Summary
Bu makalede, kondrosit sıkıştırma için pnömatik olarak mikroakışkan bir cihaz imal etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı yöntemler sağlanmıştır.
Abstract
Mekanik uyaranların hücre ve dokuların biyolojik fonksiyonlarını modüle etmek için bilinmektedir. Son çalışmalar, kompresif stresin büyüme plakası kıkırdak mimarisini değiştirdiğini ve çocukların uzun kemiklerinin büyüme modülasyonuna neden olduğunu ileri sürmüştür. Kemik büyümesinde kompresif stresin rolünü belirlemek için, aljinat hidrojel silindirlerine gömülü büyüme plakası kondrositlerini dinamik (veya statik olarak) sıkıştırmak için pnömatik basınçla aktive edilmiş mikroakışkan bir cihaz oluşturduk. Bu makalede, bu aygıtın üretilmesi ve karakterizasyonu için ayrıntılı yöntemler açıklanmıştır. Protokolümüzün avantajları şunlardır: 1) Beş farklı basınç büyüklüğü tek bir platformda beş teknik kopyada oluşturulabilir, 2) Geleneksel ışık mikroskobu ile hücre morfolojisini görselleştirmek kolaydır, 3) Hücreler hızla izole edilebilir sıkıştırma sonrası cihazdan aşağı tahlilleri kolaylaştırmak için, ve 4) Platform hidrojellerde büyüyebilir herhangi bir hücre tipi nin mekanobiyoloji çalışma için uygulanabilir.
Introduction
Mikro-mühendislik platformları moleküler, hücresel ve doku düzeyi biyolojisini incelemek için değerli araçlardır çünkü hem fiziksel hem de kimyasal mikroortamların dinamik kontrolünü sağlarlar1,2,3 ,4,5,6,7,8. Böylece, birden fazla hipotez aynı anda sıkı bir şekilde test edilebilir. Büyüme plaka kıkırdağı durumunda, büyüme plaka kıkırdak9,10,11eylem yoluyla kemik büyümesi modüle kompresör stres önemli bir rol artan kanıtlar vardır, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Ancak, kompresif stres eylem mekanizması - özellikle, nasıl stres büyüme plaka kondrosit sütunoluşumunu yönlendirir - kötü anlaşılmaktadır.
Bu protokolün amacı, büyüme plakası kondrositlerde mekanobiyolojinin mekanizmalarını açıklamak için pnömatik olarak harekete geçirici mikroakışkan kondrosit kompresyon cihazı26 oluşturmaktır (Şekil 1a-c). Cihaz iki bölümden oluşur: pnömatik aktüasyon ünitesi ve aljinat jel yapı. Mikroakışkan pnömatik aktüasyon ünitesi foto- ve yumuşak litografiye dayalı polidimetilsiloksane (PDMS) kullanılarak imal edilmistir. Bu ünite, çaplarına göre farklı şekilde şişirilebilen 5 x 5 dizi ince PDMS membran balon içerir. Aljinat jel yapısı aljinat jel silindir5 x 5 dizi gömülü kondrositoluşur, ve tüm aljinat-kondrosit yapıları aktüasyon ünitesi ile monte edilir. Aljinat jel yapıları pnömatik şişirilmiş PDMS balonları tarafından sıkıştırılır(Şekil 1b). Mikroakışkan cihaz, PDMS balon çapındaki farklılıklara bağlı olarak tek bir platformda aynı anda beş farklı düzeyde sıkıştırma oluşturabilir. Böylece birden fazla sıkıştırma koşullarında kondrosit mekanobiyolojisinin yüksek iş gücü testi mümkündür.
Bu protokolde tanımlanan mikroakışkan cihaz, dış fiksatörler14, 21,23 ve makroskopik sıkıştırma cihazları16gibi konvansiyonel sıkıştırma cihazına göre birçok avantaja sahiptir. 19.09.20 , 27.000 , 28 kondrosit mekanobiyolojisi çalışmak için: 1) Mikroakışkan cihaz, makroskopik sıkıştırma cihazından daha az miktarda numune tükettiği için uygun maliyetlidir, 2) Mikroakışkan cihaz zaman etkilidir, çünkü birden fazla test edebilir sıkıştırma koşulları aynı anda, 3) Mikroakışkan cihaz, mikrokanallardaki sınırlı karıştırmaya dayalı kimyasalların konsantrasyon gradyanı oluşturarak mekanik ve kimyasal uyaranları birleştirebilir ve 4) Çeşitli mikroskopi teknikleri (zaman atlamalı mikroskopi ve floresan konfokal mikroskopi) şeffaf PDMS'den yapılmış mikroakışkan cihaz ile uygulanabilir.
Biz kabul ve kondrosit sıkıştırma yüksek iş letme mechanobiology çalışmaları sağlamak için tek bir cihazda farklı kompresif stres düzeyleri oluşturmak için Moraes ve ark.7,29 yöntemini değiştirdi. Yaklaşımımız, üç boyutlu (3D) kültür ortamına ihtiyaç duyan hücreler (örneğin kondrositler) ve hücreleri sıkıştırdıktan sonra biyolojik tahliller için uygundur. Bazı mikroakışkan hücre sıkıştırma cihazları iki boyutlu (2D) yüzeylerde kültürlenmiş hücreleri sıkıştırabilse de30,31,32, 2D kültürlü kondrositler için kullanılamazlar, çünkü 2D kültürlü kondrositler defarklılaştırma. Fotopolimerize hidrojeller7,333D kültürlü hücreleri sıkıştırmak için mikroakışkan platformlar vardır, ancak fotopolimerize hücreleri izole çünkü sıkıştırma deneyleri sonrası hücreleri izole sınırlıdır hydrogel kolay değildir. Ayrıca, ultraviyole (UV) maruz ilerlik ve fotoğraf crosslinking başlatıcılarının hücreler üzerindeki etkilerinin de değerlendirilmesi gerekebilir. Buna karşılık, aljinat hidrojeller kalsiyum şelatörler tarafından hızlı bir şekilde depolimerize edilebilir, çünkü bizim yöntem post biyolojik tahliller için sıkıştırma deneyleri sonra hücrelerin hızlı izolasyon sağlar. Ayrıntılı cihaz üretim ve karakterizasyon yöntemleri bu protokolde açıklanmıştır. Mikroakışkan kondrosit sıkıştırma cihazının imalatı için kısa bir prosedür Şekil 2'degösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokoldeki her adım için eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyin.
1. Ana kalıp imalatı
NOT: Adım 1.1 - 1.3'ü duman kaputunda gerçekleştirin.
- Cam işleme
NOT: Adım 1.1 için yüz kalkanı, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin.- 3:1 hacim oranı ile sülfürik asit (H2SO4)ve hidrojen peroksit (H2O2)karıştırılarak Piranha çözeltisi (60 mL) yapın.
DİkKAT: Patlama tehlikesi nedeniyle piranha solüsyonu ve asetonu aynı duman kaputunda kullanmayın. - Piranha çözeltisindeki cam plakayı (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) 40 °C'de 30 dk'ya yerleştirin.
- Cam plakayı deiyonize suyla (diH2O) durulayın.
- 10 dakika oda sıcaklığında aseton cam plaka yerleştirin.
- Cam plakayı isopropanol ile durulayın ve azot (N2)gazıyla kurulayın.
- Cam tabağı 200 °C'de 20 dk sıcak bir tabakta pişirin. Sonraki tüm pişirme adımları sıcak bir tabak kullanın.
- 3:1 hacim oranı ile sülfürik asit (H2SO4)ve hidrojen peroksit (H2O2)karıştırılarak Piranha çözeltisi (60 mL) yapın.
- Cam plaka üzerinde SU-8 tohum tabakası oluşumu
- SU-8 5'i cam plakaya tek kullanımlık pipetle yayarak plakanın yüzey alanının yaklaşık 2/3'ünü kaplayın.
- 35 s (ilk iplik döngüsü) için 500 rpm SU-8 5 photoresists ile cam plaka spin ve daha sonra 2.500 rpm için 40 s (son iplik döngüsü) bir spin coater kullanarak. Sonraki tüm spin kaplama adımları aynı ilk dönme döngüsünü içerir.
- SU-8 5 kaplamalı cam plakayı 65 °C'de 2 dk, 95 °C'de 5 dk pişirin.
- SU-8 5 kaplamalı cam plakayı UV ışığına maruz bırakın (60 mW/cm2,UV lambası ile fotomaske arasındaki mesafe 20 cm, toplam UV ışık enerjisi miktarı = 60 mJ/cm2)1 s.
NOT: UV maruzkalma süresi kullanılmış UV ışığının gücüne göre ayarlanmalıdır. - SU-8 5 kaplamalı cam plakayı 65 °C'de 2 dk, 95 °C'de 5 dk pişirin.
- 2 dakika su-8 geliştirici pişmiş cam plaka yerleştirin.
- SU-8 5 kaplamalı camı 180 °C'de 20 dk pişirin.
- Fotolitografi ile SU-8 kanal desen imalatı (Şekil 2a Adım 1-3)
- SU-8 100'ü SU-8 5 tohumlu cam plakaya dökün ve plakanın yüzey alanının yaklaşık 2/3'ünü kaplayın.
- 38 s (, 90 μm kalınlığında) için 3.000 rpm SU-8 100 ile cam plaka spin.
- SU-8 100 kaplı cam plakayı 65 °C'de 10 dk, 95 °C'de 30 dk pişirin. Bu işlemden sonra SU-8 100 hala yapışkansa, SU-8 100 yapışkan olmayana kadar cam plakayı 95 °C'de daha uzun süre pişirin.
- SU-8 100 kaplamalı cam plakanın üzerine yüksek çözünürlüklü mikrokanallı fotomaske (25.400 dpi, Bkz. Ek Şekil 1)yerleştirin ve fotomaske kaplı cam plakayı 4 s (toplam UV ışık enerjisi miktarı = 240 mJ/cm2)UV ışığına maruz bırakın.
NOT: UV maruzkalma süresi kullanılmış UV ışığının gücüne göre ayarlanmalıdır. - Fotokopiyi cam plakadan çıkarın ve cam plakayı 65 °C'de 2 dk, 95 °C'de 20 dk pişirin.
- Bir kapta pişmiş cam plaka tutun, hangi alüminyum folyo ile sarılmış herhangi bir ışık engellemek için, gecede kür için.
- 15 dakika boyunca SU-8 geliştiricisi cam plaka üzerinde SU-8 100 kanal desenleri geliştirin.
- SU-8 desenli cam plakayı (ana kalıbı) izopropil alkolle yıkayın ve N2 gaz ile kurulayın. Bu işlem sırasında beyaz parçacıklar kalırsa, adım 7'yi 5 dakika boyunca tekrarlayın.
2. Pnömatik aktüasyon ünitesi
- Mikrokanal katmanı (Katman 1)
NOT: 2.1.1 - 2.1.2 adımlarını duman kaputunda gerçekleştirin.- 200 μL 'lik (Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane'i bir kapak kayması üzerine bırakın ve ana kalıbı olan bir vakum odasına yerleştirin.
- Odada 2 dakika vakum uygulayın ve kalıp silanization için 6 saat (veya bir gecede) bekleyin.
- 5 dakika boyunca 10:1 (prepolymer:kür leme maddesi) ağırlık oranı ile PDMS karıştırın.
NOT: Sonraki tüm PDMS döküm adımı aynı prepolimer ve kür ajan ağırlık oranını içerir (10:1). - 30 dakika boyunca bir vakum odasında ana kalıp ve degas PDMS üzerine PDMS dökün.
- Sandviç PDMS şeffaflık film bir parça ile.
- Yukarıdaki sandviç tertibatı cam plaka, köpük pedler ve pleksiglas plakalarla kelepçele(Şekil 2a Adım 4).
- 80 °C'de bir fırında 6 saat boyunca PDMS'yi tedavi edin.
- PDMS katmanını (Katman 1) şeffaflık filmi ile sandviç yapısından yalıtın(Şekil 2a Adım 5).
- 1 dk boyunca plazma temizleyici kullanarak Katman 1 ve temiz cam plaka (Cam plaka 1; 50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) yüzeyleri etkinleştirin.
NOT: Plazma temizleme süresi kullanılmış bir plazma temizleyicisinin gücüne bağlı olarak değişebilir. - Bond Layer 1 Cam plaka 1 üzerine ve 30 dakika boyunca 80 °C fırında yerleştirin.
- Saydamlık filmini Katman 1'den kaldırın.
- İnce PDMS membran (Katman 2)
- Spin kat 60 μm kalınlığında PDMS tabakası elde etmek için 1 dakika için 1.000 rpm bir şeffaflık filmi üzerinde PDMS uncured.
- 80 °C'de 20-30 dk.
- 1 dk plazma temizleyici kullanarak Cam plaka 1 ve Katman 2 Katman 1 etkinleştirin.
NOT: Plazma temizleme süresi kullanılmış bir plazma temizleyicisinin gücüne bağlı olarak değişebilir. - Katman 2'yi Katman 1'e bağlayın ve bir gecede 80 °C'de fırına koyun.
- Boru bloğu
- Metal tüpleri bir petri kabına dikey olarak yerleştirin.
- Metal tüplerin yaklaşık 3/4'ünü batırmak için yavaşça çanağa PDMS dökün.
- 60 °C'de 6 saat (veya bir gece) için fırında PDMS cure.
- Bir metal tüp içeren PDMS blok bir parça kesin.
- Giriş için Katman 2'de bir delik aç.
- 1 dakika boyunca plazma temizleyicikullanarak PDMS bloğu ve Layer 2 etkinleştirin.
- PDMS bloğunu Katman 2'nin giriş kısmına takın ve tüm aktüasyon ünitesini bir gece boyunca 80 °C'de fırına yerleştirin.
3. Aljinat-kondrosit (veya boncuk) yapılar
- Amino-silanized cam plaka
- Bir cam plakayı (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) iki yarım boyutlu cam plaka (50,8 mm × 38,1 mm × 1,2 mm) bir elmas karalama kullanarak kesin.
- Cam plakaları 0,2 M hidrojen klorür (HCl) içine yerleştirin ve bir gecede hafifçe çalkalayın (örn. 55 rpm).
- DiH2O ile cam plakaları durulayın.
- Cam plakaları 0,1 M sodyum hidroksit (NaOH) ile 55 rpm'de 1 saat çalkalayın ve diH2O ile durulayın.
- Cam plakaları %1 (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) ile 55 rpm'de 1 saat çalkalayın ve diH2O ile durulayın.
- Bir gecede bir duman başlık içinde amino-silanized cam plakaları kuru.
- Aljinat jel iper için Agarose jel kalıp
- DiH2O'da %5 (w/v) agarose ve 200 mM kalsiyum klorür (CaCl2)karıştırın.
- Bir mikrodalga fırın (veya sıcak bir tabak) ile agarose jel çözeltisi kaynatın. Kaynama süresi agarose jel çözeltisinin hacmine ve mikrodalga fırının gücüne (veya sıcak plakanın sıcaklığına) göre değişir.
- Bir alüminyum kalıp üzerine haşlanmış agarose jel çözeltisi dökün (Ek Şekil S2bakınız ), ve bir cam plaka ile sandviç.
- 5 dk bekleyin ve alüminyum kalıp katılaşmış agarose jel unmold.
- Büyüme plaka kondrosit hasat
- Yenidoğan farelerin arka uzuvlarından büyüme plakalarını izole edin.
- Hücre dışı matriksi (ECM) kaldırmak için büyüme plakalarını 37 °C'de bir kuvözde 3 saat için %0,25 kollajenaz ve %8 karbondioksit (CO2)şeklinde 1 mL'ye yerleştirin.
- Bir kondrosit pelet yapmak ve örnekten supernatant kaldırmak için 125 x g 5 dakika için sindirilmiş örnek santrifüj. Burada, 1 x g yerçekiminin ivmesidir.
- Dulbecco modifiye Kartal orta (DMEM) 1 mL kondrosit pelet resuspend.
- Hücre sayacı kullanarak DMEM'deki kondrosit sayısını sayın.
- DMEM'deki kondrositleri 125 x g'de 5 dk için santrifüj edin ve tekrar kondrosit peletyapın ve numuneden supernatant çıkarın.
- İsteğe bağlı olarak, 2 μM calcein içeren kondrosit kültür ortamı (CCM)34'teki kondrosit peletini yeniden askıya alın ve 30 dk.
- Kondrosit peletini istenilen ccm hacminde yeniden askıya alın ve kullanmadan önce 37 °C ve %8 CO2'de kuvözde tutun.
- Aljinat-kondrosit (veya boncuk) yapıları (Şekil 2c)
- Fosfat tamponlu salin (PBS) ile %1.5 (w/v) aljinat ile 5 mg/mL sulfo-NHS, 10 mg/mL 1-etil-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid hidroklorür (EDC) ile karıştırın.
- Aljinat jel çözeltisinin 1 mL'sine 8 x 106 kondrosit ekleyin [veya aljinat jel çözeltisinin 1 mL'sine 1 mL'lik 1 μm çapında floresan boncukların (542/612 nm) 3 μL'sini ekleyin (%0.3 (v/v)].
- Adım 3.1'de imal edilen amino silanlaştırılmış cam plakaüzerine aljinat-kondrosit (veya boncuk) çözeltisinin 150 μL'sini yerleştirin.
- 3 dakika agarose jel kalıp ile aljinat jel çözeltisi kapağı.
- Bir jilet ile agarose jel kalıp taşan aşırı aljinat jel çözeltisi çıkarın ve agarose jel kalıp kaldırın. Daha sonra, silindirik aljinat-kondrosit (veya boncuk) yapıları amino-silanized cam plaka üzerinde elde edilir.
- Daha fazla polimerizasyon için 1 dk için çapraz bağlama çözeltisi (50 mM CaCl2 / 140 mM NaCl diH2O) aljinat-kondrosit yapıları yerleştirin.
4. Cihaz montajı (Şekil 2d)
NOT: PDMS boşlukve 3D baskılı kelepçeler ayrı olarak hazırlanmalıdır.
- Aktüasyon ünitesinin Katman 2'nin dört köşesinde 1 mm kalınlığında PDMS boşluk bulun.
- Katman 2'nin hava odalarını kapsayacak şekilde 700 μL CCM yerleştirin.
- Alginate-kondrosit (veya boncuk) yapılarını Katman 2'ye yerleştirin ve yapıları hava odalarıyla dikkatlice hizalayın.
- Cihazı 3D baskılı kelepçelerle kelepçele (Şekil 1c).
5. Cihazın harekete girmesi
- Bir hava pompasının çıkışını (Bkz. Malzeme Tablosu)silikon borulu bir solenoid vana girişiyle bağlayın.
- Solenoid valfin çıkışını, monte edilmiş cihazın girişine silikon bir boruyla bağlayın.
- Solenoid valfi bir fonksiyon jeneratörü ile bağlayın.
- Solenoid valfi, fonksiyon jeneratörü tarafından oluşturulan kare dalga (örn. 1 Hz) ile manipüle edin.
- Cihazı pnömatik olarak harekete geçirmek için hava pompasını açın.
6. Cihazda kondrosit lerin görüntülenmesi
NOT: İyi bir görüntü kalitesi elde etmek için, genişletilmiş PDMS balonları ve hava odaları optik görüntüleri bozabilir, çünkü Cam plaka 2 ile aljinat jel görüntü kondrositler (veya floresan boncuklar). Görüntüleme için ters bir mikroskop kullanılıyorsa, glass plaka 2'nin aşağıya bakacak şekilde cihazın kurulumu gerekir.
- Önceki bölümlerde gösterildiği gibi kondrositler (veya floresan boncuklar) ile cihazı hazırlayın.
- Kondrositlerin (veya floresan boncukların) sırasıylasıkıştırma öncesi ve altında konfokal mikroskopla z-yığın görüntülerini alın. Kullanılan konfokal görüntüleme sisteminin alan derinliğine göre zadım boyutu seçin.
- Kondrosityüksekliği (veya bir aljinat-boncuk yapı) önceki literatürde gösterilen otomatik görüntü işleme yöntemi ile ölçülebilir26,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede, mikroakışkan kondrosit sıkıştırma cihazı imalatının ayrıntılı adımları gösterilmektedir (Şekil 2). Cihaz silindirik aljinat-kondrosit yapıları 5 x 5 diziiçerir ve bu yapılar sıkıştırma beş farklı büyüklükleri ile sıkıştırılabilir(Şekil 1, Şekil 3 ve Şekil 4). Pnömatik mikrokanalın yüksekliği 90 μm civarındadır ve PDMS balon çapları sırasıyla 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 ve 2.0 mm'dir. Cihazın performansı statik sıkıştırma koşulları ve görüntü işleme ile konfokal mikroskopi ile ölçüldü. Mikroskobik görüntüleme için statik kompresyon kullanılmıştır, çünkü konfokal mikroskopi ile z-yığıngörüntüleme birkaç dakika sürmektedir, bu nedenle dinamik kompresyon sırasında kantitatif görüntüleme için çok yavaştır.
Şekil 3a 5 × 5 dizi aljinat hidrojel kolonları gösterir (çapı: ~0.8 mm, yükseklik: ~1 mm) Cam plaka 2 döküm. Bu jel yapıları jel floresan boncuklar ekleyerek görüntülendi. Şekil 3b, jel sütunun en büyük PDMS balonu tarafından yüksekliği %33,8 oranında sıkıştırıldığını gösteren bir örnek örneği göstermektedir. Jel yapılarının ortaya çıkan sıkıştırma gerilimi, Şekil 3c'degösterildiği gibi PDMS balon çapındaki 0,2 mm'lik artış başına yaklaşık %5 oranında artmıştır.
Kondrositlerin kompresif deformasyonu, Şekil 4a'dagösterildiği gibi jel yapı merkezinin yakınındaki 613 μm × 613 μm × 40-55 μm (x × y × z) hacmindeki hücrelerin görüntülenmesiyle belirlendi. Şekil 1d, en büyük PDMS balonu tarafından %16 oranında sıkıştırılmış bir kondrosit örneği görüntü gösterir. Şekil 4b ölçülen hücre sıkıştırma gerinim değerlerinin dağılımını gösterir ve genel hücreler daha büyük PDMS balonları tarafından daha fazla sıkıştırılmış. Bu nedenle aljinat jeli ve kondrosit kompresyonu miktarı 14 kPa sabit basınçile PDMS balonlarının çapı(Şekil 3 ve Şekil 4)tarafından kontrol edildi.
Şekil 1. Mikroakışkan kondrosit sıkıştırma cihazı.
(a) Monte edilen cihazın şeması. A 5 × 5 dizi aljinat-kondrosit yapıları 5 farklı çapları(D = 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 ve 2.0 mm), D PDMS balon çapı (veya hava odası) ile PDMS balonlar üzerinde hizalanır. (b) Cihaz çalışmasışeması. Cihaz PDMS balonları genişletir pnömatik basınç tarafından harekete geçirilir. (c) Gerçek bir cihazın görüntüsü (sikke çapı = 19 mm). (d) En büyük PDMS balonunda(D = 2.0 mm) (hücre kompresif gerilimi, εhücresi = |hücre yüksekliği değişimi/ilk hücre yüksekliği| x 100 = %16) üzerinde bir kondrositin dikey kesitleri (sol) ve altında (sağ) sıkıştırma. Bu rakam 26'dançoğaltılır.
Şekil 2. Mikroakışkan kondrosit sıkıştırma cihazı imalatının ayrıntılı adımları.
(a) Su-8 ana kalıbı oluşturmak ve pnömatik mikrokanallarla PDMS tabakası oluşturmak için yumuşak litografiyi takip etmek için fotolitografi (Katman 1). (b)Spin kaplama ile oluşturulan saydamlık filmi üzerinde ince PDMS membran (Katman 2). (c) Cam üzerinde silindirik aljinat jel döküm yöntemi (Cam plaka 2). (d) Mikroakışkan kondrosit sıkıştırma cihazının montajı. Bu rakam 26'dançoğaltılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Statik kompresyon altında aljinat jel deformasyonunun ölçümü.
(a) silindirik aljinat jel 5 x 5 dizi (çapı: ~800 μm, yükseklik: ~1 mm). (b) Aljinat jeli en büyük PDMS balonu tarafından sıkıştırılır (D = 2.0 mm). Aljinat jelinin kompresif suşu %33.8'dir. (c) Aljinat jelinin sıkıştırıcı suşu (εjel)PDMS balon çapının 0,2 mm'lik artış başına yaklaşık %5 oranında artar (D). Hata çubuğu: standart sapma. Kırmızı çizgi: lineer montaj hattı Bu şekil 26'dançoğaltılır.
Şekil 4. Statik kompresyon altında kondrosit deformasyonunun ölçümü.
(a) Bir z-yığın görüntüsü [613 μm × 613 μm × 40-55 μm (x × y × z)] jel yapısının ortasında, jel alttan 300-400 μm elde edildi. (b) PdMS balon çapının(D)bir fonksiyonu olarak kondrosit kompresif zorlanmanın farklı büyüklükleri(εhücresi)olarak sonuçlanır. 
: ortalama değerler. 
: her veri noktası. Kutunun üst (veya alt) ve orta satırları sırasıyla standart sapma ve ortanca değerdir. Bu rakam 26'dançoğaltılır.
Şekil S1. Adım 1.3.4 (birim = mm) için mikrokanal fotomaske tasarımı. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil S2. Adım 3.2.3 için alüminyum kalıp tasarımı (birim = mm). Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil S3. Aljinat jelinin (1.5%, w/v) 1 saat-uzun dinamik (1 Hz) ve statik kompresyonun altında kalıcı deformasyonu. Bu rakam 26'dançoğaltılır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kompresif stresin büyüme plakası kondrositleri üzerindeki etkilerini test etmek için, 3D için aljinat hidrojel iskelesindeki kondrositlere çeşitli kompresif stres düzeyleri uygulamak için mikroakışkan kondrosit sıkıştırma cihazını(Şekil 1)geliştirdik. yüksek iş verme yollarında kültür. Diğer araştırmacıların cihazıbenimsemelerine veya benzer cihazlar geliştirmelerine yardımcı olmak için, bu protokol makalesinde cihaz üretim adımlarının ayrıntılarını sağladık.
Bu protokoldeki önemli adımlar 1) pnömatik mikrokanallar (Katman 1) ile pnömatik mikrokanallar ile PDMS tabakası imal katman, Katman 1'deki hava kabarcıkları pnömatik mikrokanallara zarar verebilirken, arka saydamlık filmi soyulmuştur, 2) pdms balonları kür için sabit sıcaklık (örneğin, 80 °C) (Katman 2) PDMS elastikiyeti kür sıcaklığına bağlı olduğu bilinmektedir çünkü36, 3) PDMS balonları ile aljinat jel yapıları hizalama, ve 4) taze amino silanize cam kullanarak levha (Cam plaka 2) salinizasyon tedavisinden sonra iki gün içinde Cam plaka 2 aljinat jel sütunyapıştırma için.
Bu protokolün en önemli sınırlaması, cihazın üretilmesinin nispeten emek yoğun olmasıdır, çünkü süreç fotolitografi ve yumuşak litografinin birden fazla adımını içerir. Ayrıca, farklı hidrojel ve hücre tipleri kullanıldığında, protokolümüze göre üretilen mikroakışkan hücre sıkıştırma cihazlarının performansının değerlendirilmesi gerekmektedir. Bunun nedeni, hidrojellerin ve hücrelerin mekanik özelliklerindeki herhangi bir farklılıkların cihaz performansını etkilemesidir.
Mikroakışkan hücre sıkıştırma cihazımız kondrositlere dinamik kompresyon uygulamak için olsa da, performansı statik olarak sıkıştırılmış aljinat jelleri ve hücrelerinin görüntülenmesi yle değerlendirildi. Bunun nedeni, geleneksel konfokal mikroskopi ile dinamik kompresyon altında jelleri ve hücreleri görüntülenin zor olmasıdır. Statik (14 kPa, 1 saat) ve dinamik sıkıştırma (14 kPa, 1 Hz, 1 saat) aljinat jelinin kalıcı deformasyonu açısından karşılaştırdık ve dinamik kompresyon altında jelin kalıcı deformasyonunun statik sıkıştırmaya göre ihmal edilebilir olduğunu gördük (bkz. Ek Şekil S3).
Yöntemimizin bir avantajı da 3D kültür ortamına ihtiyaç duyan diğer hücre tipleri için kullanılabilmedir. Cihazın ortaya çıkan sıkıştırması, PDMS balonlarının çapı ve kalınlığı ve/veya balondaki basınç değiştirilerek uygulamalara bağlı olarak modüle edilebilir. Ayrıca prepolimer ve kürleme maddesi arasındaki karıştırma oranını ayarlayarak PDMS balon elastikiyetini değiştirmek mümkündür. Bu cihazdaki hücreler ışık/floresan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir ve cihaz akış aşağı analizini sağlamak için hücre hasadı için hızla sökülebilir. Başka bir avantajı tek bir cihaz kullanarak her stres seviyesi başına beş teknik çoğaltmaile beş farklı mekanik stres düzeyleri oluşturmak için yeteneğidir. Çoğaltma ve doz-yanıt analizi birleştirerek sonuçlarda yüksek derecede sertlik ve tekrarlanabilirlik sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Dr. Christopher Moraes ve Stephen A. Morin'e cihaz tasarımı ve imalatına verdikleri destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Nebraska-Lincoln Üniversitesi (UNL) ve Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi'nden (UNMC) İnsan Sağlığı için Biyomühendislik bursu ile desteklenmiş ve NIH/NIAMS'tan AR070242 hibesi verilmiştir. Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi'ndeki İleri Mikroskopi Çekirdek Tesisi'nden Janice A. Taylor ve James R. Talaska'ya konfokal mikroskopi konusunda yardımcı olduklarından dolayı teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
References
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
- Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
- Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
- García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
- Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
- Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
- Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
- Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
- Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
- Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
- Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
- Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
- Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
- Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
- Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
- Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
- Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
- Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
- Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
- Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
- Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
- Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
- Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
- Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
- Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
- Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
- Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
- Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
