Summary
Aqui, nós apresentamos a imagem latente da viver-pilha que é um método não-tóxico da microscopia que permita investigadores de estudar o comportamento da proteína e a dinâmica nuclear em pilhas vivas do fermento da fissão durante o mitose e o meiosis.
Abstract
A imagem latente da vivo-pilha é uma técnica da microscopia usada para examinar a dinâmica da pilha e da proteína em pilhas vivas. Este método de imagem não é tóxico, geralmente não interfere com a fisiologia celular, e requer manuseio experimental mínimo. Os baixos níveis de interferência técnica permitem que os pesquisadores estudem células em vários ciclos de mitose e observem a meiose do início ao fim. Usando Tags fluorescentes como a proteína fluorescente verde (GFP) e a proteína fluorescente vermelha (RFP), os pesquisadores podem analisar diferentes fatores cujas funções são importantes para processos como transcrição, replicação de DNA, coesão e segregação. Juntamente com a análise de dados usando Fiji (uma versão livre, otimizada ImageJ), a imagem de células ao vivo oferece várias maneiras de avaliar o movimento da proteína, localização, estabilidade e timing, bem como a dinâmica nuclear e segregação cromossômica. Entretanto, como é o caso com outros métodos da microscopia, a imagem latente da vivo-pilha é limitada pelas propriedades intrínsecas da luz, que põr um limite ao poder da definição em ampliações elevadas, e é igualmente sensível ao photobranqueamento ou ao fototoxicidade no comprimento de onda elevado Freqüências. No entanto, com alguns cuidados, os investigadores podem contornar essas limitações físicas, escolhendo cuidadosamente as condições certas, cepas e marcadores fluorescentes para permitir a visualização adequada de eventos mitóticos e meióticos.
Introduction
A microscopia da vivo-pilha permite que os investigadores examinem a dinâmica nuclear sem matar pilhas de levedura da fissão e elimina a necessidade para fixadores e manchas letais. É possível observar a estabilidade, o movimento, a localização, e o sincronismo de proteínas cDNAs etiquetadas que são envolvidas em eventos importantes tais como a replicação do cromossoma, o recombination, e a segregação, além do que a membrana e o cytoesquelético Movimentos. Mantendo a viabilidade celular e detecção de sinal não-tóxico, há intrusão fisiológica mínima. Quando executado corretamente, este método da microscopia pode reduzir os efeitos confundidores que se levantam da manipulação técnica prolongada ou da reactividade química espúrias. Além disso, durante um experimento, os pesquisadores podem fazer observações pertinentes dos Estados nutricionais e estressantes da fissão, eficiência proliferativa e status apoptótico que indicam parâmetros inadequados de imagem ou fisiologia celular anormal1 ,2,3.
A mitose e a meiose são caracterizadas pela divisão nuclear e celular. Na meiose, ao contrário da mitose, o conteúdo genético é reduzido para metade, pois as células-mãe dão origem a células filhas4. Porque a imagem latente da viver-pilha fornece uma dimensão temporal além do que a relação Spatial, o grande número de pilhas pode ser examinado no tempo real. A microscopia de células ao vivo permitiu que os pesquisadores examinassem a dinâmica da divisão nuclear usando Tags fluorescentes para histonas5, subunidades de coesão6, microtúbulos7, centrómeros8, cinetócoros9, componentes de o corpo do pólo do eixo (SPB)10, e aqueles do complexo do passageiro do CROMOSSOMA (CPC)11. Fora do instrumento da segregação do cromossoma, a imagem latente da vivo-pilha igualmente capturou o comportamento das proteínas necessárias, mas não envolvida diretamente na segregação do cromossoma. A função dessas proteínas tem demonstrado influenciar a replicação, a recombinação do cromossomo, o movimento nuclear e o apego cromossômico aos microtúbulos12,13,14. Essas observações contribuíram para uma melhor compreensão dos eventos celulares cujos componentes funcionais não foram amáveis ao exame bioquímico ou genético. Com novos avanços na tecnologia de microscopia, limitações como baixa resolução, fotobranqueamento, fototoxicidade e estabilidade de foco diminuirão, facilitando, assim, as melhores observações em tempo real da dinâmica nuclear mitótica e meiótica1, 2,3. A meiose é particularmente desafiadora, pois é uma via de diferenciação terminal que requer muita atenção ao tempo.
O objetivo deste protocolo é apresentar um método relativamente simples para examinar a dinâmica nuclear de levedura de fissão em tempo real em mitose e meiose. Para fazer isso, é necessário usar células que não foram expostas ao estresse ambiental, preparar almofadas de agarose que podem suportar imagens prolongadas, e montar células em densidades que facilitam a visualização da dinâmica de uma única célula. Além disso, este protocolo faz uso de células carregando proteínas fluorescentamente marcadas que servem como marcadores úteis para a cinética nuclear (Hht1-mRFP ou Hht1-GFP), segregação cromossômica (Sad1-DsRed), dinâmica do citoesqueleto (Atb2-mRFP), transcricional ativação em G1/S (Tos4-GFP), e estabilidade de coesão na meiose (Rec8-GFP). Este método também introduz marcadores nucleares e citosólicos adicionais (tabela I) que podem ser usados em diferentes combinações para abordar questões sobre processos celulares específicos. Além disso, ferramentas básicas de Fiji são destaques para ajudar os pesquisadores a processar imagens de células ao vivo e analisar diferentes tipos de dados. A força desta abordagem decorre do uso de observações em tempo real de dinâmica protéica, timing e estabilidade para descrever processos que são integrais para a correta execução de mitose e meiose.
Protocol
1. preparação dos meios15,16
- Soluções de stock
- Prepare uma solução de estoque de sal 50x adicionando 52,5 g de MgCl2· 6h20, 0,735 g de CAcl2· 2h20, 50 g de KCl e 2 g de na2S04 em um frasco contendo 1 L de água destilada. Misture a solução completamente e esterilize por filtração. Coloc em 4 ° c para o armazenamento a longo prazo.
- Faça uma solução de 1, 000x de vitamina, misturando 1 g de ácido pantotênico, 10 g de ácido nicotínico, 10 g de inositol e 10 mg de biotina em um frasco contendo 1 L de água destilada. Misture bem a solução e esterilize por filtração. Mantenha a 4 ° c para armazenamento a longo prazo.
- Prepare uma solução de estoque mineral de 10.000 x adicionando 5 g de ácido bórico, 4 g de MnSO4, 4 g de ZnSO4· 7h2o, 2 g de FeCl2· 6h2o, 1 g de KI, 0,4 g de ácido molibdálico, 0,4 g de CuSO4· 5h20 e 10 g de ácido cítrico num frasco contendo 1 L de água destilada. Misture a solução completamente e esterilize por filtração. Coloc em 4 ° c para o armazenamento a longo prazo.
- Faça soluções individuais de nutrientes, adicionando 7,5 g de adenina, leucina, histidina ou lisina em um frasco contendo 1 L de água destilada. Use apenas 3,75 g para fazer a solução de uracil. Esterilizar soluções por autoclavagem.
Nota: Ao longo do tempo, o uracil precipita-se fora da solução. Para trazer para a solução novamente, aqueça no microondas em 60% de potência em incrementos de 10 s ou coloque em um banho de água de 55 ° c por 20 min. Gire a solução morna até que todos os grupos do uracil desapareçam.
- Extrato de levedura mais suplementos (YES)
- Em um balão de 2 L, adicione 1 L de água destilada, 5 g de base de extrato de levedura, 30 g de glicose e 225 mg cada uma de adenina, uracil, L-histidina, L-leucina e L-lisina. Adicionar 20 g de agar para fazer o meio sólido.
- Use uma barra de agitação magnética para dissolver completamente os ingredientes na solução. O agar derreterá depois que o meio é esterilizado por autoclavagem.
Nota: Para sua comodidade, o pó YES pronto para uso também está disponível comercialmente.
- Médio mínimo de Edimburgo (EMM) e meio de glutamato de pombe (PMG)
- Em um balão de 2 litros, combine 1 L de água destilada com 3 g de ftalato de hidrogênio de potássio, 2,2 g de na2HPO4, 5 g de NH4CL, 20 g de glicose, 20 ml de solução de estoque de sal, 1 ml de solução de estoque de vitamina e 0,1 mL de solução de estoque mineral. Substitua NH4Cl por 2,2 g de sal monosódico de ácido L-glutâmico para preparar o PMG. Para fazer o meio sólido, adicione 20 g de agar.
- Usando uma barra de agitação magnética, dissolva os ingredientes completamente. O agar derreterá depois que o meio é esterilizado por autoclavagem. Antes de usar, adicione soluções de estoque de nutrientes conforme necessário. Para cada 1 L de meio, adicione 15 mL cada um de adenina, leucina, histidina e lisina. Use 30 mL para uracil, uma vez que é menos concentrado do que as outras soluções nutritivas.
Nota: Para sua comodidade, os pós de EMM e PMG prontos para uso também estão disponíveis comercialmente.
- Extrato de malte (ME)
- Use um balão de 2 L para misturar 1 L de água destilada com 30 g de extrato de malte e 225 mg cada uma de adenina, uracil, histidina e leucina. Ajuste o pH para 5,5. Inclua 20 g de agar para fazer o meio sólido.
- Dissolva os componentes na solução usando uma barra de agitação magnética. O agar derreterá depois que o meio é esterilizado por autoclavagem.
- Ágar de esporulação com suplementos (SPAS)
- Em um balão de 2 L, adicione 1 L de água destilada, 10 g de glicose, 1 g de KH2po4, 1 ml de estoque de vitamina, 45 mg cada um de adenina, uracil, histidina, leucina e cloridrato de lisina. Adicionar 20 g de agar para fazer o meio sólido.
- Use uma barra de agitação magnética para combinar cuidadosamente os ingredientes. O agar derreterá depois que o meio é esterilizado por autoclavagem.
2. culturade levedura de fissão15,16
- Use Sim sólido médio para acordar cepas de levedura de fissão de Preservação criogênica. Dependendo dos requisitos de temperatura de cada estirpe, incubar a 25 ° c ou 32 ° c durante 3-5 dias.
- Quando as colônias são visíveis, prepare uma cultura líquida inicial. Escolha células de colônias individuais e inoculá-las em tubos de ensaio contendo 3 mL de meio líquido YES. Cresça na temperatura apropriada à fase do meados de ou do tarde-registro.
Nota: Para aeração adequada, use tubos ou frascos com volumes de pelo menos 5x maior do que o volume de cultura líquida pretendido. As velocidades de agitação entre 150-220 rpm são usuais para o crescimento rotineiro da cultura. - Dispense 250-500 μL de cultura inicial em um balão de 50 mL contendo 9,5-9.75 mL de Sim, EMM ou PMG mais suplementos apropriados. Permitir que as células para crescer para a densidade desejada e verificar o microscópio para a morfologia da célula adequada e estado nutricional.
Nota: Para armazenar as tensões do despertou por até um mês, sele placas de Yes com fita de parafina e coloc em 4 ° c.
3. preparação da amostra2
- Configuração da corrediça do microscópio
- Adicione 2 g de agarose em um copo de 500 mL contendo 100 mL de meio mínimo mais suplementos (mitose) ou SPAS líquidos (meiose). Aqueça a solução do agarose em um forno de microonda na potência de 60% em incrementos de 10 s ou coloc em um banho de água de 55 ° c por 10 minutos. Rode a solução para garantir uma fusão eficiente. Prepare a instalação da corrediça-factura do agarose (Figura 1a) para assegurar a preparação rápida da almofada e para impedir o agarose derretido da solidificação prematuramente.
- Deixe o agarose derretido esfriar por 1 min à temperatura ambiente e dispense 50-100 μL de manchas em lâminas de microscópio usando pontas de pipeta de furo largo. Antes que o agarose arrefeça para baixo, coloc uma corrediça do microscópio na parte superior para gerar uma almofada da propagação de aproximadamente 1.5-2 cm no diâmetro (Figura 1b-C). A largura da almofada do agarose é tipicamente proporcional ao comprimento do tempo da imagem latente. Em outras palavras, as almofadas mais grossas resistem a períodos de imagem mais longos.
- Use uma mistura do hidrocarboneto como um vedador para assegurar a cobertura apropriada das corrediças com as almofadas grossas do agarose e para impedir a morte da pilha da exposição solvente nas bordas do lamela. Misture partes iguais (w/w) de geléia de petróleo, lanolina e parafina em um copo de 500 mL. Aqueça os ingredientes em uma chapa quente a 120 ° c por 5 min. Enquanto os componentes derretem, gire com cuidado a solução derretida para assegurar a mistura apropriada.
- Configuração de exemplo
- Para a examinação de eventos mitotic, cresça pilhas das culturas do acionador de partida no EMM líquido ou no PMG mais suplementos à fase do mid-log aproximadamente (OD595 de 0,4). Centrifugue 1 mL da suspensão da pilha em 1.375 x g por 1 minuto, remova o sobrenadante e Ressuspenda a pelota da pilha no meio mínimo mais suplementos a um volume final de 100 μl.
- Para a imagem de eventos meiótico, crescer células de culturas iniciais no meio mínimo mais suplementos para a fase de log tardio (OD595 de 0,7-1,0). Combine volumes iguais de células de tipo mate opostas (h- e h+) em uma suspensão de célula de 1 ml. Células centrífugas em 1.375 x g por 1 min e ressuscitem o pellet em líquido me. Repita este passo três vezes para garantir a remoção eficiente de nutrientes.
- Após a última lavagem de ME, resuspender as células em 1 mL de ME e adicioná-la a um balão de 50 mL contendo 9 mL de ME. Incubar para 12-16 h em 22-25 ° c na velocidade de rotação mínima (50-100 RPM). A floculação abundante da pilha, que conduz a muitos aglomerados redondos do fermento da fissão e indica o acoplamento eficiente.
- Tome 1 mL de amostra da cultura de acasalamento e centrifugue a 1.375 x g durante 1 min. elimine o sobrenadante, mas deixe 250 μl no tubo para suspender as células. Antes de colocar as células em almofadas de agarose, vórtice vigorosamente para 5 s para interromper os aglomerantes.
Nota: O restante 250 μL ME usado para ressuscite células contém fatores de acasalamento que ajudam as células a entrar na meiose. - Coloc 20 μL de uma suspensão mitotic ou meiótico da pilha em uma almofada do agarose de 2%. Remova qualquer meio em excesso invertendo o slide e colocando-o no topo de uma toalha de papel sem fiapos para 2-3 s (Figura 1D). Coloque a almofada-lado para cima e coloc delicadamente uma lamínula de vidro, assegurando-se de não gerar bolhas de ar (Figura 1F).
Nota: Eliminando o excesso de meio com uma toalha de papel é mais tempo-eficiente do que a absorção de gravidade, o que é particularmente crítico em experimentos de meiose. - Para criar uma monocamada celular, gire a lamínula no sentido horário com o dedo indicador para uma (mitose) ou duas (meiose) voltas cheias (Figura 1F). Assegure-se de que a matéria da pilha disperse através da almofada do agarose permitindo a separação melhor de únicas pilhas ou asci. Com o auxílio de uma vara de madeira pequena, dispense o vedador derretido ao longo das bordas do lamela para selar cada almofada do agarose (Figura 1G).
- Uma vez que a almofada do agarose é selada, coloc a no estágio do microscópio e deixe-a equilibrar para 10-15 minutos nas condições apropriadas da imagem latente (por exemplo, temperatura) (Figura 1h) para permitir que as bolhas de ar dissipar-se e deixe que todo o agarose de última hora desloc ocorra. Comece a imagem uma vez que o slide é eficientemente equilibrado e não removê-lo do palco até que a coleta de dados termine.
Nota: O controle da temperatura e da umidade é determinado pelo sistema do microscópio empregado e por exigências experimentais específicas. Se presente, aplique o controle de temperatura e umidade em todos os experimentos de imagem. Se ausente, os pesquisadores devem conceber uma maneira de evitar flutuações de temperatura, especialmente durante experimentos de meiose.
4. Live-Cell Imaging2 e processamento
- Use o objetivo 40x para encontrar os campos de visão apropriados para a imagem. Alterne para o objetivo 60x para iniciar a aquisição de dados. Dependendo do sistema do microscópio usado, a refocagem e o corte subseqüentes na amostra em cada ponto de tempo ocorrerão manualmente ou através de um processo microscópio-ou software-automatizado.
Nota: As imagens apresentadas neste protocolo foram coletadas por meio de uma desvolução, microscópio de fluorescência equipado com conjuntos de filtros Sedat, RFP e GFP, fase de nano-Motion, lente objetiva 60x NA 1,4 e câmera CCD de 12 bits. Os obturadores mecânicos incorporados e as rodas de filtro motorizadas permitiram a exposição reduzida da excitação e o photobranqueamento das amostras. - Use o software apropriado para adquirir e processar imagens. Para deconvolve imagens, empregar fabricante-fornecido funções de transferência óptica.
Nota: Para obter detalhes sobre o equipamento de microscópio e software utilizado neste protocolo, consulte a tabela de materiais. - Para usar um microscópio de fluorescência convencional para adquirir imagens de células ao vivo garantir que o microscópio recolhe dados digitalmente, tem 40x ou 60x objetivos com aberturas numéricas (NA) maior que 1,2, e é capaz de realizar o corte óptico.
Nota: Sem esses requisitos, as imagens mostrarão resolução reduzida, comprometendo a qualidade das medições microscópicas e as observações qualitativas. - Use programas de plug-in gratuitos (por exemplo, Fiji) para minimizar erros sistemáticos de desfoque resultantes da perda de contraste durante a aquisição da imagem17,18,19,20 e para garantir uma análise quantitativa adequada da intensidade da fluorescência e de outros eventos temporais e dinâmicos dentro da pilha.
Nota: Outros programas de desvolução comercial disponíveis podem ser encontrados na tabela de materiais. - Escolha os conjuntos de filtros de microscópio que melhor correspondem aos fluoróforos observação. Assegure-se de que os filtros da excitação e da emissão tenham as passagens direitas da faixa que permitem a deteção específica de proteínas fluorescentes. Por exemplo, para detectar o sinal de CFP, uma excitação e uma passagem da faixa da emissão de 430/25 e de 470/30 são apropriadas, mas não para a fluorescência de RFP.
- Use uma abordagem de configurações mínimas-efetivas (MESA) quando a levedura de fissão de imagem em vários pontos de tempo. Em outras palavras, evite o uso prolongado de comprimentos de onda de excitação e empregar o menor poder de excitação e tempo de exposição que geram aceitável, mas quantificável e reprodutível dados de imagem.
- Para imagens prolongadas durante a mitose ou meiose, limitar o intervalo entre pontos de tempo de aquisição para 5-10 min. Embora 2% as almofadas do agarose possam suportar 12 a 16 sessões da imagem latente de h, pilha-deslocamento devido à evaporação do agarose é provável. Portanto, realizar experimentos de mitose ou meiose completa em 4-6 h ou 8-10 h janelas, respectivamente.
- Colete dados de imagem para 4-8 h consistindo de pelo menos 24-48 pontos de tempo de aquisição, respectivamente, uma proteína de fluorescência, e uma pilha z por ponto de tempo e canal fluorescente composto de 13 seções com espaçamento de 0,5 μm usando um objetivo de 60x. Isso requer pelo menos 0,5-1 GB de espaço de armazenamento no disco rígido. Assim, além de eliminar o fotobranqueamento e a troca de células, crie um fluxo de trabalho que considere as capacidades de computação1,2,3.
Nota: Estes parâmetros de aquisição são normalmente definidos e modificados no software que controla as funções do microscópio e que recolhe e processa imagens. - Para examinar os processos nucleares específicos mais detalhadamente, realize a aquisição de imagens a cada 5-10 s, desde que a emissão não diminua substancialmente após exposição frequente. Realizar uma análise de intensidade de fluorescência preliminar ao longo de diferentes períodos de tempo para determinar o ponto após o qual a precisão dos dados recolhidos já não é fiável1,3.
- No software de aquisição de imagem e processamento de imagem, use a projeção de intensidade máxima na imagem z-Stacks para observar todas as estruturas com alta densidade de fluorescência em um plano 2D, independentemente de sua localização vertical1,2, a 3. Isto facilita um exame rápido dos processos nucleares que ocorrem em voxels diferentes. Colete uma imagem de campo brilhante mid-focal para gerar uma imagem de referência das células em observação.
5. ImageAnalysis20,21
Nota: A análise da imagem neste protocolo é executada usando Fiji. Para outros programas de análise e Fiji plug-ins ver tabela de materiais.
- Carregue uma imagem descomplicada selecionando o recurso importador de bio formatos no menu plugins . Na janela pop-up Opções de importação , selecione hyperstack, modo de cor padrãoe verifique AutoScale antes de pressionar o botão OK .
- Assegure-se de que a janela exibida tenha o número correto de canais de fluorescência e prazos rolando lateralmente nas respectivas barras na parte inferior. Salvar como um arquivo TIFF, que não compactar dados e impede a perda de informações.
- Abra uma imagem que contenha uma barra de escala gerada durante o processamento de dados pelo software do microscópio. Determine o comprimento do pixel da barra de escala usando a ferramenta linha reta para desenhar uma linha paralela de tamanho semelhante e selecione medir no menu analisar. Adicione uma barra de escala definindo a proporção de pixel para μm de imagem selecionando definir escala no menu analisar.
- Na janela pop-up definir escala , insira a distância calculada em pixels e a distância conhecida em μm, defina a taxa de proporção de pixel como 1,0, coloque Micron como a unidade de comprimentoe verifique a caixa global antes de clicar no Botão OK .
- Use a opção definir medições no menu Analyze para escolher diferentes parâmetros para quantificar ao selecionar medida. Para os propósitos deste protocolo, selecione as seguintes métricas: área, perímetro, valor médio de cinza, mediana, mín & valor máximo de cinza, densidade integrada, posição da pilhae exibição do rótulo.
- Dependendo da precisão dos dados coletados, digite mais de 1 para a opção casas decimais e marque a caixa de notação científica , se necessário. Depois de aplicar o comando Measure , uma janela pop-up Results mostrará os valores para cada parâmetro pertinente. Salve os resultados como um arquivo. csv para análise futura em um programa de estatísticas.
Nota: Não é necessário separar uma imagem em seus canais fluorescentes constituintes para determinar o comprimento, a menos que haja interferência de sinal entre as cores diferentes, caso em que siga o passo detalhado abaixo. - No caso de interferência de sinal, selecione a ferramenta cor e canais no menu imagem e analise cada cor separadamente. Para medir o comprimento de estruturas não lineares, clique com o botão direito do mouse na ferramenta linha e use a opção linha segmentada ou linha livre para rastrear os objetos desejados.
- Para estruturas lineares ou para determinar a distância entre dois pontos, use o recurso linha reta e selecione Measure no menu Analyze . Os valores para o comprimento no μm serão adicionados automaticamente aos parâmetros selecionados previamente a opção ajustada das medidas .
- Para medir as alterações no tamanho do sinal e na intensidade da fluorescência, primeiro crie uma biblioteca de região de interesse (ROI), que aumenta a precisão da quantificação e facilita medições rápidas em uma pilha de imagens. Selecione a ferramenta cor e canais no menu imagem .
- Na janela pop-up de canais , verifique o canal de cores para o qual a intensidade ou área será medida. Escolha os recursos de ajuste e limite no menu imagem . Verifique a caixa de fundo escuro , selecione o método padrão (a menos que de outra forma exigido pelos dados coletados), e escolha vermelho para sobrepor os sinais de interesse.
Nota: A medição da estabilidade, do movimento e da localização das proteínas está intimamente dependente do limiar de cor utilizado para criar bibliotecas de ROI. É importante escolher o método de limiarização correto para o tipo de sinal de marcador fluorescente a ser visualizado17,18. - Use a ferramenta Wand para destacar cada estrutura de interesse e pressione a letra T no teclado para adicionar o ROI selecionado à janela do Gerenciador de ROI pop-up. Repita esse processo para cada fatia (período de tempo) na pilha de imagens e armazene todos os ROIs clicando no botão mais e selecionando salvar.
- Abra a pasta de ROI zipada para carregar o Gerenciador de ROI e clique em cada identificador de ROI no painel do lado esquerdo. Selecione Measure no menu Analyze e repita esse comando em cada identificador de ROI para quantificar os objetos de interesse em todas as fatias da pilha de imagens.
- Se a mudança de célula não é um problema e o plano focal permanece o mesmo para todas as fatias da pilha, clique em multi medida no Gerenciador de ROI. Na janela pop-up, selecione medir todas as fatias em vez de uma linha por fatia para iterar medições em toda a pilha de imagens. Salve os resultados como um arquivo CSV e analise as medições em um programa de estatísticas.
- Para vários sinais nucleares que compõem a estrutura de interesse, pressione a tecla Shift enquanto seleciona objetos com a ferramenta Wand para criar um único ROI. Alternativamente, crie um ROI de tamanho constante com a ferramenta Oval para abranger todos os sinais de interesse.
Nota: Esta aproximação oval pode ser necessária para medir e descrever o comportamento do sinal sobre uma área onde o sinal da fluorescência mude no tamanho e na intensidade sobre o tempo. A intensidade do sinal, neste caso, é a densidade média do sinal sobre uma determinada área. - Determine qualitativamente a colocalização de dois sinais fluorescentes pela mudança na cor da região da sobreposição do sinal. No entanto, como a zona de colocalização estreita, é mais difícil distinguir a sobreposição do sinal. Nesse caso, siga as etapas detalhadas abaixo.
- Usando a ferramenta de canais, conforme descrito na etapa 5,6, desenhe uma linha reta sobre cada sinal em questão e selecione o comando traçar perfil no menu analisar.
- Repita esta etapa para todas as cores em questão usando a mesma linha desenhada.
- Na janela de pop-up de plotagem da amostra que aparece após cada etapa de criação de perfil, pressione o botão list para chamar uma janela de valores de plotagem e salve as medições para cada sinal como um arquivo CSV.
- Em um programa de estatísticas, crie um gráfico que plota o valor cinza para cada sinal em relação à sua localização correspondente (em μm) ao longo da linha desenhada. A falta de sobreposição entre os gráficos de perfil de sinal geralmente indica a falta de colocalização.
Nota: Use a ferramenta perfil de plotagem em imagens projetadas para examinar a colocalização do sinal. Isso só é confiável se tal sobreposição também é observada através da imagem z-Stack.
- Para monitorar o comportamento dinâmico das proteínas fluorescentes ao longo do tempo, use a ferramenta multi Kymograph encontrada no menu Analyze. A imagem resultante mostra o movimento do sinal fluorescente através de uma série de instantâneos condensados em cada fatia da pilha z, que representa pontos de tempo individuais.
- Use a ferramenta Channels conforme descrito na etapa 5,6 para isolar o objeto de interesse no canal correto. Certifique-se de que o objeto ou a estrutura selecionada não mude consideravelmente através da pilha z. Coloque uma linha reta ou um retângulo sobre o objeto, selecione a ferramenta multi Kymograph no menu Analyze e insira a largura desejada da linha que sobrepondo o objeto.
- Crie painéis de imagem que mostrem dinâmicas nucleares em uma janela de tempo específica usando a ferramenta canais conforme descrito na etapa 5,6 e selecionando as ferramentas Stacks e Make Montage no menu imagem. Na janela pop-up criar montagem, insira o número de colunas e linhas desejadas, defina um fator de escala de 1,0, escolha as fatias primeira e última (intervalos de tempo) e altere a largura da borda para pelo menos 5 antes de pressionar OK. É possível escolher quais imagens na pilha para mostrar alterando incrementos para atender a seqüência desejada.
- Para gerar um filme, carregue a hyperstack desejada, selecione salvar como um arquivo AVI no menu arquivo , escolha nenhum para compactaçãoe insira uma taxa de quadros de 2-8 fps. Selecione o comando Make Montage ao escolher Composite na ferramenta Channels para mesclar ou separar todas as cores que compõem a imagem.
Nota: Dois arquivos AVI (filme 1-2) são fornecidos neste protocolo. Use-os em Fiji para experimentar diferentes características destacadas ao longo da etapa 5. - Para mostrar uma única célula representativa, use Transform e Rotate no menu Image e insira graus de rotação. Os números negativos giram objetos para a esquerda, enquanto os valores positivos giram objetos para a direita. Uma vez que a célula está na orientação adequada, desenhe um retângulo que abrange toda a célula através da pilha z ou durante os períodos de tempo de interesse e selecione recortar no menu de imagem . Proceda como mencionado na etapa 5,16 e 5.16.1 para gerar um painel de imagem ou filme.
- Para gerar um filme, carregue a hyperstack desejada, selecione salvar como um arquivo AVI no menu arquivo , escolha nenhum para compactaçãoe insira uma taxa de quadros de 2-8 fps. Selecione o comando Make Montage ao escolher Composite na ferramenta Channels para mesclar ou separar todas as cores que compõem a imagem.
- Adicione uma barra de escala ao painel de imagem ou filme selecionando Ferramentas e barra de escala no menu analisar. Na janela pop-up barra de escala, insira 5-15 para largura em mícrons para células individuais ou 100-250 para campos inteiros de exibição, escolha branco ou preto para cor e escolha um local apropriado para posicionar a barra de escala.
- Para filmes, é útil mostrar a progressão do tempo durante eventos nucleares. Para mostrar a alteração de tempo entre quadros, selecione imagem, clique em pilhas, use a ferramenta Stamper de tempo , indique o quadro inicial na série temporal e selecione um local apropriado para a exibição de tempo.
Representative Results
Se a imagem latente da vivo-pilha é usada para a mitose ou o meiosis, é crucial empregar pilhas saudáveis do fermento da fissão antes de fazer qualquer tipo de observação. A qualidade dos dados resultantes depende muito do material inicial. Se as células morrem de fome devido à limitação de nutrientes ou ao crescimento excessivo, eles mostrarão vacúolos em excesso e diminuirão o tamanho da célula (fome, Figura 2a). Para experimentos de mitose, é melhor evitar o uso de células que mostram estresse celular (fome, Figura 2a). Caso contrário, os resultados experimentais serão inconsistentes e irreprodutíveis. Para contornar essa limitação, escolha controles de tipo selvagem adequados e familiarize-se com os vários fenótipos de mutantes de interesse. Por exemplo, células mitóticas esfomeadas por 12 h deixam de replicar ativamente o DNA. Uma vez que a expressão de Tos4-GFP está associada à atividade de G1/S-Phase22,23, células logarítmicas carregando este marcador e uma para divisão nuclear (Sad1-dsred10) mostram expressão pan-nuclear Tos4-GFP, focos de Sad1-dsred separação, e septação em curso (sugerindo a replicação ativa do ADN e a divisão da pilha) (registro, Figura 2a), quando as pilhas fome não mostrarem nenhuma tal atividade (starvation, Figura 2a). Esse resultado é consistente com os efeitos da limitação de nutrientes na levedura de fissão, o que diminui a transcrição no G1, ativa o ponto de verificação do ciclo celular G1/S e promove a G0 entrada5. Para experimentos de meiose, as células devem crescer para uma alta densidade, mas sem atingir a fase estacionária. Posteriormente, as células de ambos os tipos de mate são misturadas e incubadas juntas em meios de baixo nitrogênio. A incapacidade de acasalar, como é o caso quando as células não estão suficientemente faminta de nitrogênio, irá impedi-los de entrar meiose (ineficiente, Figura 2b). A floculação robusta da suspensão da célula de acasalamento aumenta a interação célula-célula e, portanto, indica o acasalamento bem-sucedido e a indução meiótica eficiente (eficiente, Figura 2b).
As almofadas do gel do agarose e o rompimento físico de grupos da pilha garantem o visualização apropriado de únicas pilhas ou asci (registro, Figura 2a; Eficiente, Figura 2b). As almofadas devem fornecer uma plataforma rígida, contudo húmida em que as pilhas são fixadas simultaneamente no lugar e protegidas da dessecação. Além disso, as almofadas devem ser grossas o suficiente para resistir a mudanças devido à evaporação e fornecer uma superfície nivelada que permite o foco adequado ao longo da aquisição de imagem (Figura 1C). A rotação da lamínula é necessária para separar e espalhar células dentro de agregados de acasalamento (Figura 1F; Eficiente, Figura 2b). Sem esta etapa, poucos asci mas as pilhas haplóides numerosas são observadas porque os asci tornam-se prendidos dentro das camadas inacessíveis de grupos de acoplamento, quando as pilhas haplóides forem livres preencher todas as manchas disponíveis do monocamada (Figura 2b). Mesmo para experimentos mitóticos, onde a aglomeração de células é menos problemática, a rotação de lamínulas move as células ao redor da almofada para criar uma única camada de células com espaço suficiente entre as células para reduzir os efeitos de aglomeração e permitir a duplicação de células (log, Figura 2a ).
Atb2 é um componente de α-tubulina envolvido na segregação cromossômica em mitose de levedura fissão e meiose7,14. Quando marcado cDNAs, este componente do citoesqueleto permite a examinação das etapas que caracterizam a separação nuclear na mitose. Durante a profase (0 '-20 ', Figura 3a), a nucleação do eixo mitótico ocorre no lado nuclear dos corpos do pólo do eixo (spbs), como revelado por fibras de Atb2-MRFP ajustadas de encontro a um fundo Pan-nuclear de HTT1-GFP5 . Durante a transição da metafase-anaphase (20 '-40 ', Figura 3a) o eixo mitotic estende para fora e o núcleo divide-se em dois. Como a célula entra telófase (60 '-80 ', Figura 3a), Atb2-MRFP expande bidireccionalmente até que os cromossomas são totalmente separados. Após este ponto, as fibras de Atb2-MRFP reagrupam-se e espalham-se através da superfície da pilha para regain sua forma interfase em cada uma das células filhas resultantes. A citocinese (> 120 ', figura 3a) ocorre somente após um septo se forma e divide a célula por fissão. Após alterações na intensidade do Hht1-GFP sobre um ciclo mitótico revela três etapas importantes na dinâmica nuclear: metafase-anaphase (intensidade média, compactação do ADN: 20 '-40 ', figura 3a-B), telófase (baixa intensidade, separação do ADN: 60 '-80 ', Figura 3A-B) e G1 (aumento da intensidade, duplicação do DNA: 100 '-120 ', figura 3a-b). Similarmente, mas usando as pilhas que carregam somente Hht1-MRFP e empregando a ferramenta do multi-kymograph (veja a etapa 5,15) em Fiji, é possível observar a divisão mitotic da metafase ao telófase e avaliar os movimentos nucleares envolvidos durante o chromatid apropriado da irmã segregação (normal, Figura 3C). Os kymographs da mis-segregação mostram a atividade do sinal entre os dois caminhos nucleares principais, indicando o mis-segregação possível devido à fragmentação do cromossoma ou à separação inadequada do chromatid (lagging, Figura 3C).
Como mencionado anteriormente, na levedura de brotamento e fissão, a Tos4 é transcrita no G1 e funciona durante a replicação do DNA na fase22,23. Isto pode ser observado em um quimógrafo onde a expressão do Tos4-GFP aumenta no núcleo depois que Sad1-dsred10 focos movem-se para sentidos opostos (indicando a divisão nuclear), mas antes que os formulários do septo, que precede o citocinese (39 ', Figura 3D ; 36 ', Figura 3E). A fase de alta atividade do Tos4-GFP começa no final da transição M-G1/S (45 ', Figura 3E) e termina no G2 (> 60', Figura 3E), logo após a divisão celular. Embora muito difusa durante o G1, a intensidade do sinal de Tos4-GFP aumenta a pós-anaphase e ao longo da fase S e colocalizes com focos Sad1-DsRed segregados (45 '-60 ', Figura 3E). Este resultado revela o período de septação na levedura de fissão quando a duplicação do genoma começou nas células filhas (G1/S), mas a citocinese ainda não ocorreu.
Hht1 é histona H3 em levedura de fissão e é comumente modificada com etiquetas fluorescentes para visualizar DNA nuclear5,14. Na mitose, como a transição de células da metafase para a telóase (20 '-120 ', Figura 3a), duas alterações distinguíveis à massa nuclear são observadas. A primeira alteração envolve uma contração do tamanho nuclear na metafase (20 ', figura 3a), enquanto a segunda mostra a divisão do núcleo durante a anaphase (40 ', Figura 3a). Além de compartilhar essas alterações com células mitóticas, as células meióticas exibem oscilação nuclear (ou seja, tailing de cavalo) (-100 ' a-50 ', figura 4a-B) durante a recombinação homutora e maior redução do tamanho do núcleo no final da anaphase II (70 '-90 ', Figura 4a). Hht1-MRFP é usado para examinar os fenótipos da mis-segregação tais como o retardamento ou os cromossomas fragmentados (atraso, Figura 3C). Também é empregado para observar e descrever a dinâmica nuclear em cada uma das fases da meiose (figura 4a-B). A massa nuclear é grande e oscila no tamanho durante muito do cavalo-tailing (HT:-100 ' a-50 ', figura 4a-B)). À medida que as células entram na metafase (MT:-40 ' a 0 ', figura 4a-B), o tamanho nuclear e a oscilação diminuem, consistentes com o aumento da atividade de condensação nesta fase. O início da anaphase I (MI: 10 '-60 ', figura 4a-b) e II (miI: 70 '-90 ', figura 4a-b) está associado a uma maior redução nuclear e falta de movimento nuclear, que se correlaciona bem com as duas divisões nucleares que caracterizam meiose I e II (MI & MII). Assim, o meiose é associado com as flutuações nucleares do tamanho quando os cromossomas homólogo alinham e recombinar e com reduções nucleares do tamanho que seguem duas rodadas da separação do cromossoma. Alelos que alteram essas dinâmicas nucleares provavelmente estão associados ao regulamento de estabilidade do genoma na meiose12,13.
Rec8 é a subunidade de α-kleisin de Coina meiótica em levedura de fissão. É carregado na cromatina após a replicação do ADN (Mei-S) e mantem os cromátides da irmã amarrados a se até o anaphase II. Após a metafase I, Rec8 é removido dos braços do cromossoma por separase e é protegido no Centrómero por Sgo1-PP2A. No final da segregação homólogo, Rec8 também é eliminado no Centrómero, permitindo assim a separação da irmã cromatid (Figura 5a)6,24. Rec8-GFP juntamente com marcadores de segregação cromossômica como Sad1-DsRed ou Hht1-mRFP permitem a visualização da dinâmica de coesão durante a meiose. O sinal Rec8-GFP é Pan-nuclear durante Mei-S (< <-90 ', Figura 5a-b), prófase i (-90 ' a-50 ' , Figura 5a-b) e metafase I (-40 ' a 0 ', Figura 5a-b). Esta observação revela a associação de Rec8-GFP ao longo dos eixos dos cromossomas que seguem a duplicação do ADN. À medida que as células entram na anaphase I (10 ', Figura 5a-b), a intensidade de Rec8-GFP diminui em todo o núcleo, mas permanece forte no Centrómero, onde forma um foco em cada massa nuclear (20 '-70 ', Figura 5a-b). Este resultado é consistente com a degradação do Rec8-GFP ao longo dos braços do cromossoma mas não no Centrómero, que segue após a segregação do homólogo. Antes da anaphase II, o foco do Rec8 desaparece, liberando cromátides irmãs para separação em miI (70 '-80', Figura 5a-B). O marcador Rec8-GFP é, portanto, útil para examinar as condições que interrompem o estabelecimento, a remoção e a estabilidade geral da coesão meiótica. Emparelhado com um marcador da divisão nuclear tal como Hht1-MRFP5,13, Rec8-GFP pode ser empregado para endereçar perguntas de como o sincronismo e a estabilidade da coesão antes e durante a meiose afetam a segregação apropriada do cromossoma12 ,13. Este protocolo não aborda proteínas cuja dinâmica ocorra principalmente no citosol. Entretanto, a tabela I mostra algumas proteínas citosólico que são usadas geralmente para examinar o citoesqueleto e os processos da membrana necessários para o endocytosis, o exocytosis, e o citocinese entre outros processos.
Figura 1: preparação de almofadas de agarose para imagens de células ao vivo. (A) montagem da preparação da corrediça montada usando um suporte da ponta da pipeta, uma fita do laboratório, e umas corrediças do microscópio. Colocando slides perpendiculares uns aos outros cria um bolso onde a almofada de agarose forma. A adição de partes da fita do laboratório nos lados ajusta a largura da almofada do agarose às especificações exigidas. (B) o agarose derretido é deixado refrigerar para baixo antes de configurá-lo em corrediças do microscópio para fazer almofadas. Nesta etapa, é necessário dispensar lentamente o volume do agarose para evitar criar bolhas de ar. (C) a corrediça superior é coloc no ponto dispensado do agarose para dar forma a uma almofada circular com uma superfície reta, mesmo bordas, e nenhumas rachaduras visíveis do agarose. (D) após ter põr uma amostra da suspensão da pilha na almofada do agarose, inverta a corrediça e coloc sobre uma toalha de papel Lint-livre para remover o meio líquido extra. (E) coloc com cuidado uma lamínula na almofada do agarose, certificando-se não prender nenhumas bolhas de ar e verific que o plano do foco é liso para evitar a mudança da pilha e as edições de focalização. (F) lentamente e cautelosamente, gire o lamela no sentido horário para interromper aglomerados da pilha e para gerar um monocamada da pilha que permita a expansão da pilha e o melhor visualização da pilha. (G,H) Use uma mistura aquecida do hidrocarboneto para selar almofadas do agarose e para permitir que equilibrar à temperatura desejada antes da imagem latente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: escolhendo as células certas. (A) os painéis superiores mostram as células de levedura de fissão deixadas para morrer de fome no EMM mais suplementos para 72 h e o painel inferior mostra células submetidas ao crescimento logarítmico. Nas células que são deixadas para morrer de fome, pequenas morfologias de células podem ser apreciadas. A seta aberta vermelha mostra os grânulos vacuolar que são característicos da fome. Em culturas logarítmicas, células que mostram morfologias alongadas e septos (seta vermelha) abundam, indicando dinâmica de ciclagem ativa. Os painéis do lado direito mostram as células expressando sinais de Tos4-GFP e Sad1-DsRed durante a fome e a proliferação. A expressão pan-nuclear Tos4-GFP e os sinais Sad1-DsRed que localizam aos pólos opostos da pilha são vistos durante a proliferação ativa, mas não na inanição. (B) o painel superior mostra as células do mesmo tipo de posicionamento (h +) que não se acasalam com eficiência. A seta aberta vermelha mostra um par de pilhas vacuolar que submetem-se ao karyogamy. Isso não é incomum em culturas de células h +, onde 10% das células podem alternar tipo de posicionamento para h-. O painel inferior mostra o asci resultando do acoplamento eficiente. Asci zigóticos tomam várias formas, incluindo o zig-zag (seta vermelha) e formas de célula de banana (seta vermelha aberta). Barra de escala = 5 μm de comprimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: dinâmica nuclear mitótica. (A) as proteínas de histona H3 (HHT1-GFP) e microtubule (Atb2-MRFP) foram seguidas durante um ciclo de mitose (120 min). Sinais individuais para Hht1-GFP e Atb2-mRFP são mostrados em preto e branco painéis, enquanto o BF mesclar mostra-los em suas respectivas cores. (B) quantificação da intensidade da Hht1-mgfp ao longo de um ciclo mitótico. A alteração nos níveis de Hht1 é indicativa da divisão nuclear durante a mitose e duplicação do DNA no G1. (C) kymographs que mostram a segregação normal ou anormal na mitose onde os caminhos nucleares resultantes bifurcate e mantêm a integridade do ADN ou desviam-se e promovem a fragmentação do cromossoma ou a separação prematura do chromatid, respectivamente. (D,E) Os painéis de kymograph e de Micrografia que mostram a duração de M-a-G1/S revelaram pela segregação de Sad1-dsred e pela aparência de sinais Tos4-GFP nucleares. Anote os painéis médios em E que foram gerados usando o lut do fogo em Fiji para criar um mapa térmico intensidade-graduado que facilite a identificação dos pontos com expressão elevada do TOS4-GFP; Neste caso, localizado para o núcleo e sobreposição de sinais Sad1-DsRed, como esperado. Barra de escala = 5 μm de comprimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: dinâmica nuclear meiótica. (A) série do painel que mostra o movimento, a compactação, e a divisão do núcleo (Hht1-MRFP) durante a meiose. O cavalo-tailing (HT) mostra as oscilações nucleares do lado-à-lado extensivas seguidas por Metaphase (MT), onde o movimento lateral nuclear diminui e inteiramente pára para a direita antes do anaphase I. Na meiose I (MI), a principal massa nuclear divide-se em dois, enquanto na meiose II (MII) quatro núcleos são gerados durante o processo de separação de cromatid irmã. (B) quantificação da mudança de área nuclear (Hht1-MRFP) em Prophase, METAFASE, mi & miI. A área nuclear é dinâmica durante as oscilações de HT, torna-se condensada em MT, e diminui ainda mais em tamanho durante o MI & MII, onde pouco movimento nuclear é observado (eixo nuclear longo). Medir o maior eixo nuclear (eixo nuclear longo) baseia-se na ideia de que, como um círculo se estende, deixa de ter um diâmetro constante e gera pelo menos dois eixos principais: longo e curto. Assim, ao monitorar mudanças no núcleo, as mudanças no eixo longo ou curto fornecem indícios de movimento nuclear. Barra de escala = 5 μm de comprimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: dinâmica da coesão meiótica. (A) série do painel que mostra como a mudança do sinal do Rec8-GFP correlaciona com a dinâmica nuclear meiótico. Durante HT e MT, o sinal Rec8-GFP é Pan-nuclear e segue o movimento nuclear (Hht1-mFRP). No MI, o Rec8-GFP se dissipa do núcleo, deixando apenas um par de focos, o que é consistente com a remoção de Rec8 dos braços cromossômicos e o estabelecimento da proteção Sgo1-PP2A no Centrómero. À medida que a célula se aproxima do MII, os focos de Rec8-GFP começam a desaparecer e não são mais vistos logo antes da anaphase II. (B) quantificação da intensidade do REC8-GFP do HT ao miI. Semelhante ao que é visto em a, o sinal GFP é alto através de HT e MT, diminui substancialmente durante A mi e desaparece completamente no miI. Este teste padrão corrobora a dinâmica coesina nos braços do cromossoma e no Centrómero, onde mantem os cromátides da irmã amarrados até pronto para ser separado em miI. Barra de escala = 5 μm de comprimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Proteína | Função | Comentários | Tag | Referências | ||
| Hht1 | Histone H3 envolvido na embalagem de DNA | Usado para examinar a dinâmica do cromossomo | Hht1-mRFP | 5, 14 | ||
| Tos4 | A função Tos4 ocorre durante a fase G1 | Empregado para estudar o sincronismo G1 | Tos4-GFP | 22, 23 | ||
| Rad21/Rec8 | Subunidades de coesão envolvidas na manutenção de cromátides irmãs juntas após a replicação | Utilizado para analisar a estabilidade da coesão durante a segregação mitótica (Rad21) e meiótica (Rec8) | Rad21-GFP/Rec8-GFP | 6, 24 | ||
| Rad11 | A atividade de RPA ocorre durante o reparo mitotic do ADN, recombination meiótico, e extremidades na metafase | Empregado para estudar o reparo do ADN na mitose e na dinâmica do recombinação na meiose | Rad11-YFP | 5, 13 | ||
| Rad52 | Rad52 Descrição ocorre durante o reparo mitotic do ADN e o recombinação meiótico | Empregado para estudar o reparo do ADN na mitose e na dinâmica do recombinação na meiose | Rad52-CFP | 5, 13 | ||
| Cnp1 | Histone H3 CENP-a localiza especificamente no Centrómero | Usado para seguir a dinâmica de segregação cromossômica em mitose e meiose | Cnp1-mCherry | 13 | ||
| Swi6 | HP1 proteína homólogo envolvida na formação de heterocromatina | Empregado para estudar a mobilização da heterocromatina no Centrómero e telômeros | Swi6-GFP | 13 | ||
| Sad1 | Sad1 é envolvido em localizar o corpo do pólo do eixo ao envelope nuclear | Empregado para analisar a segregação cromossômica em mitose e meiose | Sad1-mCherry | 10 | ||
| CITOSOL & membrana | ||||||
| Atb2 | O alfa 2 do tubulin envolveu na organização do citoesqueleto do microtubule | Usado para examinar a segregação do cromossoma na mitose e na meiose | Atb2-mRFP | 7, 14 | ||
| Ync13 | Exocitose e regulador de endocitose envolvidos no transporte mediado por vesículas | Empregado para estudar a integridade da parede celular durante a citocinese | Ync13-mECitrine | 25 | ||
| Rlc1 | Subunidade de miosina II envolvida na contração do anel contrátil | Usado para explorar a dinâmica da maturação e contração do septo | RIc1-mCherry | 25 | ||
| Ccr1 | NADPH-cytochrome P450 redutase que faz parte da membrana externa de er, plasma e o | Empregado para examinar dinâmicas membrana-associadas tais como o endocytosis, o exocytosis, e o citocinese | Ccr1N-GFP | 5 | ||
| Gef1 | Rho guanyl-fator de troca de nucleotídeo envolvido no estabelecimento e manutenção da polaridade celular | Usado para examinar a dinâmica de polaridade da célula global, microtubule-dependente | Gef1-mCherry-GBP | 26 | ||
| Fus1 | Formin envolvidos no conjunto do foco da fusão do actina durante a citogamia | Usado para estudar a dinâmica de fusão associada ao acasalamento de levedura de fissão | Fus1-sfGFP | 27 | ||
| Mnn9 | Subunidade de mannolsyltransferase envolvida no glicosilação N-lig da proteína no instrumento de Golgi | Empregado para estudar a maturação da carga no Golgi à medida que progride de cis-Golgi para Trans-Golgi | Mnn9-mCherry | 28 | ||
| Num1 | Fator de ancoragem cortical para o dynein envolvido no cavalo-tailing | Usado para examinar a ancoragem de dynein mitocôndria-dependente durante a oscilação nuclear na prófase meiótica I | Num1-yEGFP | 29 | ||
Tabela 1: marcadores de dinâmica nuclear e citosólica.
Filme 1: transição M-to-G1/S que mostra o corpo do pólo do eixo (SPB; Sad1-dsred) separação precedente septação e acumulação do sinal nuclear de Tos4-GFP. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Filme 2: conclusão do ciclo mitótico mostrando a extensão do microtúter (Atb2-mRFP) correlacionando-se com a divisão nuclear (Hht1-GFP). Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Discussion
A imagem latente da vivo-pilha durante o mitose e o meiose oferecem a oportunidade de examinar a dinâmica nuclear sem interromper substancialmente a fisiologia do fermento da fissão durante a aquisição de dados. No entanto, deve-se ter cautela para garantir que as células cresçam para as densidades desejadas livres de tensões ambientais; e para a meiose, que as células são imaged durante o tempo de diferenciação terminal e não muito cedo ou tarde. O excesso de aglomeração celular, fome e temperaturas de crescimento inadequado são fatores comuns que contribuem para observações irreprodutíveis. Além, durante a construção da tensão, é crucial testar que os Tag fluorescentes não interferem com as funções de genes do alvo nem afetam a aptidão total da pilha. A falha em inspecionar de perto os fenótipos de cepas que transportam marcadores fluorescentes pode resultar em resultados inconsistentes e incomparável em genótipos semelhantes.
Embora as almofadas do Agarose do microscópio sejam simples montar, podem igualmente levantar um obstáculo em obter dados valiosos da imagem latente. Criar almofadas do agarose é tão simples quanto coloc três corrediças do microscópio paralelas a se, dispensando o agarose derretido na corrediça média, e põr uma corrediça que transversos a parte superior das outras corrediças. É útil, entretanto, montar um instrumento do slide-Maker que permita modificações da largura para manufaturar almofadas resistentes, situação-específicas do agarose. Um slide-Maker simples que dá flexibilidade largura pad consiste em uma plataforma (pipeta pontas titular ou o banco), duas lâminas de microscópio, e fita de laboratório atuando como o mecanismo de ajuste de largura Pad (Figura 1a). A espessura exata da almofada dependerá das exigências do tempo da imagem latente, do tipo do agarose, da temperatura, do vedador do lamela, da taxa de evaporação, etc. Assim, é importante calibrar o sistema de imagem antes da aquisição de dados para aumentar a reprodutibilidade técnica e melhorar a qualidade da imagem de células ao vivo1,2,3. A superfície da almofada, a rigidez e a composição são essenciais durante a aquisição prolongada da imagem. O agarose tem a baixa fluorescência do fundo, pode facilmente ser moldado, e na concentração apropriada, resiste a deformação estrutural devido à evaporação. Além disso, combinando a mídia de levedura de fissão com agarose não compromete a qualidade da imagem e permite a observação prolongada de múltiplas mitoses e ciclos de meiose. Além disso, é importante evitar quaisquer bolhas de ar para microscopia de lapso de tempo. Dentro das almofadas do agarose dentro da amostra, os bolsos de ar expandem-se sobre o tempo, causando pilha-deslocando e interrompendo aviões focais. As células fornecidas são eficientemente distribuídas por rotação de lamínula, os pesquisadores podem seguir processos mitóticos em várias gerações e eventos meióticos da fusão nuclear à esporulação. Fazer e escolher o pad certo para experimentos de imagem leva tempo para dominar, mas uma vez alcançado, pode contribuir para observações de microscópio altamente informativo.
Como é o caso com outros métodos, a microscopia da viver-pilha não está livre das limitações técnicas. O uso de proteínas marcadas com fluorescently introduz limites para experimentos que limitam o escopo do que pode ser estudado. Foto-branqueamento e foto-toxicidade são problemas típicos de aquisição de imagem prolongada. Eles podem ser contraídos por não expor as células a comprimentos de onda curtos por muito tempo ou muito freqüentemente. Para experimentos envolvendo GFP, CFP, YFP, mRFP e DsRed, as proteínas fluorescentes típicas utilizadas na imagem de células ao vivo de levedura de fissão, é comum empregar 5-15% de luz de excitação e tempo de exposição de 100-500 ms para experimentos de rotina. Esses parâmetros mudam, no entanto, de acordo com os requisitos específicos do experimento do pesquisador. Além disso, as pilhas z compostas por 9-13 seções com espaçamento de 0,5 μm usando um objetivo de 60x são suficientes para resolver a espessura de uma célula de levedura de fissão. Além disso, é importante confirmar que os marcadores fluorescentes não interrompem o regulamento ou a função apropriada de proteínas do alvo ou geram phenotypes espurious. Assim, é aconselhável construir cepas contendo diferentes Tags fluorescentes e de afinidade para o mesmo gene alvo para corroborar observações por diferentes meios. Além disso, é da responsabilidade dos pesquisadores garantir que os parâmetros experimentais possam ser reproduzidos em experimentos e que os dados coletados estejam aptos para a análise a jusante1,3. Nenhuma tecnologia pode substituir a prática testada pelo tempo de validar meticulosamente sistemas experimentais por observação cuidadosa e exame rigoroso de linearidade na detecção de sinais fluorescentes.
Por fim, é crucial analisar dados de microscopia em formatos que não modifiquem imagens brutas. Fiji fornece excelentes ferramentas de documentação para acompanhar as medições de dados brutos e permite que os pesquisadores examinem diferentes parâmetros de células em uma única sessão. Estas características, bem como a sua riqueza de tutoriais on-line e extensa cobertura da literatura, fazem de Fiji uma importante ferramenta para medir, analisar e apresentar dados de imagens de células ao vivo que descrevem a dinâmica nuclear do fermento de fissão em mitose e meiose.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Natalia la Fourcade e a Mon LaFerte por fazerem da preparação deste manuscrito um empreendimento mais agradável. Agradecimentos aos membros do laboratório de Forsburg que contribuíram à conclusão deste trabalho com suas introspecção, idéias do experimento, e sustentação moral. Este projeto foi apoiado por NIGMS R35 GM118109 para SLF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
| Adenine | Sigma | A-8751 | |
| Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
| Agarose | Sigma | A9539-500g | |
| Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
| Biotin | Sigma | B-4501 | |
| Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
| CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
| Citric acid | Sigma | C-0759 | |
| Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
| Cover slip | VWR | 16004-302 | |
| CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
| DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
| Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
| FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
| Histidine | Sigma | H8125-100g | |
| Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
| Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
| Incubator | Shell lab | #3015 | |
| Inositol | Sigma | I-5125 | |
| Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
| Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
| Leucine | Sigma | L8912-100g | |
| Lysine | Sigma | L5626-500g | |
| Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
| MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
| MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
| Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
| MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
| Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
| Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
| Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
| Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
| Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
| Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
| softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
| Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
| Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
| Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
| Vaseline | Equaline | F79658 | |
| Yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
| Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
| ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |
References
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. DNA Replication. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).
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