Summary
多利奥利德,包括多利奥莱塔gegenbauri物种,是在世界生产次大陆架系统中发现的具有生态意义的小型胶状海洋浮游动物。培养这些微妙生物的难度限制了他们的调查。在这项研究中,我们描述了收集、饲养和维护多利奥利莱塔·格根巴里的栽培方法。
Abstract
胶状动物在海洋生态系统中起着至关重要的作用。然而,通常很难研究它们的生理、生长、肥力和营养性相互作用,这主要是由于方法上的挑战,包括培养它们的能力。多利奥利利德,多利奥莱塔·格根本古里尤其如此。D. Gegenbauri通常发生在全世界生产性的亚热带大陆架系统中,其浓度往往能消耗大量日常初级生产。在这项研究中,我们描述了收集、饲养和维护D.Gegenbauri的培养方法,以便进行基于实验室的研究。D. Gegenbauri和其他多利奥利物种可以通过从漂流船上斜拖锥形202 μm网状浮游生物网进行实时捕获。当水温低于21°C,并且从不成熟的淋病、成熟的红细胞和大型护士开始时,培养是最可靠的。培养物可以在缓慢旋转的浮游生物轮上保持在圆形培养容器中,并在天然海水中养殖藻类的饮食中维持多年。除了建立D.gegenbauri实验室培养物的能力外,我们还证明了采集条件、藻类浓度、温度和暴露于自然条件海水对培养物都至关重要。建立,成长,生存和繁殖的D.gegenbauri。
Introduction
浮游生物是海洋中最大的动物生物量,是海洋食物网中的关键成分,在海洋生物地球化学周期1、2中发挥重要作用。浮游动物,虽然由巨大的生物多样性组成,可以完全区分为两类:胶状和非胶状,很少中间分类3,4。与非胶状浮游动物相比,胶状浮游动物由于生命历史复杂,在捕获和处理过程中容易受损,因此特别难以研究。因此,以实验室中难以养殖为名,与非胶状物种6相比,研究较少。
在胶状浮游动物群中,一个在世界海洋中具有丰富和生态重要性的植物群是塔利亚人。塔利亚人是一类中上层的突子,包括萨尔皮达,火焰兵米达和多利奥利达7号订单。多利奥利达,统称为多利奥利德,是小型桶形自由游泳的中上层生物,可以在亚热带海洋的生产性神经区达到高丰度。多利奥利德是所有浮游动物群中最丰富的,有4、8个。作为悬浮喂食器,多利奥利德通过产生滤流并在粘液网9上捕获食物颗粒,从水柱中收集食物颗粒。分类学上,多利奥利德被分类在植物乌罗霍达10。与和弦的祖先,除了其生态意义作为海洋中上层系统的关键组成部分,塔利亚人是了解殖民生命历史的起源10,11和进化的意义和弦5,7,10,12,13,14。
多利奥利德的寿命是复杂的,并造成在它们生命周期中培养和维持它们的困难。多利奥利德生命周期和解剖学的回顾可以在哥德奥等人15。多利奥利德生命周期 , 涉及性和非性生命史阶段的强制替 , 如图 1 所示。卵子和精子是由她的血性淋病产生,这是生命周期中唯一的单独阶段。Gonozooid将精子释放到水柱中,卵子在内部受精并释放成幼虫。幼虫孵化和变质成可达到1-2毫米的卵虫。 假定有利的环境条件和营养,在20°C的1-2天内成为早期护士,并启动生命周期的殖民阶段。无性性地在腹腔上产生芽。这些芽离开龙,并迁移到背毛,在那里他们排队成三对成行。中央双行变为双排,外两排变为节流。后者为护士和16、17的食虫提供食物。营养动物为护士提供营养,因为她失去了所有的内部器官。随着营养动物的丰度增加,护士在实验室中的大小可以达到15毫米。随着磷化物的生长,它们越来越多地摄入浮游动物,在作为个体17被释放之前,其大小达到1.5毫米。一名护士在其寿命18期间可释放>100个磷。在从结虫中释放后,它们继续生长,是生命周期的第二殖民阶段。一旦它们达到5毫米的大小,每个磷化物在其腹腔的足刺上形成一簇淋杂虫。这些淋病在长度达到±1毫米时可以摄录颗粒。在淋病达到2至3毫米的大小后,它们从磷化物中释放出来,成为生命周期中唯一的单独阶段。一旦他们达到 + 6 毫米的大小, 淋病成为性成熟17.淋病长度可达9毫米或更大。果子病是她的造血剂,精子间歇性地释放,而受精的卵子发生在内部16,17。当淋病大小为6毫米时,它释放多达6个受精卵。成功的培养需要支持这些独特的生命历史阶段的具体需求。
由于塔利亚人(包括多利奥利德)的生态和进化意义,有必要采用栽培方法,以增进对这种生物体独特的生物学、生理学、生态学和进化史的理解19.多利奥利德在发育生物学和功能基因组学中作为实验模型生物体具有相当大的前景,因为它们是透明的,并且可能具有简化的基因组20,21。然而,缺乏可靠的栽培方法妨碍了它们作为实验室模型的作用。虽然少数实验室已经发布了基于培养多利利德的结果,但对我们的知识培养方法和详细协议,以前没有发表过。根据多年的经验和试验和错误栽培尝试,本研究的目的是审查经验,并分享协议,收集和栽培多利奥利德,特别是多利奥莱塔gegenbauri物种。
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Protocol
1. 为饲养D.gegenbauri准备养殖设施
注:所有所需的材料和设备都列在材料表中。
- 制备1M氢氧化钠(NaOH),0.06M高锰酸钾(KMnO4)溶液。为了制备此溶液,将 400 克 NaOH 溶解到 10 L 去离子水中。将 100 g KMnO4添加到 NaOH 解决方案中,并混合均匀。
- 通过将 100 g 的 NaHSO3溶解成 10 L 去离子水并混合良好,制备 0.1M 双硫酸钠 (NaHSO3) 溶液。
注意:这些试剂是刺激物,吸入后可能导致呼吸问题。放置在通风良好的区域,如通风罩。避免任何皮肤接触。搬运时,请戴上防护手套、防护服、护目和面部保护。 - 在实验室中建立和饲养多利奥利德培养物之前,对培养罐进行清洁和消毒。
- 用去离子水冲洗1.9 L和3.8 L培养罐至少3次。让螺钉盖干燥,因为以下清洁步骤中不包括盖。
- 将 1.9 L 和 3.8 L 玻璃培养罐浸入 NaOH/KMnO4溶液中,对其进行清洁和消毒。让罐子浸泡过夜。
- 从 NaOH/KMnO4溶液中取出罐子,并将罐子浸入双硫酸钠 (NaHSO3) 溶液中。让罐子浸泡过夜。
- 从 NaHSO3溶液中取出罐子,然后用去离子水彻底冲洗。让罐子干燥。
- 将浮游生物轮(图2)置于温度控制空间(环境室)。将温度平衡到 20°C。有关定制浮游生物轮的更多详细信息,请参阅补充图 1。
2. 浮游植物文化
- 从国家海洋藻类和微生物群中心(NCMA)或其他来源获得藻类培养物,用作D.Gegenbauri的食物。两种旗酸盐物种的混合物,包括伊索里西斯加尔巴纳(CCMP 1323),罗多莫纳斯sp(CCMP 740)和一个小硅藻,Thalassiosira Weissflogii(CCMP 1051)从NCMA获得,并已在以前的实验室使用研究后多利奥利德成功17。
- 按照 NCMA 的建议准备 L1 和 L1-Si 生长介质22。
- 按照供应商提供的说明启动新的藻类培养物。
- 为了保持库存培养,使用严格的轴培养技术,每两周在无菌 55 mL 玻璃培养管中将 0.5 mL 的旧敏化培养物转移到 25 mL 的新鲜生长介质中。
注意:如果不定期转移,就不可能储存活的藻类文化。如果文化不会长期使用,并且无法在不使用期间保持区域性,则建议从原始来源(例如 NCMA)重新获取这些常见的藻类文化。 - 在含有200 mL生长培养剂的清洁500 mL塑料组织培养瓶中制备大量浮游植物,用于喂养多利利德。
- 接种浮游植物从斧头股票(4 mL)到200 mL的生长介质(1:50稀释)。
- 在 20°C 下孵育,光度为 12:12 小时:在 65-85 μE/m2的冷白光下暗循环。放法瓶平,以最大化照明。每天轻轻旋转文化。
- 使用粒子计数器或显微镜确定细胞的浓度,以监测培养物的生长。
注:接种后7-10天,旗子培养物将包含+10 5-106细胞/mL,硅藻培养物将包含+104-105细胞/mL。这些浓度足以维持多利奥利德培养物。 - 至少每两周启动新的喂养种群,以提供足够的藻类生物量来支持所有文化活动。
3. 收集野生多利奥利德和海水,用于养殖
注:图3概述了收集和栽培方法。图4提供了专门收集浮游生物网和鳕鱼末端的说明。
- 使用浮游生物网或原地成像系统23来探测多利奥利德。
注:由于多利奥利德很少存在于地表水中,而且遥感技术无法检测到,因此,在具备有利于多利奥利德的条件的必备知识的指导下,必须确定多利奥利德的存在。取样前。 - 在收集活多利多利德之前收集富含颗粒的海水,为启动D.gegenbauri培养做准备。
- 将尼斯金瓶安装在CTD玫瑰花饰或同等设备上,从多利奥利德所在的地点和含有叶绿素最高估计值的深度收集水,原位荧光仪估计的浓度。
注: 叶绿素浓度用作颗粒浓度的指示器。在南大西洋大陆架(SAB)中大陆架上,地下叶绿素的最大值通常接近底部,但在其他地点,它可能不是。
- 将尼斯金瓶安装在CTD玫瑰花饰或同等设备上,从多利奥利德所在的地点和含有叶绿素最高估计值的深度收集水,原位荧光仪估计的浓度。
- 一旦找到多利奥利德,使用专用的浮游生物网和鳕鱼端恢复未损坏的多利奥利德动物。在部署网之前,用海水填充鳕鱼端。
- 从漂流船,降低和提升网通过水柱保持一个倾斜的牵引角度[15 - 25]和垂直部署和检索速度不超过15米/分钟。
- 一旦网在船上,轻轻地转移和划分鳕鱼端的内容到3,5加仑(+20L)塑料桶,每个包含约10L的表面海水从现场收集。
注意:新的塑料桶应在生活多利奥利德收集前几天加入海水来调节。其目的是减少化学品从塑料中渗出。如果没有海水,请使用纯净(例如 Milli Q)或不含有毒污染物的自来水来调节水桶。 - 从其他浮游生物中分离多利奥利德动物。
- 小批量 (± 2 L) 将混合木板从净牵引内容物(现在用 20 L 塑料桶)转移到 2 L 玻璃烧杯。
- 使用宽孔玻璃移液器(8 mm ID x 38 厘米长度),小心地吸水,并将主动游动的多利奥利德动物从烧杯转移到含有颗粒丰富的海水的清洁玻璃培养罐中,这些罐子使用尼斯金瓶收集,从多利奥利德那里收集位于。
- 轻轻地释放海水表面下的多利奥利德动物。
注:收集含有附着发育的淋病的果虫、含有附着的发育性淋病的果虫和含有附着的营养动物的护士阶段(图1)。
- 添加多利奥利德后,将Rhodoonas sp. 培养剂添加到 ± 5 x 103 = 104细胞/mL 的最终浓度(在 3.8 L 罐中包含 ± 5 x 104 + 1 x 105细胞/mL 的培养素的 ±50 mL)。这是为了确定多利利德是否正在积极喂食。当多利奥利德摄入罗多莫纳斯sp.,他们的消化道会出现红色的颜色。去除看起来没有喂食的动物。
- 为了防止多利利德被困在空气-水界面,请避免在培养罐中的头部空间,将未经过滤的富含颗粒的海水完全填充罐子,并在罐口(89 mm 宽)上放置一块塑料包装。
- 避免产生气泡,这些气泡也会损坏动物。小心地将盖子拧到罐子上,轻轻倒置罐子以确定是否存在气泡。如果存在气泡,请将其移除。
- 装满罐子后,从罐子外面擦去多余的水。
- 将每个罐子放在浮游生物轮上(图2),将罐子放在用橡胶管覆盖的垂直金属棒上,以及不锈钢软管夹之间。
- 确保罐子的背面缓冲在橡胶管上。通过调整螺钉拧紧罐周围的软管夹。
- 一旦将罐子牢固地固定到位,检查罐子是否未移动。让罐子在 0.3 rpm 转速下旋转,以保持多利利德悬浮。
注意:重要的是不要过度拧紧罐子,以防止罐子开裂。
- 在船上,在昏暗的灯光下,将浮游生物轮上的培养容器保持在20°C,直到它们被转移到实验室培养设施。
- 返回实验室后,将装有多利奥利德的罐子转移到准备好的培养设施中。将罐子安装在浮游生物轮上(参见步骤 3.8),并允许罐继续以 0.3 rpm 转速旋转。
注:本研究中所有多利奥利德的饲养均在20°C进行。
4.保持D.格根巴古里文化
- 从船到实验室,让动物在原来的罐子里适应实验室条件3天。
- 在适应期间,每天使用宽孔玻璃移液器与收集地点未经过滤的富含颗粒的海水交换10%的水,为期3天。
- 在罐子里保留几个浮游动物,但去除所有其他浮游动物、大粪便颗粒和可能堵塞多利奥利德过滤装置(粘液网)的大聚合颗粒。如果培养由早期护士组成,在罐子里保存一个大的淋病(± 6 mm)。
注:在培养中包括哪些浮游动物并不重要,但在这个实验中,使用了捕获多利奥利德的最丰富的物种。
- 适应期后,将独行动物和浮游动物从原罐子转移到一个干净的培养罐中,该罐含有80%的玻璃纤维过滤器(GF/F)过滤海水和20%的海水。通过标称孔径为 0.7 μm 滤纸的 GF/F 过滤海水,制备过滤海水。
- 每3天用GF/F过滤海水交换10%的水,并去除骨料和粪便颗粒,保持新的培养。每周,如步骤 4.2 所述,将动物转移到新罐子中。
- 通过在 40 - 95 μg C/L 之间的培养罐中保持浮游植物浓度来喂食多利奥利德。
注:这些浓度模仿环境条件,已知支持D.gegenbauri17的开花条件。藻类的混合物因生命阶段和每个罐子中的动物数量而异。在早期生命阶段,仅添加1:1混合(按碳含量)的隐藻藻(伊索里西加尔巴纳和罗多莫纳斯sp.)。较大的猎物物种很容易堵塞小护士的喂食装置,并发育营养动物。在喂养较大的护士、磷化物和类虫时,在藻类混合物中加入硅藻,碳含量也相等。- 监测藻类在喂食前和喂食后的浓度,以指导决定增加藻类的频率和数量。使用粒子计数器来确定藻类浓度,因为培养罐中的藻类浓度相对稀薄。
- 去除足够的动物,以保持40~95微克/升的藻类浓度,使剩余的多利利德有足够的食物生长。
注:在实验室条件下成功维持的最困难的生命阶段是发育中的幼虫和卵虫(早期护士)。在这个培养阶段,保持一个大的类虫(± 6毫米),除了在罐子里与发育的幼虫和卵虫(= 20每3.8升罐)的浮游动物。 - 将至少4名护士转移到一个新的培养罐,一旦至少8个营养动物可见护士的卡多磷(图1B)。
注: 在 20 °C 时,特罗索祖伊德的数量每 1 ~ 2 天会翻倍。肉眼大到肉眼可见。- 一旦护士发展出20个营养动物,就撤换两名护士。
- 当护士在护肌上发育出30个营养动物时,删除一名护士。允许剩余的护士在其结节体上发展出磷。
- 护士释放多达 30 个磷脂后,取出护士。
- 一旦磷化物达到3毫米大小,减少罐子中的动物数量。
- 当类虫变大(>5 mm)并形成类皮球簇时,除四个类动物外,除四个外,其他所有动物均脱去。
- 当淋虫群群的数量增加并开始觅食时,将培养体减少到两个。
- 一旦磷化物释放多达30个淋病,就取出磷。
- 将山羊群的数量从30个动物群减少到每罐2个。允许受精卵被释放到罐子里。
- 去除一个淋病,留下一个单一的山羊在罐子里,一旦卵虫发展。
注:废弃的护士、假动物和淋病可用于播种其他培养物和进行进一步实验。
- 去除一个淋病,留下一个单一的山羊在罐子里,一旦卵虫发展。
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Representative Results
按照图3中概述的收集、培育多利奥利的所述程序,可以在其复杂的生命史中保持D.gegenbauri文化(图1)和维持它许多代。虽然这里描述了D.gegenbauri的栽培,但这些程序也应与其他多利利德物种的种植相关。
捕获健康和未受损的多利奥利德动物需要应用专用网和牵引程序(图4)。作为没有硬结构的精细动物,应注意尽量减少可能导致任何物理损害的程序。这些因素可能包括湍流、压力和与表面(包括网、空气和气泡)的相互作用。然而,尽管其性质微妙,未损坏的多利奥利德动物可以使用开口直径与长度比为1:5的锥形浮游生物网收集,并配有相对较大的加权非过滤鳕鱼端。我们经常使用 202 μm 网格 2.5 m(长度)的浮游生物网,其开口为 0.5 m,安装在旋转线束中,并配有 4 L 加权非过滤鳕鱼端(图 4)。虽然浮游生物网的大小对可培养D.gegenbauri动物的捕获的影响尚未得到系统调查,但从理论上讲,使用网格尺寸较大的网可能导致进一步改善,因为更大的网眼尺寸会减少牵引过程中产生的压力场。或者,更大的网状物大小将导致更大的水流通过网,潜在的损害多利奥利德动物。牵引速度和净角应进行优化,以尽量减少收集过程中的牵引时间和损坏。根据我们的经验,我们发现,从垂直部署和检索速度不超过 15 m/min 的漂流船上,以 15-25° 的角度倾斜网,可以达到足够温和的牵引条件。为了将网定向到水流的方向,浮游生物网安装在旋转线束中。通常的情况是,水柱中的多利奥利德分布不是随机的,在颗粒物负荷最高的地区通常最大24。因此,水柱从地下叶绿素的最大到表面应取样。在浅SAB中大陆架(20-45米)中,对从底部以上1米处到水面的水柱进行取样。
一旦收集了健康的动物,保持它们的方式尽量减少对表面的接触是至关重要的。为了尽量减少与表面接触,多利奥利德被保存在充满海水的圆形罐子中,轻轻摔在缓慢旋转的浮游生物轮上(图2)。
虽然从理论上讲,可以开始一种文化与任何生命阶段的动物,探索成功和失败建立D.Gegenbauri的新文化从6次尝试从2015年至2018年在南大西洋Bight表明成功当从 < 21°C 的水域收集动物,以及利用大型成熟淋病以外的生命阶段来开始新的培养时,最常达到(表 1和表 2)。在实践中,在发起新文化时,包括多利奥利德动物的多个生命阶段是有帮助的,或者至少不是有害的。
正如其他中上层冻土物种20所描述的那样,能否成功维持一种D.gegenbauri文化,取决于提供支持每个生命阶段所需的充足(但不是过多的)食物和食物多样性。由于整个生命周期的饮食要求各不相同,每次喂食时提供的藻类数量必须变化,以保持食物浓度达到预期目标水平(40 ~95微克C/L)(表3)。浓度高于或低于这些水平会导致死亡率上升(G.A.帕芬赫弗死亡率)。虽然D.gegenbauri的自然饮食仍然缺乏理解6,但可以通过提供相对简单的养殖藻类混合物和利用允许不同的微生物群落在文化。增加猎物场的潜在多样性是通过将一小部分颗粒载水从旧文化中保留,并在每次水变化或转移时加入少量活的浮游动物和大型多利奥利德来实现的。据推测,这些生物体处理藻类和脱粒物质,并有助于分散可用于多利利德营养的颗粒大小和质量谱,但还需要进行更多的研究来证实这一假说。
多利奥利德培养物的可得性为在受控实验条件下研究多利奥利德生物学、生理学、生态学和分子生物学的许多重要方面提供了手段。例如,虽然多利奥利德在沿海海洋的许多地区是丰富的,并且是主要的浮游动物25,但关于喂养和生长速度的数据仍然很少26。利用D.gegenbauri的培养物,基于培养的研究的一个重点是量化喂养和生长速率,以应对关键环境参数,包括温度和食物浓度26。这些研究结果表明,在浓度为20至60微克C/L时,清除率相似,并随着食物浓度的增加而降低(图5A)。间隙率成比例地超过支持D.gegenbauri增长的温度范围(图5B)。增长率(k)范围从0.1~0.7/天作为温度和食物供应的函数(图6)。这些研究除了为栽培提供实用信息外,还能够确定多利奥利毛饲料和生长速率之间的定量关系,作为环境参数的函数,并提供对将这一重要的浮游动物群纳入建模框架所需的多利奥利德生物学和生态学27。
图 1:D. 20°C的格根巴里。
在沃尔特斯等人2018年6日之后,生命周期图(1A)进行了修改,并经许可重新绘制。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:用于养殖的浮游生物轮子D. 格根巴古里.请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:图式概述D. 格根巴古里收集和栽培方法。
海上收集 (A),小批量 (B) 从浓缩桶转移到小玻璃烧杯,将多利奥利德动物分离成含有富含颗粒的海水 (C) 的培养罐,维护浮游生物轮整个生命周期 (D, E).请点击此处查看此图的较大版本。
图4:浮游生物网和部署。
部署(左上)、检索(右上)以及网端和鳕鱼端(下图)的示意图。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:藻类间隙率D. 格根巴古里山羊。
(A)三种尺寸的D.gegenbauri淋病的清除率(mL/zooid/天)与浮游植物浓度(μg C/L)之间的关系。 每个点表示 4-11 个观测值。(B) 三种尺寸的D.gegenbauri淋病的间隙率(mL/zooid/天)与温度(°C)相比。 每个点表示 4-12 个观测值。果虫尺寸为 2.5 毫米 ()、4.5
毫米
()和 6.5 毫米 (
)。数字已重新绘制,并获准26。请点击此处查看此图的较大版本。
图6:增长率D. 格根巴里戈诺祖德。
(A) 平均 (+ S.E.) 生长率 (k) 与浮游植物浓度 (μg C/L) 三种尺寸的多利奥莱塔 gegenbauri淋病体之间的关系.每个点表示 4-11 个观测值。(B) 三种尺寸的多利奥莱塔·格根巴里山羊群的平均(+ S.E.) 增长率(k)与温度(°C) 。每个点表示 4-12 个观测值。果虫尺寸为 2.5 毫米 ()、4.5毫米()和 6.5 毫米 ()。经吉布森和帕芬霍夫费尔26号许可,数据被重新绘制。请点击此处查看此图的较大版本。
| 表 1.海洋学条件和多利奥利德丰度 | |||||||||||
| 表面 | 底部 | 表面 | 底部 | 表面 | 底部 | 多利奥利德丰度 | |||||
| 日期 | 邮轮 ID | 纬度 (N) | 经度 (W) | 深度(米) | 温度 (0C) | 温度 (0C) | 盐度(PSU) | 盐度(PSU) | 克拉 (μg/L) | 克拉 (μg/L) | 动物/立方米 |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | 31.1889 | 80.1527 | 41.30 | 25.26 | 22.43 | 33.58 | 36.96 | 那 | 0.20 | 那 |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | 29.5687 | 80.3269 | 40.00 | 26.40 | 21.75 | 36.26 | 36.32 | 1.04 | 1.35 | 218 |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | 31.1674 | 80.1249 | 40.80 | 23.24 | 22.60 | 35.91 | 35.81 | 1.06 | 1.70 | 13 |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | 31.2139 | 80.1823 | 41.00 | 18.72 | 18.84 | 36.00 | 36.12 | 0.83 | 1.50 | 3 |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | 31.2144 | 80.1822 | 42.00 | 24.19 | 23.85 | 36.00 | 36.04 | 0.63 | 1.30 | 254 |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | 31.1835 | 80.1466 | 43.00 | 16.85 | 16.45 | 36.50 | 36.48 | 0.56 | 0.89 | 那 |
| NA:数据不可用 | |||||||||||
表1:南大西洋Bight中大陆架的海洋学条件和多利奥利多丰度,其时间和地点D. Gegenbauri动物被收集起来,并被用来发起新的文化。
| 表2.D. Gegenbauri栽培尝试的结果 | ||||
| 日期 | 邮轮 ID | 收集的动物 | 结果 | 评论 |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | 性成熟大 (6-7 毫米) 淋病 | 失败 | 所有山羊在4天后死亡。Oozooid和早期护士生命阶段产生,但未能茁壮成长。 |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | 性成熟大 (8-10 毫米) 淋病 | 失败 | 戈诺祖德在采集后不久就去世了。Oozooid和早期护士被生产出来,但未能茁壮成长。 |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | 混合收集,包括晚护士 (4-5 毫米) 与附加的营养动物, 性成熟大 (6 毫米) 淋病, 和乌祖德 (2 毫米) | 成功 | 2016 年 1 月和 3 月收集的另外一代淋病和护士经过 4 代培养后,被添加到文化中。在2016年10月的"马修"飓风期间,实验室被疏散了4天,这种文化没有存活下来。 |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | 混合收集,包括类虫(1.5-5毫米)和大的磷化物(6毫米),附着的类虫簇 | 成功 | 2017 年 4 月收集的另外一代山羊皮被添加到文化中,经过 4 代培养。在飓风"伊尔玛"之前于 2017 年 9 月终止了文化。 |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | Gonozooid (3-6 毫米) | 失败 | 大山羊在1天后死亡。未成熟的淋病在文化中存活了14天。鸡蛋是由两个类人无症释放的。Ozooid 被生产,但未能发展到护士阶段。1 个月后区域性失败。 |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | 大 (6-7 毫米) 晚护士无营养动物 | 成功 | 在文化中,护士生产营养动物。文化维持了3代,并在2018年6月底实验结束时终止。 |
表2:建立实验室培养的结果。D. 从南大西洋大陆架收集的Gegenbauri。
| 多利奥莱塔·格根巴古里 | 每动物数量 | 每动物数量 | |||
| 生命阶段 | 3.9 L 罐 | 1.9 L 罐 | 伊索里西·加尔巴纳 | 罗多莫纳斯 | 塔拉西奥西拉·韦斯洛吉 |
| 乌祖伊德 | 20 | 10 | 包括 | 包括 | 不包括 |
| 早期护士 | 20 | 10 | 包括 | 包括 | 不包括 |
| 晚护士与8营养动物 | 4 | 2 | 包括 | 包括 | 包括 |
| 晚护士与20营养动物 | 2 | 1 | 包括 | 包括 | 包括 |
| 晚护士与30营养动物 | 1 | 1 | 包括 | 包括 | 包括 |
| 磷祖(1至3毫米) | 30 | 15 | 包括 | 包括 | 包括 |
| 异种类人类动物群(> 5 毫米) | 2 | 1 | 包括 | 包括 | 包括 |
| 多诺祖虫 (1 至 3 毫米) | 30 | 15 | 包括 | 包括 | 包括 |
| 多诺祖病(> 5 毫米) | 2 | 1 | 包括 | 包括 | 包括 |
| 藻类的目标浓度应保持在40-95微克C/L之间,每种藻类的混合物(按碳含量计)相等 | |||||
表 3:每个表的目标区域性条件D. 格根巴古里生命周期阶段。
补充图1:自定义浮游生物轮的详细描述。请点击此处下载此图。
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Discussion
在过去几十年中,已经建立了培养多利利德的能力,并被用于支持若干领域的研究。我们实验室的实验研究支持了至少15项科学研究的出版,这些研究侧重于喂养和生长18,26,繁殖18,28,饮食6, 29,生理学30,生态学31,生态模型27多利奥利德。
虽然这些细腻动物的培养目前是劳动密集型和耗时的,但种植多利奥利德是可行的,如果由更广泛的社区进行,将促进对生态和进化重要的动物群体。本研究的目的是描述目前收集、饲养和维护文化中的D.Gegenbauri的方法,以便进行基于实验室的研究。
建立多利奥利德文化需要收集健康和未受损害的动物,一旦捕获,温和治疗,适当的营养和饲养。多利奥利德,特别是D.gegenbauri物种,在亚热带大陆架上发生,但丰度可能变化很大。例如,在最近的一项侧重于 SAB 中架区域的研究中,尽管丰度从 <1/m3到 > 20,000/m3,但多利奥利德在整个年份中都存在。由于多利奥利德在空间和时间上的变异性很高,而且对大陆架边缘环境进行取样相对困难,因此,对进行研究的多利奥利德社区动力学的可靠知识非常重要文化的成功建立的前提。
一旦找到并捕获了多利奥利德动物,就很难确定这些动物是否受到了损坏。动物可能看起来没有受损,并表现出活跃的游泳和逃生行为,但即使是最小的伤害也可能导致它们无法茁壮成长。与捕获的多利奥利德动物的健康评估特别相关的一个特征是它们的喂养能力。只需向新鲜捕获的动物提供色素藻类即可评估喂养活动。如果动物正在喂食,肠道将在短时间内变色。根据我们的经验,我们发现加入少量的红色色素藻类,罗多玛纳斯,迅速提供有关喂养活动的信息。如果不观察到喂食,就不太可能建立一种文化。
警惕和良好的畜牧业对于在其复杂的生命周期内建立和维持多利利德至关重要。也许最成问题的阶段是从幼虫阶段发展出一个可行的护士,以及喂养营养动物的产生(发芽)。在这个生命阶段,我们推测食物对数量、质量和粒径的要求非常有限。据我们所知,以前没有研究过D.gegenbauri幼虫和乌祖德的觅食活动。例如,虽然发育中的淋病和磷球能摄录各种尺寸的颗粒,但幼虫、幼虫和小护士的能力可能更为有限。在实践中,我们发现,通过从藻类食物混合物中省略硅藻,通过将食物浓度保持在中等水平,通过经常在较低浓度下进行喂养,通过维持单较大的类虫和一些与培养,并通过手动删除大块的残渣。
尽管我们为来自单一集合的多代保存了D. gegenbauri的文化,但在可能的情况下,我们经常用新鲜采集的动物补充现有文化,以增加遗传多样性和鲁棒性文化。这种做法的一个潜在危险是将寄生虫或疾病引入文化,但据我们所知,我们从未遇到过这个问题。虽然关于多利奥利德32的寄生虫的报告很少,但毫无疑问,它们确实存在。有趣的是,在最近的一项研究中,在比较在天然水域中接触的培养D.Gegenbauri种胶虫的饮食与田间捕获的D.gegenbaurigonozooid,在野生种群中检测到了假定的阿皮苏拉寄生虫。在培养的动物中缺席6。
所述养殖技术的现有局限性是动物疫症生产量的限制。特别是因为所述技术涉及在旋转浮游生物轮上低密度的密封罐中种植,因此不清楚这种方法是否可以扩大,或者工作流程是否适合自动化。然而,对于另一种细腻的小胶状海洋浮游动物物种,幼虫Oikopleura dioica,已经描述了20,33,34,这表明它可能将来有可能为多利奥利德设计类似的系统。然而,与奥地卡简单生活史相比,地门巴古里复杂的生命史仍将是大规模栽培的重大挑战。
总之,按照此处描述的协议,D. gegenbauri在其复杂的生命历史中可在受控的实验室条件下可靠地培养。这种能力使物种能够接受各种受控的实验研究,也许可以发展多利奥利德作为发育生物学和进化学中一种新的动物模型。然而,在实现这一目标之前,需要克服生产规模的局限性。
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Disclosures
作者没有什么可申报的。
Acknowledgments
我们感谢多年来为这个项目贡献积累的知识的许多人,包括G.A.帕芬霍夫和D.迪贝尔最初开发了这些协议。M. Köster和L.兰博利也为这些程序的发展作出了重大贡献。 N.B. 洛佩斯-菲格罗亚和罗德里格斯-圣地亚哥提出了表1中提供的多利奥利德丰度估计数。这项研究部分得到了美国国家科学基金会授予OCE 082599、1031263给MEF的合作项目、OCE 1459293和OCE 14595010对MEF和DMG的合作项目的支持,以及国家海洋和大气管理局授予DMGNA16SEC4810007的合作项目。我们感谢R/V萨凡纳号辛勤工作和专业船员。李·安·德利奥准备了数字,查尔斯·罗伯逊校对手稿,詹姆斯(吉米)威廉姆斯制造了浮游生物轮
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
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