Les contractions utérines sont importantes pour le bien-être des femelles. Cependant, la contractilité pathologiquement accrue peut avoir comme conséquence la dysméorrhea, particulièrement dans les femelles plus jeunes. Ici, nous décrivons une préparation ex vivo simple permettant l'évaluation rapide de l'efficacité des relaxants lisses de muscle qui peuvent être employés pour traiter la dysméorrhea.
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Article de méthode
Méthode Ex Vivo pour évaluer la motilité spontanée de la mouse Reproductive Tract et un algorithme de suivi des mouvements uterus basé sur MATLAB pour l'analyse des données
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Résumé
Résumé
La dysmémérise, ou crampes douloureuses, est le symptôme le plus commun associé aux règles chez les femmes et sa sévérité peut entraver la vie quotidienne des femmes. Ici, nous présentons une méthode facile et peu coûteuse qui serait instrumentale pour tester de nouveaux médicaments diminuant la contractilité utérine. Cette méthode utilise la capacité unique de l'ensemble de l'appareil reproducteur de la souris à montrer la motilité spontanée lorsqu'il est maintenu ex vivo dans un plat Petri contenant tampon Krebs oxygéné. Cette motilité spontanée ressemble à l'activité myométriale ondulée de l'utérus humain, appelée ondes endométriales. Pour démontrer l'efficacité de la méthode, nous avons employé un médicament relaxant utérin bien connu, l'épinéphrine. Nous démontrons que la motilité spontanée de l'ensemble de l'appareil reproducteur de souris peut être rapidement et réversiblement inhibée par 1 épinéphrine de M dans ce modèle de plat de Petri. Documenter les changements de la motilité utérine peut être facilement fait à l'aide d'un téléphone intelligent ordinaire ou un appareil photo numérique sophistiqué. Nous avons développé un algorithme basé sur MATLAB permettant au suivi de mouvement de quantifier les changements spontanés de motilité utérine en mesurant le taux de mouvements de corne utérine. Un avantage majeur de cette approche ex vivo est que l'appareil reproducteur reste intact tout au long de l'expérience, préservant toutes les interactions cellulaires intra-utérines intrinsèques. La principale limitation de cette approche est que jusqu'à 10-20% de l'utérus peut ne présenter aucune motilité spontanée. Jusqu'à présent, il s'agit de la première méthode quantitative ex vivo pour évaluer la motilité utérine spontanée dans un modèle de plat Petri.
Introduction
En tant qu'organe féminin majeur, l'utérus est crucial pour la reproduction et essentiel pour la nourriture du fœtus1. L'utérus se compose de trois couches : le perimetrium, le myometrium et l'endomètre. Le myometrium est la couche contractile principale de l'utérus et joue un rôle clé dans l'accouchement du fœtus. L'endomètre est la couche la plus interne qui tapisse la cavité utérine et est essentielle à l'implantation d'embryons. Chez les femelles non enceintes en âge de procréer, la couche endométriale est remise mensuellement au début du cycle menstruel. Le myometrium aide dans ce processus d'excrétion en maintenant les contractions myométriales spontanées nécessaires pour dégager le tissu endométrial nécrotique de l'utérus1.
Malheureusement, l'augmentation de la contractilité myometriale peut entraîner des effets secondaires négatifs tels que la dysmémérisé, ou des crampes menstruelles douloureuses. Ceci est particulièrement vu chez les jeunes femmes et les femmes nulliparous2. Cependant, la dysmémérisme est différente pour chaque femme et dépend de la force de leurs contractions myométriales; des contractions plus fortes sont souvent associées à la sensation de crampes sévères3. La contractilité myométriale peut être visualisée à l'aide de l'échographie utérine et est souvent reconnue comme des ondes endométriales. La libération accrue des prostaglandines pendant la menstruation4 dans un utérus subissant le sloughing endométrial est censée contribuer à l'hypercontractilité myometrial accrue, ayant pour résultat l'ischémie et l'hypoxie du muscle utérin et ainsi augmenté douleur3.
La dysméorrhe sévère peut entraver l'activité quotidienne de certaines femmes et 3 à 33% des femmes ont une douleur très sévère, ce qui pourrait causer une femme à être alitée pendant 1 à 3 jours chaque cycle menstruel5. La dysméorrhe est la principale cause de morbidité gynécologique chez les femmes en âge de procréer, indépendamment de l'âge, de la nationalité et du statut économique5. La prévalence estimée de la dysméorrhe est à la fois élevée et variable, allant de 45 % à 93 % chez les femmes en âge de procréerde 5ans. La douleur associée à la dysménorrie a un effet sur la vie quotidienne des femmes et peut entraîner de mauvaises performances scolaires chez les adolescents, une qualité de sommeil inférieure, une restriction des activités quotidiennes et des changements d'humeur5.
Beaucoup de femmes qui souffrent de dysméorrhe sévère ont recours à des médicaments en vente libre pour soulager leur douleur. Ces médicaments en vente libre contiennent des inhibiteurs de la cyclooxygénase (COX) qui empêchent la formation de prostaglandines6. Cependant, les inhibiteurs de la COX sont associés à des événements cardiovasculaires indésirables, et environ 18 % des femmes atteintes de dysméorrhéa ne répondent pas à ces inhibiteurs7. Par conséquent, il ya un besoin de nouveaux médicaments pour réduire les crampes menstruelles. Puisque sur contractilité de l'utérus contribue à la pathogénie de la dysménorre, une stratégie possible peut être l'utilisation des relaxants utérins.
Il est bénéfique de quantifier les effets des médicaments relaxants potentiels dans un modèle de contractions naturelles spontanées ressemblant à des ondes myométriales. Cependant, jusqu'ici, aucune méthode ex vivo efficace pour tester des drogues de muscle-relaxant dans l'utérus intact n'a été décrite. Actuellement, des mesures de tension isométrique sont utilisées pour évaluer les effets des médicaments relaxants. Au cours de ces mesures, une bande musculaire utérine est maintenue à une longueur constante sous précharge dans un bain de tissu tandis que la force des contractions de muscle utérin est enregistrée avant et après la stimulation d'ocytocine en présence ou l'absence d'un médicament relaxant. Bien que cette approche soit très utile, elle nécessite un équipement coûteux. En outre, les contractions isométriques ne ressemblent pas aux contractions spontanées de myometrial-comme qui se produisent naturellement dans l'utérus intact. Unique, les ondes myométriales utérines chez les rongeurs peuvent être visualisées comme motilité de corne utérine quand l'ensemble de l'appareil reproducteur (ovaires, oviductes, utérus, et vagin) est maintenu dans une solution tampon. Ici, nous présentons une méthode ex vivo pour surveiller la motilité spontanée de l'utérus intact de souris placé dans un plat de Petri contenant le tampon oxygéné de Krebs. Nous décrivons également un algorithme de quantification de la motilité utilisant le tracker de mouvement MATLAB. Cette nouvelle approche offre une alternative facile et moins coûteuse pour tester le potentiel relaxant des remèdes naturels et des composés synthétiques.
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Protocole
Toutes les procédures avec des animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'École de médecine de l'Université de l'Indiana (Indianapolis, IN). Des souris femelles F2-129S-C57BL/6 sexuellement matures ont été utilisées dans l'étude.
MISE EN GARDE: Assurer la sécurité en portant un manteau de laboratoire, un masque et des gants lorsque vous travaillez avec des animaux et des matériaux biodangereux.
1. Préparation de la solution
- Préparer le Krebs Buffer, qui contient: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 0,56 mM MgCl2, 25 mM NaHCO3, et 5 mM glucose, pH 7,4. Oxygéner continuellement le tampon Krebs avec un mélange de gaz comprimés contenant 5% CO2 et 95% O2 tout en maintenant la température tampon à 37 oC à l'aide d'un bain d'eau circulant.
- Préparer la saline tamponnée de phosphate (DPBS) de Dulbecco, qui contient: 2,68 mM KCl, 1,47 mKH2PO4, 136,89 mM NaCl et 8,1 mM Na2HPO4, pH 7,4.
2. Préparation des animaux
- Anesthésier les souris par inhalation d'isoflurane (3%) avec des déchets de gaz charognards. Assurer une anesthésie adéquate en évaluant les réflexes de sevrage. Pincez l'orteil arrière pour affirmer qu'aucun mouvement n'est obtenu, ce qui indique une perte de réponses réflexes. Après l'anesthésie profonde est atteint, euthanasier l'animal par décapitation.
REMARQUE: L'isoflurane peut causer une dilatation musculaire lisse. Par conséquent, la préparation de l'appareil reproducteur doit être largement lavée et incubée dans le tampon Krebs pendant au moins 15-30 minutes avant de commencer les expériences ex vivo. Isoflurane peut causer une irritation et un inconfort quand il est en contact avec la peau, alors procédez avec prudence. - Placez le corps sur un grand bateau de pesée bordé d'un essuie-tout.
REMARQUE: Le personnel de laboratoire féminin enceinte ne devrait pas être impliqué dans des expériences avec l'isoflurane parce qu'il peut diminuer le poids foetal, diminuer l'ossification squelettique foetale, et augmenter le risque d'avortement spontané8,9. L'inhalation de CO2 peut être utilisée comme substitut pour euthanasier les souris.
3. Détermination de l'étape du cycle Estrous
- Avec de petits forceps, soulever le clitoris pour accéder à l'ostium vaginal et insérer lentement une pointe de micropipette contenant 10 L de DPBS dans le vagin.
- Assurez-vous que la pointe de micropipette est insérée dans l'ostium à un angle de 10 à 30 degrés pour éviter de perforer la paroi vaginale. Le liquide doit toujours être visible dans la pointe après l'insertion. Si le liquide n'est pas visible, la pointe a été insérée trop loin dans le vagin, et la zone paracervicale du vagin pourrait avoir été perforée.
- Tirez légèrement vers le bas sur les muscles vaginaux d'ostium avec la pointe de la micropipette pour permettre à l'air de sortir du vagin.
- Rincer lentement la cavité vaginale en faisant monter et descendre 2-3 fois avec 10 L de DPBS et placer la suspension de cellules dessinées sur une lame de verre.
- Utilisez un microscope de contraste de phase inversé pour déterminer l'étape du cycle estrous par l'analyse cytologique. La procédure se fait comme décrit ailleurs10,11. Assurez-vous que la suspension cellulaire ne se dessèche pas avant que l'analyse cytologique puisse être effectuée. La suspension peut être diluée avec dPBS frais, si nécessaire.
4. Ddissection de tract reproducteur de souris
- Disposer la souris en position de supine et étendre ses extrémités pour exposer la région abdominopelvic.
- Vaporiser avec 70% d'éthanol pour humidifier et désinfecter la zone abdominopelvic.
- À l'aide de forceps, soulevez soigneusement la peau située supérieure au clitoris. Faire de petites incisions transversales sur les aspects latéraux de la région abdominale inférieure, jusqu'aux extrémités supérieures pour exposer le péritoine (Figure 1A). Au cours de ce processus, un volet externe se formera. Comme de petites incisions sont continuellement faites, le rabat augmentera en taille.
- Couper soigneusement à travers le péritoine pour exposer le tractus gastro-intestinal (Figure 1B). Il est important de noter que les cornes utérines peuvent souvent être situées directement sous le péritoine, alors faites des incisions avec prudence et ne touchez pas les cornes car cela peut affecter la motilité utérine.
- À l'aide de forceps, retirer le fascia et le tissu adipeux couvrant le tractus gastro-intestinal. Enlever les segments gastro-intestinaux suivants de la cavité abdominale : le duodénum, le jejunum, l'iléum, le cecum, le côlon ascendant et transversal (Figure 1C).
- Pour localiser les organes reproducteurs, identifiez d'abord la vessie urinaire (figure1C, « 4 »), qui peut avoir une apparence dégonflée en raison de l'annulation après l'euthanasie. Le vagin sera juste sous la vessie.
- Localiser la symphyse pubienne au confluent des os pubiens (caudally à la vessie).
- À l'aide de ciseaux, enlever la symphyse pubienne en faisant soigneusement des incisions sur ses côtés latéraux à travers le tissu fibrocartilagineux interpubère pour accéder et fournir une voie pour l'extraction du vagin (Figure 1D).
- Couper à travers le périnée situé entre l'anus et la partie inférieure de la vulve.
- À l'aide de forceps, soulevez le vagin et excisez lentement le rectum.
- Identifiez deux cornes utérines qui bifurquent en une fourchette, rostalement au vagin. Localiser un oviducte et un ovaire alambiqués à l'extrémité de chaque corne, qui peuvent être cachés sous les segments gastro-intestinaux restants. Utilisez de petits ciseaux disséquants pour enlever les ligaments qui se connectent aux cornes, les oviductes et les ovaires dans la cavité abdominale et les soutiennent.
- Retirez l'appareil reproducteur, qui comprend le vagin, l'utérus, les oviductes et les ovaires, de la cavité abdominale.
- Transférer l'appareil reproducteur isolé (Figure 1E) dans un plat Petri de 100 mm rempli de 10 ml de DPBS. Ne comprimez pas les cornes utérines pour éviter d'endommager le myometrium.
- Utilisez des forceps et des ciseaux chirurgicaux pour enlever tout tissu conjonctif et adipeux entourant les cornes utérines et le vagin ainsi que toute fourrure dans la région pubienne qui pourrait nuire à la qualité de l'image. Enlever le ligament large pour permettre la motilité des cornes utérines.
- Laver l'appareil reproducteur isolé avec dPBS frais deux fois et le transférer dans un plat Petri de 35 mm rempli de 3 ml de solution Krebs oxygénée.
5. Imagerie tissulaire
- Placez le plat Petri contenant l'appareil reproducteur dans un tampon Krebs oxygéné sur une surface noire. Maintenir le plat à température ambiante.
REMARQUE: Il est possible d'utiliser un tampon de réchauffement infrarouge pour maintenir le tissu à 37 oC. - Laisser 15-30 min pour que les contractions spontanées commencent. Enregistrez la motilité utérine spontanée pendant 10 min à partir d'un avion axial à l'aide de n'importe quel type d'équipement vidéo numérique.
- Transférer la préparation dans un plat Petri contenant le tampon Krebs oxygéné complété par un composé d'essai. Enregistrez la motilité utérine spontanée pendant environ 10 min à partir d'un avion axial en utilisant n'importe quel type d'équipement vidéo numérique.
- Laver l'ensemble de l'appareil reproducteur dans un plat Petri de 100 mm avec 10 ml de DPBS pour évaluer la réversibilité du traitement.
- Transférer la préparation dans un plat Petri avec le tampon Krebs fraîchement oxygéné. Enregistrez la motilité utérine spontanée pendant environ 10 min à partir d'un avion axial en utilisant n'importe quel type d'équipement vidéo numérique.
- Transférer la préparation à un autre plat Petri de 35 mm rempli de tampon Krebs oxygéné complété avec le véhicule pour le composé d'essai pour s'assurer qu'il n'y a pas de changements induits mécaniquement dans la motilité utérine spontanée. C'est un contrôle important.
- Transférez les séquences vidéo sur un disque dur de l'ordinateur.
6. Analyse des données
- Faites des clips à l'aide de n'importe quel logiciel de montage vidéo à partir de la séquence vidéo originale contenant les épisodes de contrôle, de traitement et de lavage.
- Utilisez le logiciel MATLAB et le script fourni (voir matériel supplémentaire en ligne) pour quantifier la motilité utérine spontanée.
REMARQUE: L'add-on de boîte à outils de vision d'ordinateur pour MATLAB doit être installé pour que le script soit entièrement fonctionnel.- Ouvrez le script MATLAB, allez à l'onglet Editor et cliquez sur Exécuter.
- Sélectionnez le premier fichier vidéo et cliquez sur Ouvrez.
- Entrez une étiquette pour le fichier vidéo dans la boîte de dialogue pop-up et cliquez sur OK.
- Entrez l'intervalle de temps (s) nécessaire pour calculer le taux de mouvement de la corne (distance eucliden / 's).
- Utilisez le curseur de souris pour sélectionner deux points sur la première image de la vidéo. Une fenêtre contextuel vous demandera de confirmer que les points sélectionnés doivent être utilisés pour le suivi. Cliquez sur Démarrer pour lancer le processus de suivi en temps réel qui sera affiché dans la fenêtre contexty. Vous pouvez également cliquer sur Reselect Points pour résélectionner les deux points.
- Surveillez l'exactitude du processus de suivi sur la fenêtre contextuelle.
- Observez un taux par rapport à l'intrigue de diffusion du temps et la distance vs l'intrigue de diffusion du temps dans une nouvelle fenêtre pop-up. Enregistrer les deux chiffres en sélectionnant le fichier . Enregistrer comme dans la même fenêtre pour documenter les données.
- Trouvez un dossier nommé PointTrackerData, automatiquement créé par MATLAB, dans le même répertoire où se trouve le script MATLAB. Identifiez un fichier Excel nommé label-Data contenant des points de données collectés à partir de la vidéo dans deux onglets de feuille de travail distincts.
REMARQUE : N'importe quel logiciel alternatif de suivi de mouvement peut être employé pour quantifier la motilité spontanée d'utérus.
- Utilisez un logiciel approprié (p. ex., Excel ou SigmaPlot 13) pour effectuer l'analyse statistique.
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Résultats
La figure 1 montre des images représentatives prises pendant toute la procédure d'isolement de l'appareil reproducteur qui est décrite dans ce protocole. Pour éviter de contaminer le tampon avec de la fourrure, ce qui diminuerait la qualité vidéo, nous avons humidifié le corps de la souris avec 70% d'éthanol. La principale référence pour la section de dissection du protocole est de trouver la vessie urinaire. L'utérus et le vagin seront situés inférieurs à la vessie.
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Discussion
Ici, nous avons décrit une méthode pour évaluer la contractilité spontanée de l'appareil reproducteur entier de rongeur, qui inclut les ovaires, les oviducts, les cornes utérines, et le vagin. Nous avons utilisé une méthode semblable pour démontrer l'effet relaxant de la phényléphrine sur la motilité utérine spontanée13,cependant, dans le passé nous n'avons pas pu fournir l'analyse quantitative des données. Dans ce travail, nous avons développé un algorithme pour l'analyse quantitative des données...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des fonds internes d'UI. AGO a conçu l'étude. XC et AGO ont participé à la conception des expériences décrites. FL et AGO ont analysé et interprété les données. KLL, JOB, FL a effectué toutes les expériences ex vivo. FL a écrit le script MATLAB. KLL, JOB et AGO ont écrit le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Chlorhydrate d’épinéphrine | Sigma-Aldrich | ; E4642 ; | |
| de Dulbecco | sur PBS ; | 17-512Q | |
| Éthanol 200 PROOF | Decon Laboratories | 2701 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 · ; 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| MgCl2 ; · ; 6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 07-893-2374 | |
| Dissection Pince à éclats de précision à pointes extra-fines | Fisher Sceintific | 13-812-42 | |
| Ciseaux à iris fins incurvés trempés | Outils de sciences fines | 14091-09 | |
| Dissection Stéréomicroscope modulaire haute performance | Leica | MZ6 ; | |
| Appareil photo microscope couleur numérique de 5 mégapixels avec système de refroidissement actif | Leica | ·s ; DFC425 C | |
| Stereomaster Microscope Sources lumineuses à fibre optique | Fisher Sceintific ; | 12-562-21 | |
| Bateau de pesée | Fisher Sceintific ; | ||
| Convertors Astound Standard Surgical Blouse ; | Santé Cardinal ; | 9515 | Petits, moyens ou grands |
| gants | McKesson Corporation | 20-1080 | Petits, moyens ou grands ; gants chirurgicaux stériles en latex ou en nitrile non poudrés |
| ; Boîte de Pétri | Corning Falcon | 351029 | 100 mm |
| ; Boîte de Pétri | Corning Falcon | 353001 | 35 mm |
| 95 % O2- 5 % CO2 mélange gazeux | Praxair | ; MM OXCD5-K | |
| Masques à boucles d’oreille | Valumax International | 5430E-PP | |
| DSLR 24.2 MP Appareil photo | Canon | EOS Rebel T6i | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | version 2019 ou ultérieure |
Références
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Réimpressions et autorisations
