat gel løsning [eller tilsett 3 μL av 1 μm-diameter fluorescerende perler (542/612 NM) i 1 ml alginat gel løsning (0,3% (v/v))].
    3. Plasser 150 μL av alginat-chondrocyte (eller perle) løsningen på silanized glassplate fabrikkert i trinn 3,1.
    4. Dekk alginat gel løsning med agarose gel mold i 3 min.
    5. Fjern overdreven alginat gel løsning overfylte fra agarose gel mold med en barberhøvel blad og fjerne agarose gel mold. Deretter er sylindriske alginat-chondrocyte (eller perle) konstruksjoner oppnås på amino-silanized glassplate.
    6. Plasser alginat-chondrocyte konstruksjoner i krysskobling løsning (50 mM CaCl2 /140 mm NaCl i di2O) i 1 min for videre polymerisering.

4. enhets montering (figur 2D)

Merk: PDMS avstandsstykker og 3D trykte klemmer må utarbeides separat.

  1. Finn fire 1 mm tykke PDMS-avstandsstykker på de fire hjørnene av lag 2 på aktiverings enheten.
  2. Plasser 700 μL av CCM for å dekke luftkamrene i Layer 2.
  3. Plasser alginat-chondrocyte (eller perle) konstruksjoner på lag 2 mens du forsiktig samkjøre konstruksjoner med luft kamre.
  4. Klem enheten med 3D-trykte klemmer (figur 1C).

5. aktivering av enheten

  1. Koble utløpet av en luft pumpe (se tabell over materialer) med innløpet til en magnetventil med en silisium slange.
  2. Koble utløpet av magnetventilen med innløpet til den monterte enheten med en silisium slange.
  3. Koble magnetventilen med en funksjonsgenerator.
  4. Manipulere magnetventilen med en firkantbølge (f. eks 1 Hz) generert av funksjons generatoren.
  5. Slå på luft pumpen for å betjene enheten pneumatisk.

6. Imaging av chondrocytes i enheten

Merk: for å få en god bildekvalitet, bilde chondrocytes (eller fluorescerende perler) i alginat gel gjennom glass plate 2 fordi utvidet PDMS ballonger og luft kamre kan forvrenge optiske bilder. Hvis det brukes et omvendt mikroskop for bildebehandling, må enheten settes opp slik at glass plate 2 vender nedover.

  1. Klargjør enheten med chondrocytes (eller fluorescerende perler) som vist i tidligere seksjoner.
  2. Ta z-stack bilder av chondrocytes (eller fluorescerende perler) med en konfokalmikroskopi mikroskop før og under komprimering, henholdsvis. Velg en z-trinns størrelse basert på felt dybden i et brukt konfokalmikroskopi bildesystem.
  3. Høyden av chondrocytes (eller en alginat-bead konstruere) kan måles med automatisk bildebehandling metoden vist i forrige litteratur26,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne artikkelen viser detaljert fremgangsmåte for mikrovæskebasert chondrocyte komprimering enhet fabrikasjon (figur 2). Enheten inneholder en 5 x 5 arrays av sylindriske alginat-chondrocyte konstruksjoner, og disse konstruksjoner kan komprimeres med fem forskjellige magnitudes av kompresjon (figur 1, Figur 3 og Figur 4). Høyden på den pneumatiske MicroChannel er rundt 90 μm, og PDMS ballong diametere er henholdsvis 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 og 2,0 mm. Ytelsen til enheten ble kvantifisert med konfokalmikroskopi mikroskopi med statiske kompresjonsforhold og bildebehandling. Statisk komprimering ble brukt for mikroskopisk bildebehandling fordi z-stakken Imaging med konfokalmikroskopi mikroskopi tar noen minutter, så det er for tregt for kvantitativ bildebehandling under dynamisk komprimering.

Figur 3a viser 5 × 5 matriser av alginat hydrogel kolonner (diameter: ~ 0,8 mm, høyde: ~ 1 mm) støpt på glass plate 2. Disse gel konstruksjoner ble avbildet ved å legge fluorescerende perler i gel. Figur 3b viser en eksempel sak som gel-kolonnen ble komprimert med 33,8% i høyden av den største PDMS-ballongen. Den resulterende kompresjons belastningen av gel konstruksjoner økte med ca 5% per 0,2 mm økning i PDMS ballongen diameter som vist i figur 3c.

Kompresjons deformasjon av chondrocytes ble bestemt ved å Imaging cellene i en 613 μm × 613 μm × 40 – 55 μm (x × y × z) volum nær gel konstruere Center som vist i figur 4a. Figur 1d viser et eksempel bilde av en chondrocyte som ble komprimert med 16% av den største PDMS-ballongen. Figur 4b viser fordelingen av de målte belastnings verdiene for celle komprimering, og de samlede cellene ble komprimert mer av større PDMS-ballonger. Derfor ble mengden av alginat gel-og chondrocyte-kompresjon kontrollert av diameteren til PDMS-ballonger (Figur 3 og Figur 4) med et konstant trykk på 14 kPa.

Figure 1
Figur 1. Mikrovæskebasert chondrocyte komprimering enhet.
(a) skjematisk av den monterte enheten. En 5 × 5 rekke alginat-chondrocyte konstruksjoner er justert på PDMS ballonger med 5 forskjellige diametre (D = 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 og 2,0 mm), der D er diameteren på PDMS ballong (eller luftkammer). (b) skjematisk bruk av apparatet. Enheten betjenes med trykkluft trykk som utvider PDMS-ballonger. (c) bilde av en faktisk enhet (mynt diameter = 19 mm). (d) vertikale tverrsnitt av en chondrocyte før (venstre) og under (høyre) komprimering på den største PDMS-ballongen (d = 2,0 mm) (celle kompresjons belastning, ε-celle = | cellehøyde endring/innledende cellehøyde | x 100 = 16%). Dette tallet er gjengitt fra 26.

Figure 2
Figur 2. Detaljert fremgangsmåte for mikrovæskebasert chondrocyte komprimering enhet fabrikasjon.
(a) Foto litografi for å generere en Su-8 Master mold og følgende myke litografi for å skape PDMS lag med pneumatiske Microchannels (Layer 1). (b) Thin PDMS membran (lag 2) på en transparentfilm generert av Spin coating. (c) sylindrisk alginat gel avstøpning metode på glass (glassplate 2). (d) montering av mikrovæskebasert chondrocyte kompresjons apparat. Dette tallet er gjengitt fra 26. Vennligst klikk her for å laste ned en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Måling av alginat gel deformasjon under statisk kompresjon.
(a) 5 x 5 arrayer av sylindriske alginat gel konstruksjoner (diameter: ~ 800 μm, høyde: ~ 1 mm). (b) alginat gel komprimert av den største PDMS ballongen (D = 2,0 mm). Kompresjons belastningen av alginat gel er 33,8%. (c) kompresjons stamme av alginat gel (εgel) øker rundt 5% per 0,2 mm økning av PDMS ballong diameter (D). Feil linje: standardavvik. Rød linje: lineær monterings linje dette tallet gjengis fra 26.

Figure 4
Figur 4. Måling av chondrocyte deformasjon under statisk kompresjon.
(a) en z-stack bilde [613 μm × 613 μm × 40 – 55 μm (x × y × z)] ble innhentet i midten av gel konstruere, 300-400 μm fra gel bunnen. (b) forskjellige magnitudes av chondrocyte kompresjons stamme (εcelle) resulterte som en funksjon av PDMS ballong diameter (D). Icon : Mean verdier. Icon : hvert datapunkt. De øverste (eller nederste) og midterste linjene i boksen er henholdsvis standardavviket og medianverdi. Dette tallet er gjengitt fra 26.

Figur S1. MicroChannel photomask design for trinn 1.3.4 (enhet = mm). Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Figur S2. Aluminum mold design for trinn 3.2.3 (enhet = mm). Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Figur S3. Permanent deformasjon av alginat gel (1,5%, w/v) under 1 t-lang dynamisk (1 Hz) og statisk kompresjon. Dette tallet er gjengitt fra 26. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å teste effekten av kompresjons stress på vekst plate chondrocytes, utviklet vi mikrovæskebasert chondrocyte komprimerings enhet (figur 1) for å bruke ulike nivåer av kompresjons stress til chondrocytes i alginat hydrogel stillaset for 3D kultur i høy gjennomstrømming måter. For å hjelpe andre forskere med å ta i mot enheten vår eller utvikle lignende enheter, leverte vi detaljer om fremgangsmåten for enhets fabrikasjon i denne protokoll artikkelen.

De avgjørende trinnene i denne protokollen er 1) fabrikere PDMS lag med pneumatiske microchannels (Layer 1) uten luftbobler siden luftbobler i Layer 1 kan skade pneumatiske microchannels mens bakside gjennomsiktig film er skrelles av, 2) opprettholde en konstant temperatur (for eksempel 80 ° c) for herding PDMS ballonger (Layer 2) fordi elastisiteten av PDMS er kjent for å avhenge av herding temperatur36, 3) samkjøre den alginat gel KONSTRUKSJONER med PDMS ballonger, og 4) ved hjelp av fersk amino-silanized glass platen (glass plate 2) for liming av alginat gel søyler på glass plate 2 innen to dager etter forsaltning behandling.

Det større begrensningen av denne protokollen er det alt det er en relativt arbeidskrevende å dikte apparatet fordi prosessen medfører Foto litografi og mangfoldig skritt av bløt litografi. I tillegg til utførelsen av mikrovæskebasert celle komprimerings enheter fabrikkert basert på vår protokoll må evalueres når ulike typer hydrogeler og celler brukes. Dette er fordi noen forskjeller i de mekaniske egenskapene til hydrogeler og celler vil påvirke enhetens ytelse.

Selv om vår mikrovæskebasert celle komprimerings enhet er for å bruke dynamisk kompresjon til chondrocytes, ble ytelsen evaluert av Imaging statisk komprimerte alginat gels og celler. Dette er fordi det var vanskelig å image gels og celler under dynamisk kompresjon med konvensjonelle konfokalmikroskopi mikroskopi. Vi sammenlignet statisk (14 kPa, 1 t) og dynamisk kompresjon (14 kPa, 1 Hz, 1 h) når det gjelder den permanente deformasjon av alginat gel, og fant at den permanente deformasjon av gelen under den dynamiske komprimeringen var ubetydelig sammenlignet med den statiske komprimeringen (se Supplerende figur S3).

En fordel med vår metode er at den kan brukes til andre celletyper som trenger 3D kulturmiljø. Den resulterende komprimering av enheten kan være modulert avhengig av programmer ved å endre diameter og tykkelse på PDMS ballonger og/eller trykket i ballongen. Det er også mulig å endre elastisiteten i PDMS-ballongen ved å justere blandingsforholdet mellom prepolymer og herding. Celler i denne enheten kan bli avbildet i sanntid ved hjelp av lys/fluorescens mikroskopi, og enheten kan raskt demonteres for celle innhøsting for å muliggjøre nedstrøms analyse. En annen fordel er evnen til å generere fem distinkte mekaniske stress nivåer med fem tekniske replikerer per hvert stressnivå ved hjelp av en enkelt enhet. Kombinere replikering og en dose-respons analyse sikrer en høy grad av rigor og reproduserbarhet i resultatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker DRS. Christopher Moraes og Stephen A. Morin for deres støtte til enheten design og fabrikasjon. Denne studien ble støttet av bioteknologi for Human Health stipend fra University of Nebraska-Lincoln (UNL) og University of Nebraska Medical Center (UNMC), og gi AR070242 fra NIH/NIAMS. Vi takker Janice A. Taylor og James R. Talaska av Advanced mikroskopi Core Facility ved University of Nebraska Medical Center for å gi assistanse med konfokalmikroskopi mikroskopi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) Sigma-Aldrich 741442-100ML
(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane United Chemical Technologies T2492-KG
Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K354
Air pump Schwarzer Precision SP 500 EC-LC4.5V DC We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.
Alginate powder FMC Corporation Pronova UP MVG
Barb Straight Connectors (Metal tube) Pneumadyne EB40-250
Calcein AM Invitrogen C3100MP
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Dyed red aqueous fluorescent particles Thermo Fisher Scientific R0100
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) Thermo Fisher Scientific 22980
Foam pad GRAINGER Item # 5GCE8
Function / Arbitrary Waveform Generator Keysight Technologies 33210A
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144-500
Hydrogen peroxide Fisher BioReagents BP2633500
Isopropyl alcohol BDH1174-4LP VWR
Microscope slides Thermo Fisher Scientific 22-267-013
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Power supply Keysight Technologies E3630A
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Sodium hydroxide Fisher Chemical S318-1
Solenoid manifold Pneumadyne MSV10-1
Solenoid valve Pneumadyne S10MM-30-12-3
Spin coater Laurell Technologies WS-650Mz-23NPPB
SU8 Developer MicroChem Corp. Y020100 4000L1PE
SU8-100 MicroChem Corp. Y131273 0500L1GL
SU8-5 MicroChem Corp. Y131252 0500L1GL
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Thermo Fisher Scientific 24510
Sulfuric acid EMD Millipore MSX12445

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
  2. Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
  3. Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
  4. García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  5. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  6. Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
  7. Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
  8. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
  9. Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
  10. Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
  11. Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
  12. Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
  13. Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
  14. Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
  15. Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
  16. Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
  17. Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
  18. Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
  19. Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
  20. Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
  21. Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
  22. Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
  23. Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
  24. Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
  25. Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
  26. Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
  27. Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
  28. Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
  29. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
  30. Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
  31. Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
  32. Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
  33. Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
  34. Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
  35. Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
  36. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).

Tags

Bioteknologi materialer foto litografi myk litografi vekst plate chondrocytes mechanobiology celle mekanikk alginat hydrogel konfokalmikroskopi mikroskopi bildeanalyse
En Mikrovæskebasert plattform for stimulerende chondrocytes med dynamisk kompresjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Erickson, A., Dudley, A.… More

Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression. J. Vis. Exp. (151), e59676, doi:10.3791/59676 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter