Summary
ドリオレッタゲゲンバウリ種を含むドリオリッドは、世界中の生産的な亜大陸棚システムに見られる生態学的意義の小さなゼラチン状の海洋動物プランクトンです。これらの繊細な生物を培養することの難しさは、彼らの調査を制限します。本研究では、ドリオリッド・ドリオレッタ・ゲゲンバウリを収集、飼育、維持するための栽培アプローチについて述べた。
Abstract
ゼラチン状の動物プランクトンは、海洋生態系において重要な役割を果たしています。しかし、一般的に、生理学、成長、性感、栄養相互作用を調べることは、主に培養能力を含む方法論的な課題に起因する。これは特にドリオリッド、ドリオレッタゲゲンバウリに当てはまります。D. ゲゲンバウリは、一般的に世界中の生産的な亜熱帯大陸棚システムで発生し、多くの場合、毎日の一次生産の大部分を消費することができるブルーム濃度で発生します。本研究では、実験室ベースの研究を行う目的で、D.ゲゲンバウリを収集、飼育、維持するための栽培アプローチについて述べた。D.ゲゲンバウリおよび他のドリオリッド種は、漂流船から斜めに牽引された円錐形202μmメッシュプランクトンネットを使用して生きて捕獲することができる。水温が21°Cを下回り、未熟なゴノズーイド、成熟したハロゾイド、および大きな看護師から始まる培養物は、最も確実に確立されます。培養は、ゆっくりと回転するプランクトンホイール上の丸みを帯びた培養船で維持され、何世代にもわたって天然海水で培養藻類の食事に維持することができます。D.ゲゲンバウリの実験室培養を確立する能力に加えて、我々は、採取条件、藻類濃度、温度、および自然条件付き海水への暴露がすべて文化にとって重要であることを実証する。D.ゲゲンバウリの確立、成長、生存、および再生。
Introduction
海洋で最大の動物バイオマスを占める動物プランクトンは、海洋食物網の重要な構成要素であり、海洋生物地球化学サイクル1、2において重要な役割を果たしている。動物プランクトンは、生物の巨大な多様性で構成されているが、ゼラチン状と非ゼラチン性の2つのカテゴリーに大きく区別することができる:少数の中間タキサ3、4とゼラチン状。非ゼラチン性動物プランクトンと比較して、ゼラチン状の動物プランクトンは、その複雑な生命史5のために研究することは特に困難であり、その繊細な組織は捕獲および取り扱いの間に容易に損傷を受ける。ゼラチン性動物プランクトン種は、したがって、実験室で培養することが悪名高く、一般的に非ゼラチン種6と比較して研究が少ない。
ゼラチン状の動物プランクトン群の中で、世界の海洋における生態学的重要性の1つがタリア人である。サリアセアンは、サルピダ、ピロソミダ、およびドリオリダ7の命令を含むペラジックチュニケートのクラスです。ドリオリダは、総称してドリオリッドと呼ばれ、亜熱帯海洋の生産的な神経領域で高い豊富に達することができる小さなバレル状の自由水泳ペラジック生物です。ドリオリッドは、すべての動物プランクトングループの中で最も豊富なの一つである4、8.懸濁フィーダーとして、ドリオリッドは、フィルター電流を作成し、粘液ネット9上でそれらを捕捉することにより、水柱から食品粒子を収集します。分類的には、ドリオリッドは、フィルムウロホボルデータ10に分類される。タリアテスの祖先、および海洋ペラジック系の主要な構成要素としての生態学的意義に加えて、タリアセアンは植民地時代の生命史10、11および進化の起源を理解する上で重要である。コードの5,7,10,12,13,14.
ドリオリッドの人生の歴史は複雑であり、彼らのライフサイクルを通じてそれらを培養し、維持することの難しさに貢献しています。ドリウリッドのライフサイクルと解剖学のレビューは、Godeauxら15で見つけることができます.性的および無性の生命史段階の間の義務的な交互を伴うドリオリッドのライフサイクルは、図1に示される。卵子と精子は、ライフサイクルの唯一の孤独な段階であるヘルマフロジティック・ゴノズーイドによって産生される。Gonozooidsは水柱に精子を放出し、卵子は内部受精し、幼虫に成長するために放出される。幼虫の孵化と変態は、1〜2ミリメートルに達することができるウーズイドに変身し、環境条件と栄養を仮定すると、oozooidは20°Cで1〜2日以内に早期看護師となり、ライフサイクルの植民地段階を開始します。ウーズーイドは、腹部のストロンに芽を性的に産生する。これらの芽は、ストロンを残し、彼らは3つのペアの行に並んで後部カドフォアに移行します。中央の二重行はホロズーイドになり、外側の2つの二重列はトロフォズーイドになります。後者は、看護師とフォロズイド16、17の両方に食べ物を提供します。トロフォズーイドは、彼女がすべての内臓を失うように栄養を看護師に供給します。トロフォズイドの豊富さが増加するにつれて、看護師のサイズは実験室で15ミリメートルに達することができます。ハロズイドが成長するにつれて、彼らはますますプランクトンの獲物を摂取し、個人17として放出される前に約1.5ミリメートルの大きさに達する。単一の看護師は、その寿命18の間に>100のフォロズーイドを解放するかもしれません。ハロゾードがカドフォアから放出された後、彼らは成長し続け、ライフサイクルの第二の植民地段階です。彼らはサイズが〜5ミリメートルに達すると、各フォロズーイドは、彼らの腹部のペダンクル上のゴノズーイドのクラスターを開発します。これらのゴノズーイドは、長さが約1mmに達すると粒子を摂取することができます。gonozooidsが2〜3ミリメートルの大きさに達した後、彼らはフォロズイドから解放され、ライフサイクルの唯一の孤独な段階になります。彼らはサイズが〜6ミリメートルに達すると、gonozooidは性的に成熟した17になります。ゴノズーイドは9mm以上の長さに達することができます。ゴノズーイドは、ヘルマフロジティックであり、精子は卵子の受精が内部的に起こる間断続的に放出される16、17である。ゴノズーイドの大きさが≥6mmの場合、それは6個まで受精卵を放出する。培養を成功させるには、これらのユニークなライフヒストリーステージのそれぞれに固有のニーズをサポートする必要があります。
ドリオリッドを含むタリアセアンの生態学的、進化的意義により、この生物の固有の生物学、生理学、生態学、進化史の理解を進めるための栽培方法論が必要である19.ドリオリッドは、発生生物学および機能的ゲノミクスにおける実験モデル生物としてかなりの期待を持っている。しかし、信頼性の高い栽培方法の欠如は、実験室モデルとしての有用性を阻害する。少数の研究室が培養ドリオリッドに基づいて結果を発表しているが、我々の知識栽培アプローチと詳細なプロトコルは以前に発表されていない。長年の経験と試行錯誤の栽培の試みに基づいて、この研究の目的は、経験を見直し、ドリオリッドの収集と栽培のためのプロトコルを共有することであった, 特に種ドリオレッタゲゲンバウリ.
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Protocol
1. D.ゲゲンバウリの養殖施設の整備
注:必要なすべての材料と機器は、材料の表に記載されています。
- 1M水酸化ナトリウム(NaOH)、0.06 Mペルマンガン酸カリウム(KMnO4)溶液を調出します。この溶液を調剤するには、NaOHの400gを10L脱イオン水に溶解する。NaOH溶液にKMnO4の100gを追加し、よく混ぜます。
- NaHSO3の100gを10L脱イオン水に溶解し、よく混ぜ合わせ、0.1Mの二硫酸ナトリウム(NaHSO3)溶液を調作します。
注意:これらの試薬は、吸入した場合に呼吸器系の問題を引き起こす可能性のある刺激物です。ヒュームフードなどの換気の良い場所に置きます。皮膚との接触を避けてください。取り扱い時は、保護手袋、防護服、目の保護、フェイスプロテクションを着用してください。 - 実験室でドリオリッド培養を確立し、飼育する前に、培養瓶をきれいにし、殺菌する。
- 脱イオン水で少なくとも3回、1.9Lおよび3.8L培養瓶をすすいでください。次のクリーニング手順にキャップが含まれていないため、スクリューキャップを乾燥させてください。
- NaOH/KMnO4溶液に浸漬することにより、1.9Lおよび3.8Lガラス培養瓶を洗浄し、殺菌します。瓶を一晩浸します。
- NaOH/KMnO4溶液から瓶を取り出し、瓶を二硫酸ナトリウム(NaHSO 3)溶液に浸します。瓶を一晩浸します。
- NaHSO3溶液から瓶を取り出し、脱イオン水で十分に洗い流します。瓶を乾かします。
- プランクトンホイール(図2)を温度制御空間(環境室)に置きます。温度を20°Cに平衡化する。カスタムプランクトンホイールの詳細については、補足図1を参照してください。
2. 植物プランクトン文化
- 海洋藻類と微生物叢(NCMA)またはD.ゲゲンバウリの食品として使用される他のソースのための国立センターから藻類培養物を取得します。アイソクリシスガルバナ(CCMP 1323)、ロドモナスsp(CCMP 740)、および小さな珪藻土、タラシオシラ・ワイスフロギ(CCMP 1051)を含む2つのフラグレート種の混合物は、NCMAから得られ、以前の実験室で使用されてきました後部ドリオリッドに対する研究は成功17.
- NCMAが推奨するように、L1およびL1-Si成長培媒22を調製する。
- サプライヤーの指示に従って、新しい藻類培養を開始します。
- ストック培養を維持するために、厳格なアックス培養技術を用いて、2週間ごとに無菌55mLガラス培養管で25mLの新鮮な成長培養剤の0.5mLを25mLに移す。
注:定期的に移動せずに生きている藻類の文化を保存することは不可能です。培養物が長期間使用されず、非使用期間中培養を維持できない場合は、これらの一般的な藻類培養物を元のソース(NCMAなど)から再取得することをお勧めします。 - 200mLの成長培養剤を含むクリーンな500mLプラスチック組織培養フラスコにドリオリッドを供給するための植物プランクトンの量を大量に調製する。
- アックス株(4mL)から成長培地の200mL(1:50希釈)に植物プランクトンを接種する。
- 12:12 h光で20°Cでインキュベート:65-85 μE/m2の涼しい白色光照明の下で暗いサイクル。イルミネーションを最大化するために、培養フラスコを平らに置きます。毎日穏やかに文化を渦巻く。
- 粒子カウンターまたは顕微鏡を使用して培養物の増殖を監視する細胞の濃度を決定します。
注:接種から7~10日後、フラグレート培養物には~10 5-106細胞/mLが含まれ、珪藻土培養には~104-105細胞/mLが含まれます。これらの濃度は、ドリオリッド培養を維持するのに十分である。 - すべての文化活動をサポートするのに十分な藻類バイオマスを提供するために、少なくとも2週間ごとに新しい供給ストックを開始します。
3. 野生のドリオリッドと海水の培養
注: 収集と栽培のアプローチの概要を図 3に概説します。特殊なコレクション プランクトン ネットとタラエンドの説明を図 4に記載しています。
- プランクトンネットまたはその場所イメージングシステム23を使用してそれらを検出することにより、ドリオリッドを見つけます。
注:ドリオリッドは表面水域にほとんど存在せず、リモートセンシング技術では検出できないため、ドリオリッドに有利な条件の前提条件の知識に導かれる(「議論」を参照)、ドリオリッドの存在を決定する必要があります。サンプリングの前に。 - D.ゲゲンバウリ培養を始める準備として、生きたドリオリッドを採取する前に、粒子が豊富な海水を採取してください。
- CTDロゼットまたは同等の装置に取り付けられたニスキンボトルを展開し、ドリオリッドが位置する場所から水を収集し、その場で蛍光体で推定されるクロロフィルの濃度の最も高い推定値を含む深さから水を収集します。
注:クロロフィル濃度は、粒子濃度の指標として使用されます。南大西洋ビッグト(SAB)中大陸棚では、最大の地下クロロフィルは通常底部に近いですが、他の場所ではそうではありません。
- CTDロゼットまたは同等の装置に取り付けられたニスキンボトルを展開し、ドリオリッドが位置する場所から水を収集し、その場で蛍光体で推定されるクロロフィルの濃度の最も高い推定値を含む深さから水を収集します。
- ドリオリッドが見つかったら、特殊なプランクトンネットとタラエンドを使用して、損傷を受けていないドリオリッド動物園を回収します。網を展開する前に、タラの端に海水を充填します。
- 漂流船から、下がり、水柱を通してネットを上げ、15-25°の斜め牽引角を維持し、垂直展開と検索速度は15 m/min以下です。
- ネットがオンボードされたら、タラエンドの内容物を3ガロン(〜20L)のプラスチックバケツにそれぞれ3、5ガロン(〜20L)のプラスチックバケツに分けて、現場から採取した表面海水を約10Lに分けます。
注:新しいプラスチックバケツは、ドリオリッドコレクションを生きる前に海水日数を加えることによって条件付けされるべきです。プラスチックからの化学物質の浸出を減らすことを目的とする。海水が利用できない場合は、精製(例えば、ミリQ)または有毒な汚染物質を含まない水道水を使用して、バケツを条件付けします。 - 他のプランクトンからドリオリッド動物園を分離します。
- 小さなバッチ(〜2L)で、ネットトウコンテンツ(現在20Lプラスチックバケツ)から2Lガラスビーカーに混合プランクトンを転送します。
- ワイドボアガラスピペット(8mm ID x 38cmの長さ)を使用して、慎重にサイフォンを使用し、積極的にサイフォンと積極的に泳ぐドリオリッド動物園をビーカーから、ドリオリッドがいたところからニスキンボトルを使用して収集された粒子が豊富な海水を含むクリーンなガラス培養瓶に移します。位置。
- 海水の表面の下にドリオリッド動物園をそっと放出します。
注:ゴノズーイド、アソシゲーン開発ゴノゾードを含むホロズーイド、および付属のトロフォズーイドを含む看護師の段階を収集します(図1)。
- ドリリオリッドを添加した後、ロドモナスsp.培養物を~5 x 10 3~104細胞/mLの最終濃度に加え(〜5×104~1x10 5細胞/mLを3.8L瓶に含有する培養物の〜50 mL)。これは、ドリオリッドが積極的に給餌しているかどうかを判断する。ドリリッドがロドモナスspを摂取すると、消化管が赤色に表示されます。餌を与えているように見えない動物園を削除します。
- ドリリッドが空気水界面に閉じ込められるのを防ぐには、濾過されていない粒子が豊富な海水で瓶を完全に充填し、瓶の開口部(幅89mm)の上にプラスチックラップを置くことによって、培養瓶のヘッドスペースを避けてください。
- 動物にダメージを与える気泡の作成は避けてください。慎重に瓶にキャップをねじ込み、気泡が存在するかどうかを確認するために瓶を穏やかに反転します。気泡が存在する場合は、それらを削除します。
- 瓶が充填された後、瓶の外側から余分な水を拭きます。
- 各瓶をプランクトンホイール(図2)に取り付け、ゴムチューブで覆われた垂直金属棒の上に瓶を置き、ステンレススチール製ホースクランプの間に取り付けます。
- 瓶の背面がゴムチューブに対してクッションされていることを確認します。ネジを調整して、瓶の周りのホースクランプを締めます。
- 瓶がしっかりと固定されたら動かないようにしてください。ドリオリッドをサスペンションに保つために、瓶を0.3 rpmで回転させます。
注意:瓶が割れるのを防ぐために、瓶を締め過ぎないようにすることが重要です。
- 船上では、実験室の培養施設に移すことができるまで、薄暗い光の中でプランクトンホイール上の培養船を20°Cに維持します。
- 研究室に戻ると、ドリオリッドを含む瓶を調製培養施設に移します。プランクトンホイールに瓶を取り付け(ステップ3.8を参照)、瓶が0.3 rpmで回転し続けることを可能にします。
注:本研究におけるドリオリッドのすべての飼育は、20°Cで行われた。
4. D. ゲゲンバウリ文化の維持
- 船から実験室まで、動物が3日間実験室の条件に元の瓶に順応することを可能にする。
- 順応期間中は、広いボアガラスピペットを使用して、毎日3日間、採取場所から濾過されていない粒子が豊富な海水と水の10%を交換します。
- 瓶の中にいくつかのコペポッドを保管しますが、他のすべての動物プランクトン、大きなfecalペレット、およびドリアリドの濾過装置(粘液ネット)を詰まらせる可能性のある大きな凝集粒子を除去します。培養が初期の看護師で構成されている場合は、瓶の中に大きなゴノズーイド(≥6 mm)を1つ保管してください。
注:どのコペポッド種が培養に含まれるかは重要ではありませんが、この実験では、ドリオリッドが捕獲された場所から存在する最も豊富な種が使用されました。
- 順応期間に続いて、ドリオリッド動物園とコペポッドを元の瓶から、80%のガラス繊維フィルター(GF/F)濾過海水と20%の海水を含むクリーンな栽培瓶に移します。0.7 μm のフィルターペーパーの公称細孔サイズでGF/Fを通して海水を濾過することにより、濾過海水を準備します。
- 3日ごとにGF/F濾過海水と水の10%を交換し、凝集体と大腿骨ペレットを除去することにより、新しい培養を維持します。毎週、ステップ4.2で説明されているように、動物を新しい瓶に移します。
- 40~ 95 μg C/L の培養瓶内の植物プランクトン濃度を維持することにより、ドリオリッドを養殖する。
注:これらの濃度は、D.ゲゲンバウリ17の開花条件をサポートすることが知られている環境条件を模倣します。藻類種の混合物は、各瓶のライフステージと動物園の数によって異なります。初期の段階では、クリプトモナド藻類(アイソクリシスガルバナおよびロドモナスsp.)の1:1混合物(炭素含有量による)のみを追加します。より大きな獲物種は、小さな看護師の摂食装置を容易に詰まらせ、トロフォズーイドを開発することができます。大きな看護師、恐怖症、ゴノズーイドを供給する際に、同じ炭素含有量で、藻類混合物に珪藻土タラシオシラワイスフロギーを追加します。- 藻類濃度を事前および供給後に監視し、培養物に添加する藻類の頻度と量の決定を導きます。培養瓶内の藻類濃度は比較的希薄であるため、粒子カウンターを使用して藻類濃度を決定します。
- 残りのドリオリッドが成長するのに十分な食物を持っているように、40 - 95 μgC/Lの藻類濃度を維持するのに十分な動物園を削除します。
注:実験室の条件下で正常に維持するために最も困難なライフステージは、発達幼虫とウーゾード(早期看護師)です。培養のこの段階では、幼虫とウーズーイド(3.8L瓶あたり〜20)を発達させる瓶内のいくつかのコペポッドに加えて、1つの大きなゴノズーイド(≥6 mm)を保ちます。 - 少なくとも4人の看護師を新しい培養瓶に移すと、少なくとも8個のトロフォズーイドが看護師のカドフォアに見える(図1B)。
注:トロフォズーイドは20°Cで1-2日ごとに数が倍増します。トロフォズーイドは肉眼で見えるほどの大きさです。- 看護師が20トロフォズーイドを開発したら、看護師の2人を削除します。
- 看護師がカドフォアに30のトロフォズーイドを発症したとき、1人の看護師を取り除きます。残りの看護師がカドフォアでハロゾイドを開発できるようにします。
- 看護師が最大30のフォロズイドを解放したら、看護師を削除します。
- フォロズイドのサイズが3mmに達したら、瓶の中の動物の数を減らす。
- フォロズイドが大きくなり(> 5 mm)、ゴノズーイドクラスターを開発した場合、4つのフォロズイドを除くすべてを取り除きます。
- gonozooid クラスターの数が大きくなり、餌を与え始めるとき、培養を 2 つのハロゾーイドに減らします。
- フォロズイドが最大30のゴノズーイドを放出したら、フォロズイドを取り除きます。
- ゴノズーイドの数を30匹から瓶につき2匹に減らす。受精卵を瓶に放出します。
- ウーズーイドが発達したら、瓶の中に単一のgonozooidを残して1つのgonozooidを取り除きます。
注:廃棄された看護師、フォロズーイド、およびゴノズーイドは、追加の培養物を播種し、さらなる実験を行うために使用することができます。
- ウーズーイドが発達したら、瓶の中に単一のgonozooidを残して1つのgonozooidを取り除きます。
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Representative Results
ドリオリッドを収集および培養するための記載された手順に従って、図3に概説されたD.ゲゲンバウリは、その複雑な生涯の歴史を通じてD.ゲゲンバウリの培養を維持することができる(図1)。何世代にもわたってそれを維持する。D.ゲゲンバウリの栽培はここで説明するが、これらの手順は、他のドリオリッド種の栽培にも関連する必要がある。
健康で損傷のないドリオリッド動物園を捕獲するには、特殊なネットと牽引手順を適用する必要があります(図4)。硬い構造を持たない繊細な動物として、身体的損傷を引き起こす可能性のある手順を最小限に抑えるために注意が必要です。これらの要因には、乱流、圧力、およびネット、空気、気泡などのサーフェスとの相互作用が含まれます。しかし、その繊細な性質にもかかわらず、損傷を受けていないドリオリッド動物園は、開口部直径と長さ比1:5の円錐状プランクトンネットを使用して収集することができ、比較的大きな加重非濾過タラエンドを装備しています。日常的に我々は旋回ハーネスに取り付けられた0.5 mの開口部と202 μmメッシュ2.5m(長さ)プランクトンネットを使用し、4 L重み付け非濾過タラエンドを装備しています(図4)。プランクトンメッシュサイズが栽培可能なD.ゲゲンバウリ動物園の捕獲に及ぼす影響は系統的に調査されていないが、理論的には、メッシュサイズが大きいネットを使用すると、メッシュサイズが大きくなるにつれて更なる改善をもたらす可能性がある。牽引の間に発生する圧力分野を減らす。あるいは、メッシュサイズが大きくなると、ネットを通る水の流れが大きくなります。牽引速度とネット角度は、収集中の牽引時間と損傷を最小限に抑えるように最適化する必要があります。私たちの経験では、垂直展開と15 m/minを超えない検索速度を持つ漂流船から15〜25°の角度でネットを斜めに牽引することによって、十分に穏やかな牽引条件を達成することができることがわかりました。水の流れの方向にネットを向くために、プランクトンネットは旋回ハーネスに取り付けられています。通常、水柱内のドリオリッドの分布はランダムではなく、粒子負荷が最も高い領域で一般的に最も大きい場合 24.したがって、地下クロロフィル最大の下から表面までの水柱をサンプリングする必要があります。浅いSAB中大陸棚(20~45m)では、底から表面まで約1mの水柱がサンプリングされます。
健康な動物園が収集されたら、表面への暴露を最小限に抑える方法でそれらを維持することが重要です。表面との遭遇を最小限に抑えるために、ドリオリッドは海水で満たされた丸い瓶に保管され、ゆっくりと回転するプランクトンホイールに穏やかに転倒します(図2)。
理論的にはあらゆる生命の段階の動物園で文化を始めることは可能ですが、南大西洋ビッグトで2015年から2018年の間に6回の試みからD.ゲゲンバウリの新しい文化を確立する際の成功と失敗の探求は、成功を示唆しています。動物園が< 21°Cである水から採取され、大きな成熟したゴノズーイド以外の生命段階が新しい文化を開始するために利用される場合に最も頻繁に達成される(表1および表2)。実際には、新しい文化を始めるときにドリオリッド動物園の複数のライフステージを含めると役に立ちます。
他のペラジックチュニケート種20について述べてきたように、D.ゲゲンバウリの培養を維持することの成功は、各ライフステージをサポートするために必要な十分な、しかし過剰ではない食物および食物の多様性を提供することに依存する。食事の要件はライフサイクル全体を通じて異なるため、各摂食時間に提供される藻類の量は、所望の目標レベル(40~ 95 μg C/L)で食物濃度を維持するために変化させる必要があります(表3)。これらのレベルの上または下の濃度は、死亡率の増加をもたらすことができます (G.A. Paffenhöfer pers.comm.).D.ゲゲンバウリの自然食は6の理解が不十分であるが、培養藻の比較的単純な混合物を供給し、多様な微生物群を確立する手順を利用することによって培養を維持することができる。文化。獲物場の潜在的な多様性を高めることは、古い培養物から粒子を積んだ水の一部を保持し、各水の変化または移動に少数の生きたコペポッドと大きなドリオリドを含めることによって達成される。おそらく、これらの生物は藻類や有害物質を処理し、ドリオリッド栄養に利用可能な粒子の大きさと品質スペクトルを多様化するのに役立ちますが、この仮説を確認するために追加の研究が必要です。
ドリオリッド培養の利用可能性は、制御された実験条件下で、ドリオリッド生物学、生理学、生態学、分子生物学の多くの重要な側面を調査する手段を提供する。例えば、ドリオリッドは沿岸海域の多くの地域に豊富であり、主要なプランクトングレイザー25であるが、摂食および成長率に関するデータは26のままである。D.ゲゲンバウリの培養を利用して、培養に基づく研究の焦点は、温度および食物濃度26を含む重要な環境パラメータに応じて摂食および成長率を定量化することであった。これらの研究の結果は、クリアランス率が20から60 μg C/Lの濃度で類似しており、食品濃度が増加するにつれて減少することを示している(図5A)。クリアランス率は、D.ゲゲンバウリの成長を支持する温度範囲にわたって比例して増加する(図5B)。成長率 (k) は、温度と食品の可用性の関数として 0.1 ~ 0.7 日の範囲です (図6)。これらの研究は、培養のための実用的な情報を提供することに加えて、環境パラメータの関数としてのドリオリッド摂食と成長率との間の定量的関係の決定を可能にし、重要な洞察を提供した。モデリングフレームワーク27にこの重要な動物プランクトングループを含むのに必要なドリオリッドの生物学と生態学.
図1:のライフサイクルD. ゲゲンバウリ 20 °C.
ライフサイクル図面(1A)は、Walters et al. 20186の後に変更され、許可を受けて再描画されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:培養に使用されるプランクトンホイールD. ゲゲンバウリ.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 概略図D. ゲゲンバウリの採取と栽培アプローチ。
海での回収(A)、濃縮バケツから小さなガラスビーカーへの小さなバッチ(B)への移送、ドリオリッド動物園の分離、粒子豊富な海水(C)を含む栽培瓶への分離、プランクトンホイールのメンテナンスライフサイクルを通じて(D,E).この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:プランクトンネットと展開。
配置 (左上)、取得 (右上)、およびネットとタラの端のスケマティック (下)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:藻類クリアランス率D. ゲゲンバウリ・ゴノズーイド
(A) D.ゲゲンバウリゴノズーイドの3つのサイズに対する(A)平均(±S.E.)クリアランス率(mL/zooid/日)と植物プランクトン濃度(μg C/L)の間の関係。各ポイントは 4 ~ 11 個の観測値を表します。(B) D.ゲゲンバウリゴノズーイドの3つのサイズの平均(±S.E.)クリアランス率(mL/zooid/日)対温度(°C)。各ポイントは 4 ~ 12 個の観測値を表します。ゴノズーイドのサイズは2.5mm
()、4.5
mm ()、および6.5ミリメートル( )
です。フィギュアは許可26で再描画されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:成長率D. ゲゲンバウリ・ゴノズーイド
ドリオレッタゲゲンバウリゴノズーイドの3つのサイズに対する(A)平均(±S.E.)成長率(k)と植物プランクトン濃度(μg C/L)の間の関係。各ポイントは 4 ~ 11 個の観測値を表します。(B)ドリオレッタゲゲンバウリゴノズーイドの3つのサイズの平均(±S.E.)成長率(k)対温度(°C)。各ポイントは 4 ~ 12 個の観測値を表します。ゴノズーイドのサイズは2.5mm()、4.5mm ()、および6.5ミリメートル( )です。フィギュアはギブソンとパフェンヘーファー26の許可を受けて再描画されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 表 1.海洋学的条件とドリオリッドの豊富さ | |||||||||||
| 表面 | 下部 | 表面 | 下部 | 表面 | 下部 | ドリオリッドの豊富さ | |||||
| 日付 | クルーズID | 緯度 (N) | 経度 (W) | 奥行き (m) | 温度(3/4C) | 温度(3/4C) | サリン度(PSU) | サリン度(PSU) | クラ (μg/L) | クラ (μg/L) | ズーイド/m3 |
| 20/05/2015 | 15-10 | 31.1889 | 80.1527 | 41.30 | 25.26 | 22.43 | 33.58 | 36.96 | Na | 0.20 | Na |
| 04/08/2015 | 15-19 | 29.5687 | 80.3269 | 40.00 | 26.40 | 21.75 | 36.26 | 36.32 | 1.04 | 1.35 | 218 |
| 02/12/2015 | 15-31 | 31.1674 | 80.1249 | 40.80 | 23.24 | 22.60 | 35.91 | 35.81 | 1.06 | 1.70 | 13 |
| 02/02/2017 | 17-03 | 31.2139 | 80.1823 | 41.00 | 18.72 | 18.84 | 36.00 | 36.12 | 0.83 | 1.50 | 3 |
| 07/11/2017 | 17-23 | 31.2144 | 80.1822 | 42.00 | 24.19 | 23.85 | 36.00 | 36.04 | 0.63 | 1.30 | 254 |
| 01/02/2018 | 18-02 | 31.1835 | 80.1466 | 43.00 | 16.85 | 16.45 | 36.50 | 36.48 | 0.56 | 0.89 | Na |
| NA: データが使用できません | |||||||||||
表1:南大西洋ビッグト中大陸棚の海洋学的条件とドリオリッドの豊富さD. ゲゲンバウリ動物園は収集され、新しい文化を開始するために使用されました。
| 表 2.D.ゲゲンバウリ培養試行の成果 | ||||
| 日付 | クルーズID | ズーイド収集 | 結果 | コメント |
| 20/05/2015 | 15-10 | 性的に成熟した大きい(6-7ミリメートル)ゴノズーイド | 失敗 しました | すべてのゴノズーイドは4日後に死亡していた。ウーズーイドと初期の看護師のライフステージは生産されたが、繁栄に失敗した。 |
| 04/08/2015 | 15-19 | 性的に成熟した大きい(8-10ミリメートル)ゴノズーイド | 失敗 しました | ゴノズーイドは収集後まもなく死亡した。ウーズーイドと初期の看護師は生産されたが、繁栄に失敗した。 |
| 02/12/2015 | 15-31 | 後期看護師(4-5mm)を含む混合コレクション、付属のトロフォズーイド、性的に成熟した大きな(6ミリメートル)ゴノズーイド、およびウーズーイド(2ミリメートル) | 成功 | 4世代にわたり培養し、2016年1月と3月に収集した追加のゴノズーイドと看護師が文化に追加されました。2016年10月のハリケーン・マシュー期間中、研究室は4日間避難し、文化は生き残りませんでした。 |
| 02/02/2017 | 17-03 | ゴノズーイド(1.5-5 mm)と大型フォロズーイド(6mm)を含む混合コレクション | 成功 | 4世代にわたり培養し、2017年4月に収集した追加のゴノズーイドが培養に加えられました。ハリケーン・イルマに先立ち、2017年9月に文化を終了。 |
| 07/11/2017 | 17-23 | ゴノズーイド (3-6 mm) | 失敗 しました | 大きな淋動物は1日後に死亡した。未熟なゴノズーイドは14日間培養中に生き残った。卵は両方のゴノズーイドによって放出された。ウーズーイドは生産されたが、看護師の段階に発展しなかった。文化は1ヶ月後に失敗しました。 |
| 01/02/2018 | 18-02 | トロフォズーイドのない大型(6-7ミリメートル)後期看護師 | 成功 | 培養では、看護師はトロフォズーイドを生産しました。培養は3世代にわたり維持され、実験終了後の2018年6月末に終了しました。 |
表2:実験室文化の確立に向ける試みの成果D. ゲゲンバウリは、南大西洋ビッグト中大陸棚から収集しました。
| ドリオレッタ・ゲゲンバウリ | 動物園の数あたり | 動物園の数あたり | |||
| ライフステージ | 3.9 L瓶 | 1.9 L瓶 | アイソクリシス・ガルバナ | ロドモナスsp. | タラシオシラ・ワイスフロギー |
| ウーズーイド | 20 | 10 | 含める | 含める | 含まない |
| 早期看護師 | 20 | 10 | 含める | 含める | 含まない |
| 8トロフォズーイドを持つ後期看護師 | 4 | 2 | 含める | 含める | 含める |
| 20トロフォズーイドを持つ後期看護師 | 2 | 1 | 含める | 含める | 含める |
| 30トロフォズーイドを持つ後期看護師 | 1 | 1 | 含める | 含める | 含める |
| フォロズイド(1~3mm) | 30 | 15 | 含める | 含める | 含める |
| 恐怖症ゴノズイドクラスター (> 5 mm) | 2 | 1 | 含める | 含める | 含める |
| ゴノズーイド (1~ 3 mm) | 30 | 15 | 含める | 含める | 含める |
| ゴノズーイド (> 5 mm) | 2 | 1 | 含める | 含める | 含める |
| 藻類の標的濃度は、各藻類種の等しい混合物(炭素含有量による)で40~95μg C/Lの間で維持されるべきである | |||||
表 3: 各カルチャ条件の対象D. ゲゲンバウリライフサイクル期
補足図1:カスタムプランクトンホイールの詳細な説明。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ドリオリッドを培養する能力は、過去数十年にわたって確立され、いくつかの分野での研究を支援するために使用されています。私たちの研究室での実験的研究は、摂食と成長に焦点を当てた少なくとも15の科学的研究の出版をサポートしています18,26, 生殖18,28, 食事6, 29, 生理学30, 生態学31, および生態モデリング27.
これらの繊細な動物の文化は現在、労働集約的で時間がかかりますが、ドリオリッドの栽培は可能であり、より広範なコミュニティによって引き受ければ、この生態学的理解の進歩を促進し、進化的に重要な動物のグループ。本研究の目的は、実験室ベースの研究を行う目的で、文化におけるD.ゲゲンバウリの収集、飼育、維持に関する現在のアプローチを説明することであった。
ドリリオリッド文化の確立は、健康で損傷のない動物の収集を必要とし、一度捕獲された、穏やかな治療、適切な栄養、および夫。ドリオリッド、特に種D.ゲゲンバウリは、亜熱帯大陸棚上で世界的に発生しますが、豊富さは非常に変動する可能性があります。例えば、SABの中間棚領域に焦点を当てた最近の研究では、その豊富さは<1/m3から>20,000/m3まで劇的に変化したが、ドリオリッドは6年を通して存在していた。空間と時間におけるドリオリッドの変動性が高く、大陸棚の余白環境のサンプリングに伴う相対的な難易度があるため、研究が行われているドリオリッドコミュニティダイナミクスに関する信頼性の高い知識が重要です。文化の確立を成功させるための前提条件。
ドリオリッド動物園が見つかって捕獲されると、動物が損傷したかどうかを判断することは困難です。動物は損傷を受けていないように見え、活発な水泳や脱出行動を示すが、小さな怪我でさえ繁栄に失敗する可能性がある。捕獲されたドリオリッド動物園の健康評価に特に関連する1つの特徴は、餌を与える能力である。摂食活性は、新たに捕獲された動物に色素藻を提供するだけで評価することができる。動物が餌を与えている場合、腸は短時間で着色されます。私たちの経験では、少量の赤色顔色藻類、ロドモナスsp.を加えることは、摂食活動に関する情報を迅速に提供することがわかりました。摂食が観察されない場合、培養物が確立される可能性は非常に低い。
警戒と良い畜産は、複雑なライフサイクルを通じてドリリッドを確立し、維持するために重要です。おそらく最も問題のある段階は、幼虫期からの生存可能な看護師の発達と、摂食トロフーゾイドの産生(芽生え)である。このライフステージでは、量、品質、粒子サイズに関する食品要件が最も限られていると推測しています。我々の知るう上、D.ゲゲンバウリ幼虫とウーズーイドの摂食活性を調べた研究はこれまでにない。例えば、現行のゴノズーイドやハロゾードは広範囲の大きさで粒子を摂取できるが、幼虫、ウーズイド、小さな看護師の能力はより限られている可能性が高い。実際には、これらのライフステージでの栽培の成功は、藻類食品混合物から珪藻土を省略し、中程度のレベルで食物濃度を維持することにより、より低い濃度で頻繁な摂食を行うことによって、これらのライフステージで成功を収めることができることがわかります。単一の大きなgonozooidと文化といくつかの対処、および手動で大きな凝集体を除去することによって。
私たちは、単一のコレクションから生まれた複数の世代のためにD.ゲゲンバウリの文化を維持してきましたが、可能な場合は、遺伝的多様性と堅牢性を高めるために、新たに収集された動物で既存の文化を定期的に補完します。文化の。この実践の潜在的な危険性は、寄生虫や病気を培養に導入することですが、私たちの知るう上では、この問題に遭遇したことは一度もありません。ドリオリッド32の寄生虫の報告はほとんどありませんが、間違いなく存在します。興味深いことに、自然界に曝露されたD.ゲゲンバウリ・ゴノズーイドの培養食と野性ゲゲンバウリ・ゴノズーイドの食餌を比較した最近の研究では、推定アピコンプレマ寄生虫が野生集団で検出された。培養動物6に不在。
記載された培養技術の既存の制限は、動物園の生産量の制限である。特に、記述された技術は、回転プランクトンホイール上の低密度で密閉された瓶の栽培を伴うので、このアプローチがスケールアップできるかどうか、または作業フローが自動化に適しているかどうかは不明です。しかし、より大規模な栽培システムは、別の繊細な小さなゼラチン海洋動物プランクトン種のために、幼虫オイコプレウラジオイカ、20、33、34、および、可能性があることを示唆している将来的にドリオリッド用の同様のシステムを設計することが可能です。しかし、O.ディオイカの単純な生活史と比較したD.ゲゲンバウリの複雑な生活史は、大規模栽培にとって大きな課題であり続けるでしょう。
結論として、ここで説明するプロトコルに従って、D.ゲゲンバウリは、その複雑な生命の歴史を通じて制御された実験室条件下で確実に栽培することができる。この能力は、種が制御された実験研究の様々なに適し、おそらく発生生物学と進化の新しい動物モデルとしてドリオリッドを開発します。ただし、この目標を達成するには、生産規模の制限を克服する必要があります。
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Disclosures
著者は宣言するものが何もありません。
Acknowledgments
G.Aを含め、長年にわたりこのプロジェクトに蓄積された知識を提供してくださった多くの方々に感謝しています。もともとこれらのプロトコルを開発したパフェンホーファーとD.デイベル。M.ケスターとL.ランボリーはまた、これらの手順の開発に大きく貢献しています。 N.B.ロペス・フィゲロアとロドリゲス・サンティアゴは、表1に提供されるドリオリッドの豊富さの推定値を生成しました。この研究は、米国国立科学財団賞OCE 082599、MEFへの1031263、MEFとOCE 14595010の共同プロジェクト、およびMEFとDMGへの米国海洋大気庁賞NA16SEC4810007によって一部支持されました。私たちは、R/Vサバンナの勤勉で専門的な乗組員に感謝しています。リー・アン・デレオがフィギュアを用意し、チャールズ・Y・ロバートソンが原稿を校正し、ジェームズ(ジミー)ウィリアムズがプランクトンホイールを製作
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
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