Summary
Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.
Abstract
Live-Cell Imaging is een microscopie techniek die wordt gebruikt om cel-en eiwit dynamica in levende cellen te onderzoeken. Deze beeldvormings methode is niet giftig, heeft over het algemeen geen invloed op de celfysiologie en vereist een minimale experimentele behandeling. De lage niveaus van technische interferentie stellen onderzoekers in staat om cellen te bestuderen over meerdere cycli van mitose en om de meiose van begin tot eind te observeren. Met behulp van fluorescerende Tags zoals groene fluorescerende eiwitten (GFP) en rood fluorescerende proteïne (RFP), kunnen onderzoekers verschillende factoren analyseren waarvan de functies belangrijk zijn voor processen zoals transcriptie, DNA-replicatie, cohesie en segregatie. In combinatie met data-analyse met behulp van Fiji (een gratis, geoptimaliseerde ImageJ-versie), biedt Live-Cell Imaging verschillende manieren om de eiwit beweging, lokalisatie, stabiliteit en timing te beoordelen, evenals nucleaire dynamiek en chromosoomsegregatie. Echter, zoals het geval is met andere microscopie methoden, wordt Live-celbeeldvorming beperkt door de intrinsieke eigenschappen van licht, die een limiet stellen aan het afwikkelings vermogen bij hoge vergroingen, en ook gevoelig zijn voor fotobleaching of fototoxiciteit bij hoge golflengte Frequenties. Met enige zorg kunnen onderzoekers deze fysieke beperkingen echter omzeilen door zorgvuldig de juiste omstandigheden, stammen en fluorescerende markers te kiezen om de juiste visualisatie van mitotische en Meiotische gebeurtenissen mogelijk te maken.
Introduction
Met Live-cel microscopie kunnen onderzoekers de nucleaire dynamiek onderzoeken zonder de gistcellen van splijting te doden en zijn er geen dodelijke fixeermiddelen en vlekken meer nodig. Het is mogelijk om de stabiliteit, beweging, lokalisatie en timing van fluorescently gelabelde eiwitten te observeren die betrokken zijn bij belangrijke gebeurtenissen zoals chromosoom replicatie, recombinatie en segregatie, naast het membraan en cytoskelet Bewegingen. Door het behoud van de levensvatbaarheid van de cel en niet-toxisch signaaldetectie, er is minimale fysiologische inbraak. Wanneer het goed wordt uitgevoerd, kan deze microscopie methode verstorende effecten die voortvloeien uit de uitgebreide technische behandeling of van valse chemische reactiviteit verminderen. Bovendien, tijdens een experiment, onderzoekers kunnen relevante waarnemingen van splijting gist voedings-en stress toestanden, proliferatieve efficiëntie, en apoptotic status die duiden op ongepaste imaging parameters of abnormale cel fysiologie maken1 ,2,3.
Mitose en meiose worden gekenmerkt door nucleaire en cellulaire divisie. In de meiose, in tegenstelling tot de mitose, wordt het genetische gehalte gehalveerd, aangezien de moeder cellen leiden tot dochtercellen4. Omdat Live-celbeeldvorming een temporele dimensie biedt naast de ruimtelijke relatie, kunnen grote aantallen cellen in real-time worden bekeken. Live-Cell microscopie heeft onderzoekers in staat om de dynamiek van nucleaire divisie te onderzoeken met behulp van fluorescerende Tags voor histonen5, cohesin subeenheden6, microtubuli7, centromeren8, kinetochoren9, componenten van de spil paal Body (SPB)10, en die van het chromosoom passagiers complex (CPC)11. Buiten het chromosoom scheidings apparaat heeft Live-celbeeldvorming ook het gedrag van eiwitten nodig, maar niet direct betrokken bij chromosoomsegregatie. De functie van deze eiwitten is aangetoond dat het invloed heeft op replicatie, chromosoom recombinatie, nucleaire beweging en chromosoom gehechtheid aan microtubuli12,13,14. Deze waarnemingen hebben bijgedragen tot een beter begrip van cellulaire gebeurtenissen waarvan de functionele componenten niet vatbaar waren voor biochemisch of genetisch onderzoek. Met nieuwe vooruitgang in microscopie-technologie zullen beperkingen zoals slechte resolutie, foto bleken, fototoxiciteit en focus stabiliteit afnemen, waardoor betere real-time waarnemingen van mitotische en Meiotische nucleaire dynamica 1 worden vergemakkelijkt, 2,3. Meiose is bijzonder uitdagend omdat het een terminaldifferentiatie traject is dat nauw aandacht moet schenken aan timing.
Het doel van dit protocol is om een relatief eenvoudige methode te presenteren voor het onderzoeken van real-time splijtstof gist kern dynamiek in mitose en meiosis. Om dit te bereiken, is het noodzakelijk om cellen te gebruiken die niet zijn blootgesteld aan milieubelasting, agarose-pads voorbereiden die langdurige beeldvorming kunnen weerstaan, en cellen monteren op dichtheden die de visualisatie van eencellige dynamiek vergemakkelijken. Bovendien maakt dit protocol gebruik van cellen die fluorescentioneel gelabelde eiwitten dragen die dienen als nuttige markers voor nucleaire kinetiek (Hht1-mRFP of Hht1-GFP), chromosoomsegregatie (Sad1-DsRed), cytoskelet dynamiek (Atb2-mRFP), transcriptionele activering in G1/S (Tos4-GFP) en cohesie stabiliteit in de meiose (Rec8-GFP). Deze methode introduceert ook extra nucleaire en cytosolische markers (tabel I) die kunnen worden gebruikt in verschillende combinaties om vragen over specifieke cellulaire processen aan te pakken. Bovendien zijn basis Fiji-tools beschikbaar om onderzoekers te helpen Live-celbeelden te verwerken en verschillende soorten gegevens te analyseren. De kracht van deze aanpak vloeit voort uit het gebruik van real-time waarnemingen van eiwit dynamica, timing en stabiliteit om processen te beschrijven die integraal zijn voor de goede uitvoering van mitose en meiosis.
Protocol
1. Media voorbereiding15,16
- Stock oplossingen
- Bereid een 50x zout voorraadoplossing door toevoeging van 52,5 g MgCl2· 6h20, 0,735 g CACL2· 2H20, 50 g KCl en 2 g na2S04 in een fles met 1 L gedistilleerd water. Meng de oplossing grondig en steriliseren door filtratie. Plaats bij 4 °C voor lange termijn opslag.
- Maak een 1, 000x vitamine voorraadoplossing door 1 g Pantotheenzuur te mengen, 10 g nicotinezuur, 10 g inositol en 10 mg Biotine in een fles met 1 L gedistilleerd water. Meng de oplossing goed en steriliseren door filtratie. Bewaren bij 4 °C voor lange termijn opslag.
- Bereid een 10, 000x minerale stamoplossing door 5 g boorzuur toe te voegen, 4 g MnSO4, 4G znso4· 7h2o, 2 g fecl2· 6h2o, 1 g ki, 0,4 g molybdeen zuur, 0,4 g van CuSO4· 5H20 en 10 g citroenzuur in een fles met 1 L gedistilleerd water. Meng de oplossing grondig en steriliseren door filtratie. Plaats bij 4 °C voor lange termijn opslag.
- Maak individuele nutriënt voorraadoplossingen door 7,5 g adenine, Leucine, histidine of lysine toe te voegen aan een fles met 1 L gedistilleerd water. Gebruik slechts 3,75 g om de uracil-oplossing te maken. Steriliseer oplossingen door autoclaven.
Opmerking: Na verloop van tijd, uracil neerdringt uit de oplossing. Om weer in de oplossing te brengen, warm in de magnetron op 60% vermogen in stappen van 10 s of plaats in een waterbad van 55 °C gedurende 20 min. Draai de warme oplossing om totdat alle uracil klonters verdwijnen.
- Gistextract plus supplementen (Ja)
- Voeg in een kolf van 2 L 1 L gedistilleerd water toe, 5 g gistextract Base, 30 g glucose en 225 mg elk van adenine, uracil, L-histidine, L-leucine en L-lysine. Voeg 20 g agar toe om het vaste medium te maken.
- Gebruik een magnetische roerstaaf om ingrediënten volledig op te lossen in de oplossing. Agar zal smelten nadat het medium gesteriliseerd is door autoclaven.
Opmerking: Voor het gemak is gebruiksklare ja poeder ook commercieel beschikbaar.
- Edinburgh minimal medium (EMM) en pombe glutamaat medium (PMG)
- Combineer in een kolf van 2 L 1 L gedistilleerd water met 3 g kalium waterstof ftalaat, 2,2 g na2HPO4, 5 g NH4cl, 20 g glucose, 20 mL zoutvoorraad oplossing, 1 ml vitamine voorraadoplossing en 0,1 mL minerale voorraadoplossing. Vervang NH4Cl met 2,2 g L-glutaminezuur Mononatrium zout om PMG te bereiden. Voeg 20 g agar toe om het vaste medium te maken.
- Gebruik een magnetische roerstaaf en los de ingrediënten grondig op. Agar zal smelten nadat het medium gesteriliseerd is door autoclaven. Voeg voor gebruik indien nodig nutriënt voorraadoplossingen toe. Voor elke 1 L medium, voeg 15 mL elk van adenine, Leucine, histidine, en lysine. Gebruik 30 mL voor uracil, omdat het minder geconcentreerd is dan de andere voedingsoplossingen.
Opmerking: Voor het gemak zijn ook kant-en-klare EMM-en PMG-poeders in de handel verkrijgbaar.
- Moutextract (ME)
- Gebruik een kolf van 2 liter om 1 L gedistilleerd water te mengen met 30 g moutextract en 225 mg elk van adenine, uracil, histidine en leucine. Stel de pH in op 5,5. Neem 20 g agar om het vaste medium te maken.
- Los componenten op in de oplossing met behulp van een magnetische roerstaaf. Agar zal smelten nadat het medium gesteriliseerd is door autoclaven.
- Sporulatie agar met supplementen (kuuroorden)
- Voeg in een kolf van 2 L 1 L gedistilleerd water toe, 10 g glucose, 1 g KH2po4, 1 ml vitamine voorraad, 45 mg elk van adenine, uracil, histidine, leucine en lysine hydrochloride. Voeg 20 g agar toe om het vaste medium te maken.
- Gebruik een magnetische roerstaaf om ingrediënten grondig te combineren. Agar zal smelten nadat het medium gesteriliseerd is door autoclaven.
2. splijting gistcultuur15,16
- Gebruik YES Solid medium om de giststammen van de fissie te wekken van cryogeen conservering. Afhankelijk van de temperatuurvereisten van elke stam, incuberen bij 25 °C of 32 °C gedurende 3-5 dagen.
- Wanneer kolonies zichtbaar zijn, bereidt u een start vloeistof cultuur voor. Kies cellen uit individuele kolonies en inoculeren ze in reageerbuisjes met 3 mL ja vloeibaar medium. Groei op de juiste temperatuur naar de mid-of late-log fase.
Opmerking: Gebruik voor de juiste beluchting buizen of kolven met een volume van ten minste 5x groter dan het beoogde Trillingssnelheden tussen 150-220 rpm zijn gebruikelijk voor routine cultuur groei. - Verdeel 250-500 μL van de starter cultuur in een kolf van 50 mL die 9,5-9.75 mL Ja, EMM of PMG plus passende supplementen bevat. Laat cellen groeien tot de gewenste dichtheid en controleer onder de Microscoop op de juiste celmorfologie en voedingstoestand.
Opmerking: Voor het opslaan van ontwaakt stammen voor maximaal een maand, Seal ja platen met paraffine tape en plaats bij 4 ° c.
3. monstervoorbereiding2
- Microscoop-dia instellen
- Voeg 2 g agarose toe in een bekerglas van 500 mL met 100 mL van ofwel minimale medium plus supplementen (mitose) of vloeibare kuuroorden (meiose). Verwarm de agarose-oplossing in een magnetron met een vermogen van 60% in stappen van 10 sec. of plaats in een waterbad van 55 °C gedurende 10 min. zwenk de oplossing om efficiënt smelten te garanderen. Bereid de agarose Slide-Making opstelling (Figuur 1a) voor om de snelle pad voorbereiding te garanderen en voorkom dat gesmolten agarose voortijdig stollen.
- Laat de gesmolten agarose gedurende 1 minuut afkoelen bij kamertemperatuur en breng 50-100 μL vlekken op de Microscoop glaasjes aan met behulp van pipetpunten met een brede boring. Voordat de agarose afkoelt, plaatst u een Microscoop-dia op de bovenkant om een spread pad van ongeveer 1,5-2 cm in diameter te genereren (Figuur 1b-C). De breedte van het agarose-pad is meestal evenredig aan de lengte van de beeldvormings tijd. Met andere woorden, dikkere pads zijn bestand tegen langere beeldvormings perioden.
- Gebruik een koolwaterstof mengsel als een afdichtmiddel om te zorgen voor een juiste dekking van dia's met dikke agarose pads en om celdood te voorkomen van oplosmiddel blootstelling aan de afdek randen. Meng gelijke delen (w/w) van Petroleum gelei, lanoline en paraffine in een bekerglas van 500 mL. Verwarm de ingrediënten op een hete plaat bij 120 °C gedurende 5 minuten. Als onderdelen smelten, zwenk voorzichtig de gesmolten oplossing om te zorgen voor een juiste menging.
- Voorbeeld van Setup
- Voor het onderzoek van mitotische gebeurtenissen, groeien cellen uit starter culturen in vloeibare EMM of PMG plus aanvullingen op ongeveer halverwege log fase (OD595 van 0,4). Centrifuge 1 mL van de celsuspensie bij 1.375 x g gedurende 1 minuut, verwijder het supernatant en regeer de celpellet in het minimale medium plus supplementen tot een eindvolume van 100 μL.
- Voor het beeld van de Meiotische gebeurtenissen, groeien cellen uit starter culturen in de minimale medium plus aanvullingen op de fase van de late log (OD595 van 0.7-1.0). Combineer gelijke volumes van tegengestelde type cellen (h- en h+) in een 1 ml celsuspensie. Centrifugeer cellen bij 1.375 x g gedurende 1 minuut en hervat de pellet in Liquid me. Herhaal deze stap driemaal om te zorgen voor efficiënte nutriënten verwijdering.
- Na de laatste mij wassen, respendeer cellen in 1 mL van mij en voeg het toe aan een kolf van 50 mL met 9 mL ME. Inincuberen voor 12-16 uur bij 22-25 °C op minimale rotatiesnelheid (50-100 RPM). Overvloedige celflocculatie, wat resulteert in veel ronde splijting gist klonters en duidt op efficiënte paring.
- Neem 1 mL monster van de parings cultuur en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.375 x g . Elimineer het supernatant maar laat 250 μL in de buis om cellen te respenderen. Voor het plaatsen van cellen op agarose pads, Vortex krachtig voor 5 s om klonters te verstoren.
Opmerking: De resterende 250 μL die ik gebruikte om cellen te respenderen bevat parings factoren die de cellen helpen om meiosis in te voeren. - Plaats 20 μL van ofwel een mitotische of Meiotische celsuspensie op een 2% agarose pad. Verwijder het overtollige medium door de dia te inverteren en op de bovenkant van een pluisvrije papieren handdoek voor 2-3 s (afbeelding 1d) te plaatsen. Zet de schuif kant naar boven en plaats een glazen afdekplaat voorzichtig, zodat er geen luchtbelletjes ontstaan (Figuur 1f).
Opmerking: Het elimineren van overtollig medium met een papieren handdoek is meer tijd-efficiënt dan zwaartekracht absorptie, wat bijzonder belangrijk is bij meiose-experimenten. - Om een monolayer van een cel te maken, draait u de Afdeklijst rechtsom met de wijsvinger voor één (mitose) of twee (meiosis) volle bochten (Figuur 1f). Zorg ervoor dat de celstof verspreidt over de agarose pad waardoor een betere scheiding van afzonderlijke cellen of ASCI. Met behulp van een kleine houten stok, doseren gesmolten Sealant langs de randen van de dekslip om elk agarose pad te verzegelen (figuur 1g).
- Zodra het agarose pad is verzegeld, plaatst u het op de Microscoop en laat u het gedurende 10-15 minuten op de juiste beeldvormings condities (bijv. temperatuur) (afbeelding 1h) plaatsen om luchtbelletjes te laten afvoeren en eventuele veranderingen in het laatste moment van de agarose te laten plaatsvinden. Begin met Imaging zodra de dia efficiënt is geëscaleerd en verwijder deze niet uit het werkgebied totdat het verzamelen van gegevens is beëindigd.
Opmerking: Controle van de temperatuur en vochtigheid wordt bepaald door het gebruikte Microscoop systeem en specifieke experimentele eisen. Indien aanwezig, past u de temperatuur-en vochtigheidsregeling toe op alle beeldvormings experimenten. Als ze afwezig zijn, moeten onderzoekers een manier bedenken om temperatuurschommelingen te voorkomen, vooral tijdens meiose-experimenten.
4. Live-Cell Imaging2 en processing
- Gebruik de 40x-doelstelling om de juiste kijk velden naar de afbeelding te vinden. Schakel over naar de 60x-doelstelling om gegevens te verzamelen. Afhankelijk van het gebruikte Microscoop systeem zullen de daaropvolgende refocussering en het snijden op elk moment van het monster handmatig of via een microscoop-of softwaregeautomatiseerd proces plaatsvinden.
Opmerking: De beelden in dit protocol werden verzameld met behulp van een deconvolutie, fluorescentie Microscoop uitgerust met Sedat, RFP en GFP filter sets, nano-Motion stage, 60x NA 1,4 objectief lens, en 12-bit CCD camera. Ingebouwde mechanische rolluiken en gemotoriseerde filter wielen toegestaan voor de verminderde excitatie blootstelling en fotobleaching van monsters. - Gebruik de juiste software om afbeeldingen te verkrijgen en te verwerken. Om afbeeldingen te deconvolve, gebruik van door de fabrikant geleverde optische overdrachtsfuncties.
Opmerking: Raadpleeg de tabel met materialenvoor meer informatie over de Microscoop-apparatuur en software die in dit protocol wordt gebruikt. - Om een conventionele fluorescentiemicroscoop te gebruiken om live-celbeelden te verkrijgen, zorgt u ervoor dat de Microscoop gegevens digitaal verzamelt, heeft 40x of 60x doelstellingen met numerieke diafragma's (NA) groter dan 1,2, en is in staat om optische snijden uit te voeren.
Opmerking: Zonder deze vereisten zullen afbeeldingen een gereduceerde resolutie vertonen, wat de kwaliteit van microscopische metingen en kwalitatieve waarnemingen in gevaar brengt. - Gebruik gratis plug-in-programma's (bijvoorbeeld Fiji) om systematische vervagings fouten te minimaliseren die voortvloeien uit het contrast verlies tijdens de beeld verwerving17,18,19,20 en om een juiste kwantitatieve analyse te garanderen van de intensiteit van de fluorescentie en van andere tijdelijke en dynamische gebeurtenissen in de cel.
Opmerking: Andere beschikbare commerciële deconvolutie Programma's zijn te vinden in de tabel van de materialen. - Kies de Microscoop filter sets die het best overeenkomen met de fluorohores onder observatie. Zorg ervoor dat de excitatie-en emissie filters de juiste band passen hebben die de specifieke detectie van fluorescerende eiwitten mogelijk maken. Om bijvoorbeeld het GVB-signaal te detecteren, is een excitatie-en emissie band-pas van 430/25 en 470/30 geschikt, maar niet voor de fluorescentie van RFP.
- Gebruik een minimaal-effectieve-instellingenbenadering (MESA) bij het uitbeelden van splijtings gist op meerdere tijdstippen. Met andere woorden, Vermijd langdurig gebruik van excitatie golflengten en gebruik het laagste excitatie vermogen en de blootstellingstijd die acceptabele, maar kwantificeerbare en reproduceerbaar beeldvormings gegevens genereren.
- Voor langdurige beeldvorming tijdens mitose of meiose, beperk het interval tussen de acquisitie tijdpunten tot 5-10 min. Hoewel 2% agarose pads kunnen weerstaan 12 tot 16 h Imaging sessies, celverschuiving als gevolg van agarose verdamping is waarschijnlijk. Voer daarom volledige mitose-of meiosisexperimenten uit in respectievelijk 4-6 h-of 8-10 h-Vensters.
- Verzamel beeldgegevens voor 4-8 h bestaande uit ten minste 24-48 acquisitie tijdpunten, respectievelijk één fluorescentie proteïne, en een z-stack per tijdspunt en fluorescerende kanaal bestaat uit 13 secties met 0,5-μm afstand met behulp van een 60x-doelstelling. Hiervoor is ten minste 0,5-1 GB opslagruimte op de harde schijf vereist. Dus, naast het elimineren van photobleaching en celverschuiving, maak een workflow die rekening houdt met computercapaciteiten1,2,3.
Opmerking: Deze acquisitie parameters worden meestal ingesteld en gewijzigd in de software die de Microscoop functies regelt en die afbeeldingen verzamelt en verwerkt. - Om specifieke nucleaire processen nader te bestuderen, voert u elke 5-10 s Image Acquisition uit, zolang de emissie na frequente blootstelling niet substantieel afneemt. Voer een voorlopige analyse van de fluorescentie intensiteit uit gedurende verschillende tijdsperioden om het punt te bepalen waarna de juistheid van de verzamelde gegevens niet langer betrouwbaar is,1,3.
- Gebruik in de software voor het verzamelen en het verwerken van afbeeldingen maximale intensiteit projectie op de afbeelding z-stacks om alle structuren met een hoge fluorescentie dichtheid op een 2D-vlak te observeren, ongeacht hun verticale locatie1,2, 3. Dit vergemakkelijkt een snel onderzoek van nucleaire processen die zich voordoen in verschillende voxels. Verzamel een mid-focale helder-veld afbeelding om een referentiebeeld van de cellen onder observatie te genereren.
5. imageanalysis20,21
Opmerking: Beeldanalyse in dit protocol wordt uitgevoerd met behulp van Fiji. Voor andere analyseprogramma's en Fiji-invoegtoepassingen Zie tabel met materialen.
- Upload een gedeconvolved afbeelding door de importfunctie voor bio-indelingen te selecteren in het menu plugins . Selecteer in het pop-upvenster import opties de optie Hyper stack, standaardkleur modusen controleer automatisch schalen voordat u op de knop OK drukt.
- Zorg ervoor dat het weergegeven venster het juiste aantal fluorescentie kanalen en tijdframes heeft door opzij te schuiven op de respectievelijke staven onderaan. Opslaan als een TIFF-bestand, dat geen gegevens comprimeert en informatieverlies voorkomt.
- Open een afbeelding met een schaalbalk die is gegenereerd tijdens de gegevensverwerking door de Microscoop-software. Bepaal de pixellengte van de schaalbalk met behulp van het gereedschap rechte lijn om een parallelle lijn van vergelijkbare grootte te tekenen en selecteer meten in het menu analyseren. Voeg een schaalbalk toe door de pixel-naar-μm-verhouding in te stellen door schaal instellen te selecteren in het menu analyseren.
- In het pop-upvenster schaal instellen , voert u de berekende afstand in pixels en bekende afstand in μmin, stelt u de pixel verhouding in op 1,0, plaatst u micron als de lengte-eenheiden controleert u het algemene vak voordat u op de OK knop.
- Gebruik de optie metingen instellen onder het menu analyseren om verschillende parameters te kiezen om te kwantificeren bij het selecteren van meting. Voor de toepassing van dit protocol, selecteer de volgende metrische gegevens: gebied, omtrek, gemiddelde grijswaarde, mediaan, Min & Max grijswaarde, geïntegreerde dichtheid, stack positie, en weergave Label.
- Afhankelijk van de precisie van de verzamelde gegevens, voer meer dan 1 voor de decimale plaatsen optie en controleer de wetenschappelijke notatie vak indien nodig. Na het toepassen van de opdracht Measure worden in een pop-upvenster met resultaten de waarden voor elke relevante parameter weergegeven. Sla de resultaten op als CSV-bestand voor toekomstige analyse in een Statistiekprogramma.
Opmerking: Het is niet nodig om een afbeelding in de samenstellende fluorescerende kanalen te scheiden om de lengte te bepalen, tenzij er signaalinterferentie is tussen de verschillende kleuren in welk geval de onderstaande stap volgt. - In het geval van signaalstoring, Selecteer kleur en kanalen gereedschap in het menu afbeelding en analyseer elke kleur afzonderlijk. Als u de lengte van niet-lineaire structuren wilt meten, klikt u met de rechtermuisknop op het gereedschap lijn en gebruikt u de optie gesegmenteerde lijn of vrije Handlijn om de gewenste objecten te traceren.
- Voor lineaire structuren of om de afstand tussen twee punten te bepalen, gebruikt u de functie voor rechte lijnen en selecteert u meten in het menu analyseren . Waarden voor lengte in μm worden automatisch toegevoegd aan de parameters die eerder zijn geselecteerd onder de optie metingen instellen .
- Voor het meten van veranderingen in de signaal grootte en de intensiteit van de fluorescentie, maakt u eerst een regio van belang (ROI)-bibliotheek, die de kwantificerings nauwkeurigheid verhoogt en snelle metingen in een afbeeldingsstapel vergemakkelijkt. Selecteer het gereedschap kleur en kanalen onder het menu afbeelding .
- Controleer in het pop-upvenster kanalen het kleurkanaal waarvoor de intensiteit of het gebied wordt gemeten. Kies de functies aanpassen en drempel in het menu afbeelding . Controleer de donkere achtergrond vak, selecteer de standaard methode (tenzij anders vereist door de verzamelde gegevens) en kies rood om de signalen van belang te bedekken.
Opmerking: Meting van de stabiliteit van eiwitten, beweging en lokalisatie zijn nauw afhankelijk van de kleur drempel die wordt gebruikt voor het maken van ROI-bibliotheken. Het is belangrijk om de juiste drempelmethode te kiezen voor het type fluorescerende marker signaal dat wordt gevisualiseerd17,18. - Gebruik het gereedschap Toverstaf om elke structuur van de interesse te markeren en druk op de letter T op het toetsenbord om de geselecteerde ROI toe te voegen aan het pop-up ROI Manager -venster. Herhaal dit proces voor elk segment (tijdsbestek) in de afbeeldingsstapel en sla alle ROIs op door op de knop meer te klikken en Opslaante selecteren.
- Open de gezipte ROI-map om de ROI Manager te laden en klik op elke ROI-id in het linker zijpaneel. Selecteer meten in het menu analyseren en herhaal deze opdracht voor elke ROI-id om de objecten van belang te kwantificeren in alle segmenten van de afbeeldingsstapel.
- Als het verschuiven van cellen geen probleem is en het brandvlak hetzelfde blijft voor alle segmenten van de stapel, klikt u op multi Measure in de ROI Manager. Selecteer in het pop-upvenster alle segmenten meten in plaats van één rij per segment om metingen over de afbeeldingsstapel te herhalen. Sla resultaten op als een CSV-bestand en analyseer metingen in een Statistiekprogramma.
- Voor meerdere nucleaire signalen met de structuur van belang, druk op de SHIFT -toets bij het selecteren van objecten met de tool toverstaf om een enkele ROI te maken. U ook een ROI van constante grootte maken met het gereedschap Ovaal om alle signalen van belang te omvatten.
Opmerking: Deze ovale benadering kan nodig zijn om het signaal gedrag te meten en te beschrijven over een gebied waar het fluorescentie signaal in de loop van de tijd in grootte en intensiteit verandert. Signaalintensiteit, in dit geval, is de gemiddelde signaal dichtheid over een bepaald gebied. - Kwalitatief bepalen van de co-lokalisatie van twee fluorescerende signalen door de verandering in de kleur van de signaal overlap regio. Echter, als de co-lokalisatie zone vernauwt, het is moeilijker om te onderscheiden van signaal overlapping. In dit geval volgt u de onderstaande stappen.
- Teken met het gereedschap kanalen, zoals beschreven in stap 5,6, een rechte lijn over elk signaal in kwestie en selecteer de opdracht Profiel plot in het menu analyseren.
- Herhaal deze stap voor alle kleuren in kwestie met dezelfde getekende lijn.
- In het plot van het pop-upvenster voorbeeld dat na elke profilerings stap wordt weergegeven, drukt u op de knop List om een venster met plot waarden op te roepen en slaat u de metingen voor elk signaal op als een CSV-bestand.
- Maak in een Statistiekprogramma een grafiek waarin de grijze waarde voor elk signaal wordt uitgezet ten opzichte van de corresponderende locatie (in μm) langs de getekende lijn. Gebrek aan overlap tussen signaal profiel plots duidt in het algemeen op het gebrek aan co-lokalisatie.
Opmerking: Gebruik de tool plot profile op geprojecteerde afbeeldingen om de co-lokalisatie van het signaal te onderzoeken. Dit is alleen betrouwbaar als een dergelijke overlapping ook wordt waargenomen door de afbeelding z-stack.
- Gebruik het gereedschap multi Kymograph in het menu analyseren om het dynamische gedrag van fluorescerende eiwitten na verloop van tijd te bewaken. De resulterende afbeelding toont de fluorescerende signaal beweging door een reeks verkorte snapshots in elk segment van de z-stack, die individuele tijdpunten representeert.
- Gebruik het hulpprogramma kanalen zoals beschreven in stap 5,6 om het object van belang in het juiste kanaal te isoleren. Zorg ervoor dat het geselecteerde object of de structuur niet aanzienlijk verschuift door de z-stack. Plaats een rechte lijn of rechthoek over het object, selecteer het gereedschap multi Kymograph in het menu analyseren en voer de gewenste breedte in van de lijn die het object overlegt.
- Maak beeld panelen die nucleaire dynamiek over een bepaald tijdvenster laten zien met behulp van het gereedschap kanalen zoals beschreven in stap 5,6 en door de stapels te selecteren en montage hulpmiddelen te maken in het menu afbeelding. Voer in het pop-upvenster maken van de montage het gewenste aantal kolommen en rijen in, stel een schaal factor van 1,0 in, kies de eerste en laatste segmenten (tijdframes) en wijzig de randbreedte in ten minste 5 voordat u op OK drukt. Het is mogelijk om te kiezen welke afbeeldingen in de stapel moeten worden weergegeven door stappen te wijzigen die passen bij de gewenste volgorde.
- Als u een film wilt genereren, uploadt u de gewenste Hyper stack, selecteert u Opslaan als een AVI -bestand in het menu bestand , kiest u geen voor compressieen voert u een frame snelheid van 2-8 fps in. Selecteer de opdracht montage maken tijdens het verzamelen van samengestelde in het gereedschap kanalen om alle kleuren die de afbeelding omvatten samen te voegen of te scheiden.
Opmerking: In dit protocol zijn twee AVI-bestanden (film 1-2) beschikbaar. Gebruik ze in Fiji om verschillende functies te proberen die in stap 5 zijn gemarkeerd. - Als u één representatieve cel wilt weergeven, gebruikt u Transformeren en roteren in het menu afbeelding en voert u de rotatie graden in. Negatieve getallen roteren objecten naar links, terwijl positieve waarden objecten naar rechts roteren. Zodra de cel zich in de juiste richting bevindt, tekent u een rechthoek die de hele cel beslaat via de z-stack of tijdens de tijdsperioden en selecteer bijsnijden in het menu afbeelding . Ga verder zoals vermeld in stap 5,16 en 5.16.1 om een beeldpaneel of film te genereren.
- Als u een film wilt genereren, uploadt u de gewenste Hyper stack, selecteert u Opslaan als een AVI -bestand in het menu bestand , kiest u geen voor compressieen voert u een frame snelheid van 2-8 fps in. Selecteer de opdracht montage maken tijdens het verzamelen van samengestelde in het gereedschap kanalen om alle kleuren die de afbeelding omvatten samen te voegen of te scheiden.
- Voeg een schaalbalk toe aan het beeldpaneel of de film door extra en schaalbalk te selecteren in het menu analyseren. In de schaalbalk pop-upvenster, voer 5-15 voor breedte in micron voor afzonderlijke cellen of 100-250 voor hele velden van weergave, kies wit of zwart voor kleur, en kies een geschikte locatie voor het plaatsen van de schaalbalk.
- Voor films is het handig om tijd progressie te tonen tijdens nucleaire evenementen. Als u tijdwijziging tussen frames wilt weergeven, selecteert u afbeelding, klikt u op stapels, gebruikt u het gereedschap tijds stamper , geeft u het start frame in de tijdreeks aan en selecteert u een geschikte locatie voor de tijdweergave.
Representative Results
Of Live-celbeeldvorming wordt gebruikt voor mitose of meiosis, het is van cruciaal belang om gezonde splijtings gistcellen te gebruiken voordat u een type observatie maakt. De kwaliteit van de resulterende gegevens is sterk afhankelijk van het uitgangsmateriaal. Als cellen verhongeren als gevolg van nutriënten beperking of overmatige groei, zullen ze overtollige vacuolen en verlaagde celgrootte vertonen (honger, Figuur 2a). Voor mitose-experimenten is het het beste om te voorkomen dat cellen worden gebruikt die cellulaire stress vertonen (honger, Figuur 2a). Anders zullen experimentele resultaten inconsistent en irreproduceerbaar zijn. Om deze beperking te omzeilen, kies goede wild type controles en vertrouwd te raken met de verschillende fenotypes van de belangstelling. Bijvoorbeeld, mitotische cellen uitgehongerd voor 12 h ophouden actief te repliceren DNA. Aangezien Tos4-GFP-expressie wordt geassocieerd met G1/S-Phase-activiteit22,23, logaritmische cellen die deze marker dragen en één voor nucleaire divisie (Sad1-dsred10) Toon pan-nucleaire Tos4-GFP-expressie, Sad1-dsred Foci scheiding en voortdurende septatie (suggereert actieve DNA-replicatie en celdeling) (log, Figuur 2a), terwijl uitgehongerde cellen geen dergelijke activiteit vertonen (verhongering, Figuur 2a). Dit resultaat is consistent met de effecten van voedings beperking in splijtings gist, die de transcriptie in G1 verlaagt, het G1/S-celcyclus controlepunt activeert en G0 entry5bevordert. Voor meiose-experimenten moeten cellen uitgroeien tot een hoge dichtheid, maar zonder de stationaire fase te bereiken. Daarna worden cellen van beide paren soorten gemengd en geïntrigeerd in lage stikstof media. Niet-paren, zoals het geval is wanneer cellen niet voldoende uitgehongerd zijn van stikstof, zullen voorkomen dat ze meiose invoeren (inefficiënt, Figuur 2b). Robuuste flocculatie van de parings celsuspensie verhoogt de interactie tussen cel en cel en geeft zo een succesvolle paring en efficiënte Meiotische inductie (efficiënt, Figuur 2b).
Agarose gelpads en fysieke verstoring van celklonters garanderen een goede visualisatie van enkelvoudige cellen of ASCI (log, Figuur 2a; Efficiënt, Figuur 2b). Pads moeten zorgen voor een stijf, maar vochtig platform waarop cellen tegelijkertijd worden vastgezet en beschermd tegen uitdroging. Bovendien moeten de pads dik genoeg zijn om de veranderingen door verdamping te weerstaan en een oppervlak te bieden dat de juiste scherpstelling in de hele beeld overname mogelijk maakt (figuur 1c). Dekslip rotatie is noodzakelijk om cellen binnen parings aggregaten te scheiden en te verspreiden (Figuur 1f; Efficiënt, Figuur 2b). Zonder deze stap worden er weinig ASCI maar tal van haploïde cellen waargenomen, omdat ASCI opgesloten raakt in ontoegankelijke lagen van parings klonten, terwijl haploïde cellen vrij zijn om alle beschikbare monolaag spots te vullen (Figuur 2b). Zelfs voor mitotische experimenten, waarbij celklontering minder problematisch is, verplaatst dekslip rotatie cellen rond de pad om een enkele cellaag te creëren met voldoende ruimte tussen cellen om verdringingseffecten te verminderen en om celduplicatie mogelijk te maken (log, Figuur 2a ).
Atb2 is een α-tubulin-component die betrokken is bij chromosoomsegregatie in splijtings gist mitose en meiose7,14. Wanneer fluorescently gelabeld, deze cytoskelet component maakt onderzoek van de stadia die nucleaire scheiding in mitose karakteriseren. Tijdens de profase (0 '-20 ', Figuur 3a), treedt nucleatie van de mitotische spil op in de nucleaire kant van de spil paal lichamen (spbs), zoals onthuld door Atb2-mrfp-vezels tegen een pan-nucleaire achtergrond van HTT1-GFP5 . Tijdens de metafase-anafhase overgang (20 '-40 ', Figuur 3a) strekt de mitotische spil zich naar buiten toe en splitst de Nucleus in tweeën. Als de cel telophase invoert (60 '-80 ', Figuur 3a), breidt Atb2-mrfp bidirectioneel uit totdat de chromosomen volledig zijn gescheiden. Na dit punt, Atb2-mrfp vezels regroeperen en verspreid over het celoppervlak te herwinnen hun interfase vorm in elk van de resulterende dochtercellen. Cytokinesis (> 120 ', Figuur 3a) treedt alleen op nadat een septum vormt en verdeelt de cel door splijting. Volgende veranderingen in Hht1-GFP intensiteit over een mitotische cyclus onthult drie belangrijke stappen in de nucleaire dynamiek: metafase-anaphase (gemiddelde intensiteit, DNA verdichting: 20 '-40 ', Figuur 3a-B), telophase (lage intensiteit, DNA-scheiding: 60 '-80 ', Figuur 3A-B) en G1 (toenemende intensiteit, DNA-duplicatie: 100 '-120 ', Figuur 3a-b). Evenzo, maar met behulp van cellen die alleen Hht1-mRFP dragen en het gebruik van de multi-kymograph tool (zie stap 5,15) in Fiji, is het mogelijk om te observeren mitotische divisie van metafase naar telophase en evalueren van de nucleaire bewegingen die betrokken zijn bij de juiste zuster chromatide scheiding (normaal, figuur 3c). Mis-segregatie kymografen tonen signaal activiteit tussen de twee belangrijkste nucleaire paden, wat duidt op mogelijke mis-segregatie als gevolg van chromosoom fragmentatie of ongepaste chromatide scheiding (achterblijvende, figuur 3c).
Zoals eerder vermeld, in ontluikende en splijtings gist, wordt Tos4 in G1 getranscribeerd en functioneert het tijdens DNA-replicatie in S-fase22,23. Dit kan worden waargenomen in een kymograph waar Tos4-GFP expressie toeneemt in de Nucleus na Sad1-dsred10 Foci verplaatsen naar tegengestelde richtingen (wat duidt op nucleaire divisie), maar voordat de septum formulieren, die voorafgaat aan cytokinese (39 ', figuur 3D ; 36 ', figuur 3e). De fase van de High Tos4-GFP-activiteit begint aan het einde van de M-G1/S-transitie (45 ', figuur 3e) en eindigt in G2 (> 60', figuur 3e), direct na de celdeling. Hoewel sterk verspreid tijdens G1, verhoogt de Tos4-GFP-signaalintensiteit de post-anafase en de gehele S-fase en co-localiseert met gescheiden Sad1-dsred Foci (45 '-60 ', figuur 3e). Dit resultaat onthult de septatie periode in splijtings gist wanneer genoom duplicatie is begonnen in dochtercellen (G1/S), maar cytokinese is nog niet opgetreden.
Hht1 is Histon h3 in splijtings gist en wordt vaak gemodificeerd met fluorescerende Tags om nucleair DNA5,14te visualiseren. In mitose worden, naarmate cellen overgaan van metafase naar telophase (20 '-120 ', Figuur 3a), twee te onderscheiden veranderingen in kern massa waargenomen. De eerste verandering omvat een samentrekking van de nucleaire omvang in de metafase (20 ', Figuur 3a), terwijl de tweede de Nucleus splitsing vertoont tijdens anafase (40 ', Figuur 3a). Naast het delen van deze veranderingen met mitotische cellen, vertonen Meiotische cellen nucleaire oscillatie (d.w.z., paardenkop) (-100 ' tot-50 ', figuur 4a-B) tijdens homologe recombinatie en verdere reductie van Nucleus grootte aan het einde van anafase II (70 '-90 ', Fig. 4a). Hht1-mRFP wordt gebruikt voor het onderzoeken van niet-segregatie fenotypes zoals achterblijvende of gefragmenteerde chromosomen (achterblijvende, figuur 3c). Het wordt ook gebruikt om de nucleaire dynamiek in elk van de fasen van de meiose te observeren en te beschrijven (figuur 4a-B). Kern massa is groot en fluctueert in grootte tijdens veel paarsgewijs (HT:-100 ' tot-50 ', figuur 4a-B)). Als cellen invoeren metafase (MT:-40 ' naar 0 ', Afbeelding 4a-B), nucleaire grootte en oscillatie afname, consistent met verhoogde condensatie activiteit in dit stadium. Het begin van beide anafase I (MI: 10 '-60 ', figuur 4a-b) en II (MII: 70 '-90 ', figuur 4a-b) wordt geassocieerd met verdere nucleaire reductie en gebrek aan nucleaire beweging, die goed correleert met de twee nucleaire divisies die kenmerkend zijn voor meiose I en II (MI & Mii). Zo wordt meiose geassocieerd met schommelingen in de nucleaire grootte wanneer homologe chromosomen uitlijnen en opnieuw combineren en met nucleaire grootte verlagingen na twee rondes van chromosoom scheiding. Allelen die deze nucleaire dynamiek veranderen zijn waarschijnlijk geassocieerd met genoom stabiliteits regulatie in meiose12,13.
Rec8 is de α-kleisin subeenheid van Meiotische cohesin in splijtings gist. Het wordt geladen op de chromatine na DNA-replicatie (mei-S) en houdt zuster chromatiden vastgebonden aan elkaar tot anafase II. Na metafase I wordt Rec8 uit chromosoom armen verwijderd door separase en wordt het door Sgo1-PP2A beschermd bij het centromeer. Aan het einde van de scheiding van homologatie wordt Rec8 ook geëlimineerd bij het centromere, waardoor zuster chromatide scheiding mogelijk is (figuur 5a)6,24. Rec8-GFP samen met markers van chromosoomsegregatie zoals Sad1-DsRed of Hht1-mRFP toestaan voor de visualisatie van de cohesie dynamiek tijdens de meiosis. Rec8-GFP-signaal is pan-nucleair tijdens mei-S (< <-90 ', figuur 5a-b), profase i (-90 ' tot-50 ' , figuur 5a-b) en metafase i (-40 ' tot 0 ', figuur 5a-b). Deze observatie onthult de associatie van Rec8-GFP langs chromosomen assen die DNA-duplicatie volgt. Als cellen anafase I (10 ', figuur 5a-B) binnenkomen, neemt de intensiteit van Rec8-GFP in de Nucleus af, maar blijft sterk bij het centromere, waar het een focus vormt in elke kern massa (20 '-70 ', figuur 5a-B). Dit resultaat is consistent met Rec8-GFP afbraak langs chromosoom armen, maar niet bij de centromere, die ontstaat na de scheiding van homologatie. Voordat anafase II, de Rec8 focus verdwijnt, bevrijden zuster chromatiden voor scheiding in Mii (70 '-80', figuur 5a-B). De Rec8-GFP-marker is dus nuttig om omstandigheden te onderzoeken die de oprichting, verwijdering en algehele stabiliteit van de Meiotische samenhang verstoren. In combinatie met een marker van nucleaire divisie zoals Hht1-mrfp5,13, Rec8-GFP kan worden gebruikt om tegemoet te komen aan vragen over hoe de cohesie timing en stabiliteit vóór en tijdens de meiose de juiste chromosoomsegregatie beïnvloeden12 ,13. Dit protocol heeft geen betrekking op eiwitten waarvan de dynamiek voornamelijk voorkomt in de cytosol. Tabel I toont echter een paar cytosolische eiwitten die vaak worden gebruikt om cytoskelet-en membraan processen te onderzoeken die nodig zijn voor endocytose, exocytose en cytokinese onder andere processen.
Figuur 1: voorbereiding van agarose pads voor Live-celbeeldvorming. A) montage van de schuif voorbereiding met behulp van een pipetpunt houder, labtape en Microscoop-dia's. Het plaatsen van dia's loodrecht op elkaar creëert een zak waar de agarose pad vormt. Toevoeging van labtape stukken aan de zijkanten past de agarose pad breedte aan de vereiste specificaties aan. (B) gesmolten agarose wordt afgekoeld voordat het op Microscoop-dia's wordt ingesteld om pads te maken. In deze stap is het noodzakelijk om het agarose-volume langzaam af te maken om luchtbellen te voorkomen. C) de bovenste schuif wordt op de uitgedoken agarose-vlek geplaatst om een cirkelvormig pad te vormen met een rechte ondergrond, zelfs randen en geen zichtbare scheurtjes. D) na het plaatsen van een monster van celsuspensie op het agarose-pad, omkeren van de glijbaan en plaats bovenop een pluisvrije papieren handdoek om extra vloeibaar medium te verwijderen. (E) plaats een dekslip voorzichtig op het agarose-pad, zorg ervoor dat u geen luchtbellen overlapt en controleer of het scherpstel vlak plat is om celverschuiving en scherpstel problemen te voorkomen. F) Draai langzaam en voorzichtig de Afdeklijst rechtsom om celklonten te verstoren en een celmonolaag te genereren die celuitbreiding en betere celvisualisatie mogelijk maakt. (G,H) Gebruik een verwarmd koolwaterstof mengsel om agarose pads af te dichten en laat ze voorbeeld vorming op de gewenste temperatuur komen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: de juiste cellen kiezen. A) de bovenste panelen tonen splijtings gistcellen die naar verhongeren in EMM plus supplementen voor 72 h en onderste paneel toont cellen ondergaan logaritmische groei. In cellen die aan de honger zijn overgelaten, kunnen kleine celmorfologieën worden gewaardeerd. De rode open pijl toont vacuole-korrels die kenmerkend zijn voor de verhongering. In logaritmische culturen worden cellen met langwerpige morfologieën en septa (rode pijl) in overvloed weergegeven, wat duidt op actieve fiets dynamiek. De rechterzijde panelen tonen cellen uitdrukken Tos4-GFP en Sad1-DsRed signalen tijdens de honger en proliferatie. Pan-nucleaire Tos4-GFP expressie en Sad1-DsRed signalen die lokaliseren naar tegengestelde celpalen worden gezien tijdens actieve proliferatie, maar niet in honger. (B) bovenste paneel toont cellen van dezelfde mate-type (h +) falen om efficiënt te paren. De rode open pijl toont een paar vacuole cellen die karyogamie ondergaan. Dit is niet ongebruikelijk in culturen van h + cellen, waar 10% van de cellen kan wisselen van mate-type naar h-. Onderste paneel toont ASCI als gevolg van efficiënte paring. Zygotische ASCI nemen meerdere vormen, waaronder de zig-zag (rode pijl) en banaan celvormen (rode open pijl). Schaal staaf = 5 μm lang. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: mitotische nucleaire dynamiek. (A) de eiwitten van histone H3 (Hht1-GFP) en microtubulus (Atb2-mrfp) werden gevolgd tijdens een mitose-cyclus (120 min). Individuele signalen voor Hht1-GFP en Atb2-mRFP worden weergegeven in zwart-wit panelen, terwijl de BF samenvoegen toont ze in hun respectieve kleuren. B) kwantificering van Hht1-mgfp-intensiteit over een mitotische cyclus. De verandering in Hht1 niveaus is indicatief voor nucleaire divisie tijdens mitose en DNA-duplicatie in G1. C) kymografen die een normale of abnormale scheiding vertonen in mitose, wanneer de daaruit resulterende nucleaire paden de integriteit van het DNA bifureren, behouden of afwijken en de chromosoom fragmentatie of de voortijdige chromatide scheiding bevorderen. (D,E) Kymograph-en Microscoop-panelen met de duur van M-tot-G1/S, onthuld door de scheiding van Sad1-dsred en de verschijning van nucleaire Tos4-GFP-signalen. Noteer de middelste panelen in E die zijn gegenereerd met behulp van het vuur Lut in Fiji om een thermische kaart met intensiteit te maken die de identificatie van spots met een hoge TOS4-GFP-expressie vergemakkelijkt; in dit geval, gelokaliseerd naar de Nucleus en overlappende Sad1-DsRed-signalen, zoals verwacht. Schaal staaf = 5 μm lang. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Meiotische nucleaire dynamiek. (A) Panel Series tonen beweging, verdichting en deling van de Nucleus (Hht1-mrfp) tijdens de meiose. Horse-met-punt (HT) toont uitgebreide side-to-side nucleaire oscillaties gevolgd door metaphase (MT), waar de nucleaire laterale beweging afneemt en volledig stopt vlak voor anafase I. In meiose I (MI) splitst de belangrijkste kern massa zich op in twee, terwijl in meiose II (MII) vier kernen worden gegenereerd tijdens het proces van zuster chromatide scheiding. B) kwantificering van de verandering van het nucleaire gebied (Hht1-mrfp) in Prophase, metaphase, MI & Mii. Nucleaire gebied is dynamisch tijdens HT-oscillaties, wordt gecondenseerd in MT, en verdere afname in grootte tijdens MI & MII, waar weinig nucleaire beweging wordt waargenomen (lange nucleaire as). Het meten van de langste nucleaire as (lange nucleaire as) is gebaseerd op het idee dat als een cirkel strekt, het ophoudt een constante diameter te hebben en ten minste twee hoofdassen genereert: lang en kort. Bij het monitoren van veranderingen in de Nucleus zijn veranderingen in de lange of de korte as dus een indicatie van de nucleaire beweging. Schaal staaf = 5 μm lang. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: de dynamiek van de Meiotische cohesine. (A) Panel Series die laten zien hoe REC8-GFP-signaal verandering correleert met Meiotische nucleaire dynamiek. Tijdens HT en MT, Rec8-GFP signaal is pan-nucleaire en volgt nucleaire beweging (Hht1-mFRP). In MI, Rec8-GFP verdwijnt uit de Nucleus, verlaten van slechts een paar Foci, die consistent is met Rec8 verwijdering van chromosoom armen en de totstandbrenging van Sgo1-PP2A bescherming bij het centromere. Als de cel Mii nadert, begint Rec8-GFP Foci te verdwijnen en worden niet meer gezien vlak voor anafase II. B) kwantificering van REC8-GFP-intensiteit van HT naar Mii. Vergelijkbaar met wat wordt gezien in een, GFP signaal is hoog via HT en MT, aanzienlijk afneemt tijdens mi en volledig verdwijnen in Mii. Dit patroon bevestigt de dynamiek van cohesin op chromosoom armen en het centromere, waar het de zuster chromatiden tethered houdt totdat het klaar is om in MII te worden gescheiden. Schaal staaf = 5 μm lang. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Eiwit | Functie | Opmerkingen | Tag | Verwijzingen | ||
| Hht1 | Histone H3 betrokken bij DNA-verpakking | Gebruikt om chromosoom dynamiek te onderzoeken | Hht1-mRFP | 5, 14 | ||
| Tos4 | Tos4-functie treedt op tijdens de G1-fase | Gebruikt om de timing van G1 te bestuderen | Tos4-GFP | 22, 23 | ||
| Rad21/ Rec8 | Cohesin subeenheden die betrokken zijn bij het samen houden van zuster chromatiden na replicatie | Gebruikt om de stabiliteit van de cohesie te analyseren tijdens mitotische (Rad21) en Meiotische segregatie (Rec8) | Rad21-GFP/Rec8-GFP | 6, 24 | ||
| Rad11 | RPA-activiteit vindt plaats tijdens mitotische DNA-herstel, Meiotische recombinatie en eindigt in metafase | Gebruikt om DNA-herstel te bestuderen in mitose en recombinatie dynamiek in meiose | Rad11-YFP | 5, 13 | ||
| Rad52 | Rad52 aciviteit vindt plaats tijdens mitotische DNA-herstel en Meiotische recombinatie | Gebruikt om DNA-herstel te bestuderen in mitose en recombinatie dynamiek in meiose | Rad52-CFP | 5, 13 | ||
| Cnp1 | Histone H3 cenp-A lokaliseert specifiek op het centromeer | Gebruikt om de dynamiek van chromosoomsegregatie in mitose en meiose te volgen | Cnp1-mCherry | 13 | ||
| Swi6 | HP1 homoloog eiwit betrokken bij chromatine vorming | Gebruikt om chromatine mobilisatie te bestuderen bij centromeer en telomeren | Swi6-GFP | 13 | ||
| Sad1 | Sad1 is betrokken bij het lokaliseren van het spil paal lichaam aan de nucleaire envelop | Gebruikt om chromosoomsegregatie in mitose en meiose te analyseren | Sad1-mCherry | 10 | ||
| CYTOSOL-& membraan | ||||||
| Atb2 | Tubuline alpha 2 betrokken bij de microtubulus cytoskelet organisatie | Gebruikt om chromosoomsegregatie in mitose en meiose te onderzoeken | Atb2-mRFP | 7, 14 | ||
| Ync13 | Exocytose en endocytose regulator betrokken bij Vesicle-gemedieerde transport | Gebruikt om celwand integriteit tijdens cytokinese te bestuderen | Ync13-mECitrine | 25 | ||
| Rlc1 | Myosin II-subeenheid die betrokken is bij contract ring contractie | Gebruikt om de dynamiek van septum rijping en contractie te verkennen | RIc1-mCherry | 25 | ||
| Ccr1 | NADPH-cytochroom P450-reductase dat deel uitmaakt van het buitenste membraan van ER, plasma en mitochrondrial | Gebruikt om membraan-geassocieerde dynamiek zoals endocytose, exocytose en cytokinese te onderzoeken | Ccr1N-GFP | 5 | ||
| Gef1 | Rho guanyl-nucleotide uitwisselings factor betrokken bij het opzetten en onderhouden van celpolariteit | Gebruikt om globale, microtubulusafhankelijke celpolariteit dynamiek te onderzoeken | Gef1-mCherry-GBP | 26 | ||
| Fus1 | Formin betrokken bij actine fusie focus assemblage tijdens cytogamie | Gebruikt voor het bestuderen van fusie dynamiek in verband met het paren van splijtings gist | Fus1-sfGFP | 27 | ||
| Mnn9 | Mannolsyltransferase-subeenheid die betrokken is bij de met proteïne N samenhangende glycosylatie in het Golgi-apparaat | Gebruikt om de lading rijping in de Golgi te bestuderen naarmate het vordert van CIS-Golgi naar trans-Golgi | Mnn9-mCherry | 28 | ||
| Num1 | Corticale verankerings factor voor dynein die betrokken is bij paarden | Gebruikt voor het onderzoeken van mitochondriën-afhankelijke dynein verankering tijdens nucleaire oscillatie in Meiotische profase I | Num1-yEGFP | 29 | ||
Tabel 1: markers van nucleaire en cytosolische dynamiek.
Film 1: M-naar-G1/S overgang met spil Pole Body (SPB; Sad1-DsRed) scheiding voorafgaand aan septatie en accumulatie van Tos4-GFP nucleair signaal. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Film 2: voltooiing van de mitotische cyclus met de microtubulus (Atb2-mRFP) uitbreiding correleren met nucleaire (Hht1-GFP) divisie. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Discussion
Live-celbeeldvorming tijdens mitose en meiose biedt de mogelijkheid om de nucleaire dynamiek te onderzoeken zonder het substantieel verstoren van splijtings gist fysiologie tijdens het verzamelen van gegevens. Echter, voorzichtigheid moet worden betracht om ervoor te zorgen dat cellen groeien tot de gewenste dichtheden vrij van milieu spanningen; en voor meiose, dat de cellen worden afgebeeld tijdens de tijd van terminale differentiatie en niet te vroeg of te laat. Overtollige cellulaire drukte, honger en ongepaste groei temperaturen zijn veelvoorkomende factoren die bijdragen aan irreproduceer bare waarnemingen. Bovendien is het tijdens het bouwen van de stam van cruciaal belang om te testen dat fluorescerende Tags niet interfereren met de functies van doel genen noch invloed hebben op de algehele celconditie. Het niet goed inspecteren van de fenotypes van stammen die fluorescerende markers dragen, kan leiden tot inconsistente en onvergelijkbare resultaten in vergelijkbare genotypes.
Hoewel Microscoop agarose pads eenvoudig te monteren zijn, kunnen ze ook een hindernis vormen bij het verkrijgen van waardevolle beeldvormings gegevens. Het maken van agarose pads is net zo eenvoudig als het plaatsen van drie Microscoop dia's parallel aan elkaar, doseren gesmolten agarose op de middelste dia, en het zetten van een dia die de top van de andere dia's transverzen. Het is echter nuttig om een Slide-Maker apparaat te monteren dat breedte wijzigingen mogelijk maakt om resistente, situatie-specifieke agarose pads te vervaardigen. Een eenvoudige Slide Maker die de flexibiliteit van de pad breedte geeft, bestaat uit een platform (pipettips houder of de Bank), twee Microscoop-dia's en labtape die fungeren als het pad-breedte aanpassingsmechanisme (Figuur 1a). Exacte dikte van de pad zal afhangen van de Imaging tijd vereisten, agarose merk, temperatuur, dekslip Sealant, verdampingssnelheid, enz. Daarom is het belangrijk om het imaging systeem te kalibreren vóór het verzamelen van gegevens om de technische reproduceerbaarheid te verhogen en de kwaliteit van Live-celbeeldvorming1,2,3te verbeteren. Pad oppervlak, stijfheid en samenstelling zijn essentieel tijdens langdurige beeld verwerving. Agarose heeft een lage achtergrond fluorescentie, kan gemakkelijk worden gegoten, en bij de juiste concentratie, bestand tegen structurele vervorming als gevolg van verdamping. Bovendien maakt het combineren van splijtings gist media met agarose geen afbreuk aan de beeldkwaliteit en zorgt voor uitgebreide observatie van meervoudige behandeling en meiosiscycli. Ook is het belangrijk om eventuele luchtbellen voor time-lapse microscopie te voorkomen. Binnen agarose pads en binnen het monster, luchtzakken uit te breiden na verloop van tijd, waardoor celverschuiving en het verstoren van de focal vliegtuigen. Mits de cellen efficiënt worden uitgespreid door de dekstrook rotatie, kunnen onderzoekers mitotische processen over verschillende generaties volgen en Meiotische gebeurtenissen van nucleaire fusie tot sporulatie. Het maken en kiezen van de juiste pad voor Imaging experimenten kost tijd om te beheersen, maar eenmaal bereikt, kan bijdragen aan zeer informatieve Microscoop observaties.
Zoals het geval is met andere methoden, is Live-cel microscopie niet vrij van technische beperkingen. Het gebruik van fluorescently-gelabelde eiwitten introduceert grenzen aan experimenten die de reikwijdte van wat kan worden bestudeerd beperken. Foto-bleaching en foto-toxiciteit zijn problemen die kenmerkend zijn voor langdurige beeld verwerving. Ze kunnen worden tegengedraaid door cellen te lang of te vaak niet bloot te stellen aan korte golflengten. Voor experimenten met GFP, CFP, yfp, mrfp en dsred, typische fluorescerende eiwitten die worden gebruikt in splijting gist Live-celbeeldvorming, is het gebruikelijk om 5-15% excitatie licht en 100-500 MS blootstellingstijd voor routine experimenten in dienst te nemen. Deze parameters veranderen echter, volgens de specifieke experiment eisen van de onderzoeker. Bovendien, z-stacks bestaat uit 9-13 secties met 0,5 μm afstand met behulp van een 60x doelstelling is genoeg om de dikte van een splijting gist cel op te lossen. Bovendien is het belangrijk om te bevestigen dat fluorescentie markers de juiste regulering of functie van doel eiwitten niet verstoren of valse fenotypes genereren. Daarom is het raadzaam om stammen te construeren die verschillende fluorescerende en affiniteits tags bevatten voor hetzelfde doel gen om waarnemingen met verschillende middelen te bevestigen. Bovendien is het de verantwoordelijkheid van onderzoekers om ervoor te zorgen dat experimentele parameters over experimenten kunnen worden gereproduceerd en dat de verzamelde gegevens geschikt zijn voor downstream-analyse1,3. Geen enkele technologie kan de beproefde praktijk van het nauwgezet valideren van experimentele systemen vervangen door een zorgvuldige observatie en een streng onderzoek van de lineariteit bij het opsporen van fluorescerende signalen.
Ten slotte is het cruciaal om microscopie gegevens te analyseren in indelingen die geen RAW-afbeeldingen wijzigen. Fiji biedt uitstekende documentatie hulpmiddelen om de metingen van onbewerkte gegevens bij te houden en stelt onderzoekers in staat om verschillende celparameters in één sessie te onderzoeken. Deze functies, evenals haar rijkdom aan online tutorials en uitgebreide literatuur dekking, maken Fiji een belangrijk hulpmiddel voor het meten, analyseren en presenteren van Live celbeeldvormings gegevens die de nucleaire dynamiek van splijtings gist in mitose en meiosis beschrijven.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Natalia La Fourcade en Mon LaFerte bedanken voor het maken van de voorbereiding van dit manuscript een aangenamere inspanning. Dankzij leden van het Forsburg Lab die hebben bijgedragen aan de voltooiing van dit werk met hun inzicht, experiment ideeën en morele ondersteuning. Dit project werd gesteund door NIGMS R35 GM118109 naar SLF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
| Adenine | Sigma | A-8751 | |
| Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
| Agarose | Sigma | A9539-500g | |
| Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
| Biotin | Sigma | B-4501 | |
| Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
| CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
| Citric acid | Sigma | C-0759 | |
| Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
| Cover slip | VWR | 16004-302 | |
| CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
| DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
| Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
| FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
| Histidine | Sigma | H8125-100g | |
| Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
| Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
| Incubator | Shell lab | #3015 | |
| Inositol | Sigma | I-5125 | |
| Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
| Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
| Leucine | Sigma | L8912-100g | |
| Lysine | Sigma | L5626-500g | |
| Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
| MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
| MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
| Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
| MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
| Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
| Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
| Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
| Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
| Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
| Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
| softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
| Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
| Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
| Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
| Vaseline | Equaline | F79658 | |
| Yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
| Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
| ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |
References
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. DNA Replication. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).
- Lee, J. Y., Kitaoka, M. A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859 (2015).
- Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast. Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).
- Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).
- Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
- Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly. Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).
- Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
- Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination. Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).
- Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction. Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).
- Mastro, T. L., Forsburg, S. L. Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF). Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).
- Escorcia, W., Forsburg, S. L. Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).
- Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation. Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).
- Forsburg, S. L., Rhind, N. Basic methods for fission yeast. Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).
- Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in enzymology. 470, Academic Press. 759-795 (2010).
- Diffraction PSF 3D. , Available from: http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm (2019).
- Optinav.info. Convolve ED. , Available from: http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm (2019).
- Optinav.info. Iterative Deconvolve. , Available from: http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm (2019).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide — IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes. The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).
- Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae. PLoS One. 7 (9), e45895 (2012).
- Watanabe, Y., Nurse, P. Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis. Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).
- Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).
- Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis. Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580 (2018).
- Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).
- Kurokawa, K., et al. Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).
- Kraft, L. M., Lackner, L. L. A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring. Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).
