Méthode Ex Vivo pour évaluer la motilité spontanée de la mouse Reproductive Tract et un algorithme de suivi des mouvements uterus basé sur MATLAB pour l'analyse des données

En tant qu'organe féminin majeur, l'utérus est crucial pour la reproduction et essentiel pour la nourriture du fœtus¹. L'utérus se compose de trois couches : le perimetrium, le myometrium et l'endomètre. Le myometrium est la couche contractile principale de l'utérus et joue un rôle clé dans l'accouchement du fœtus. L'endomètre est la couche la plus interne qui tapisse la cavité utérine et est essentielle à l'implantation d'embryons. Chez les femelles non enceintes en âge de procréer, la couche endométriale est remise mensuellement au début du cycle menstruel. Le myometrium aide dans ce processus d'excrétion en maintenant les contractions myométriales spontanées nécessaires pour dégager le tissu endométrial nécrotique de l'utérus¹.

Malheureusement, l'augmentation de la contractilité myometriale peut entraîner des effets secondaires négatifs tels que la dysmémérisé, ou des crampes menstruelles douloureuses. Ceci est particulièrement vu chez les jeunes femmes et les femmes nulliparous². Cependant, la dysmémérisme est différente pour chaque femme et dépend de la force de leurs contractions myométriales; des contractions plus fortes sont souvent associées à la sensation de crampes sévères³. La contractilité myométriale peut être visualisée à l'aide de l'échographie utérine et est souvent reconnue comme des ondes endométriales. La libération accrue des prostaglandines pendant la menstruation⁴ dans un utérus subissant le sloughing endométrial est censée contribuer à l'hypercontractilité myometrial accrue, ayant pour résultat l'ischémie et l'hypoxie du muscle utérin et ainsi augmenté douleur³.

La dysméorrhe sévère peut entraver l'activité quotidienne de certaines femmes et 3 à 33% des femmes ont une douleur très sévère, ce qui pourrait causer une femme à être alitée pendant 1 à 3 jours chaque cycle menstruel⁵. La dysméorrhe est la principale cause de morbidité gynécologique chez les femmes en âge de procréer, indépendamment de l'âge, de la nationalité et du statut économique⁵. La prévalence estimée de la dysméorrhe est à la fois élevée et variable, allant de 45 % à 93 % chez les femmes en âge de procréer^{de 5}ans.  La douleur associée à la dysménorrie a un effet sur la vie quotidienne des femmes et peut entraîner de mauvaises performances scolaires chez les adolescents, une qualité de sommeil inférieure, une restriction des activités quotidiennes et des changements d'humeur⁵.

Beaucoup de femmes qui souffrent de dysméorrhe sévère ont recours à des médicaments en vente libre pour soulager leur douleur. Ces médicaments en vente libre contiennent des inhibiteurs de la cyclooxygénase (COX) qui empêchent la formation de prostaglandines⁶. Cependant, les inhibiteurs de la COX sont associés à des événements cardiovasculaires indésirables, et environ 18 % des femmes atteintes de dysméorrhéa ne répondent pas à ces inhibiteurs⁷. Par conséquent, il ya un besoin de nouveaux médicaments pour réduire les crampes menstruelles. Puisque sur contractilité de l'utérus contribue à la pathogénie de la dysménorre, une stratégie possible peut être l'utilisation des relaxants utérins.

Il est bénéfique de quantifier les effets des médicaments relaxants potentiels dans un modèle de contractions naturelles spontanées ressemblant à des ondes myométriales. Cependant, jusqu'ici, aucune méthode ex vivo efficace pour tester des drogues de muscle-relaxant dans l'utérus intact n'a été décrite. Actuellement, des mesures de tension isométrique sont utilisées pour évaluer les effets des médicaments relaxants. Au cours de ces mesures, une bande musculaire utérine est maintenue à une longueur constante sous précharge dans un bain de tissu tandis que la force des contractions de muscle utérin est enregistrée avant et après la stimulation d'ocytocine en présence ou l'absence d'un médicament relaxant. Bien que cette approche soit très utile, elle nécessite un équipement coûteux. En outre, les contractions isométriques ne ressemblent pas aux contractions spontanées de myometrial-comme qui se produisent naturellement dans l'utérus intact. Unique, les ondes myométriales utérines chez les rongeurs peuvent être visualisées comme motilité de corne utérine quand l'ensemble de l'appareil reproducteur (ovaires, oviductes, utérus, et vagin) est maintenu dans une solution tampon. Ici, nous présentons une méthode ex vivo pour surveiller la motilité spontanée de l'utérus intact de souris placé dans un plat de Petri contenant le tampon oxygéné de Krebs. Nous décrivons également un algorithme de quantification de la motilité utilisant le tracker de mouvement MATLAB. Cette nouvelle approche offre une alternative facile et moins coûteuse pour tester le potentiel relaxant des remèdes naturels et des composés synthétiques.

Toutes les procédures avec des animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'École de médecine de l'Université de l'Indiana (Indianapolis, IN). Des souris femelles F2-129S-C57BL/6 sexuellement matures ont été utilisées dans l'étude.

MISE EN GARDE: Assurer la sécurité en portant un manteau de laboratoire, un masque et des gants lorsque vous travaillez avec des animaux et des matériaux biodangereux.

1. Préparation de la solution

1. Préparer le Krebs Buffer, qui contient: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄, 0,56 mM MgCl₂, 25 mM NaHCO₃, et 5 mM glucose, pH 7,4. Oxygéner continuellement le tampon Krebs avec un mélange de gaz comprimés contenant 5% CO₂ et 95% O₂ tout en maintenant la température tampon à 37 oC à l'aide d'un bain d'eau circulant.
2. Préparer la saline tamponnée de phosphate (DPBS) de Dulbecco, qui contient: 2,68 mM KCl, 1,47 mKH₂PO₄, 136,89 mM NaCl et 8,1 mM Na₂HPO₄, pH 7,4.

2. Préparation des animaux

1. Anesthésier les souris par inhalation d'isoflurane (3%) avec des déchets de gaz charognards. Assurer une anesthésie adéquate en évaluant les réflexes de sevrage. Pincez l'orteil arrière pour affirmer qu'aucun mouvement n'est obtenu, ce qui indique une perte de réponses réflexes. Après l'anesthésie profonde est atteint, euthanasier l'animal par décapitation.
   REMARQUE: L'isoflurane peut causer une dilatation musculaire lisse. Par conséquent, la préparation de l'appareil reproducteur doit être largement lavée et incubée dans le tampon Krebs pendant au moins 15-30 minutes avant de commencer les expériences ex vivo. Isoflurane peut causer une irritation et un inconfort quand il est en contact avec la peau, alors procédez avec prudence.
2. Placez le corps sur un grand bateau de pesée bordé d'un essuie-tout.
   REMARQUE: Le personnel de laboratoire féminin enceinte ne devrait pas être impliqué dans des expériences avec l'isoflurane parce qu'il peut diminuer le poids foetal, diminuer l'ossification squelettique foetale, et augmenter le risque d'avortement spontané^8,9. L'inhalation de CO₂ peut être utilisée comme substitut pour euthanasier les souris.

3. Détermination de l'étape du cycle Estrous

1. Avec de petits forceps, soulever le clitoris pour accéder à l'ostium vaginal et insérer lentement une pointe de micropipette contenant 10 L de DPBS dans le vagin.
   1. Assurez-vous que la pointe de micropipette est insérée dans l'ostium à un angle de 10 à 30 degrés pour éviter de perforer la paroi vaginale. Le liquide doit toujours être visible dans la pointe après l'insertion. Si le liquide n'est pas visible, la pointe a été insérée trop loin dans le vagin, et la zone paracervicale du vagin pourrait avoir été perforée.
   2. Tirez légèrement vers le bas sur les muscles vaginaux d'ostium avec la pointe de la micropipette pour permettre à l'air de sortir du vagin.
2. Rincer lentement la cavité vaginale en faisant monter et descendre 2-3 fois avec 10 L de DPBS et placer la suspension de cellules dessinées sur une lame de verre.
3. Utilisez un microscope de contraste de phase inversé pour déterminer l'étape du cycle estrous par l'analyse cytologique. La procédure se fait comme décrit ailleurs^10,11. Assurez-vous que la suspension cellulaire ne se dessèche pas avant que l'analyse cytologique puisse être effectuée. La suspension peut être diluée avec dPBS frais, si nécessaire.

4. Ddissection de tract reproducteur de souris

1. Disposer la souris en position de supine et étendre ses extrémités pour exposer la région abdominopelvic.
2. Vaporiser avec 70% d'éthanol pour humidifier et désinfecter la zone abdominopelvic.
3. À l'aide de forceps, soulevez soigneusement la peau située supérieure au clitoris. Faire de petites incisions transversales sur les aspects latéraux de la région abdominale inférieure, jusqu'aux extrémités supérieures pour exposer le péritoine (Figure 1A). Au cours de ce processus, un volet externe se formera. Comme de petites incisions sont continuellement faites, le rabat augmentera en taille.
4. Couper soigneusement à travers le péritoine pour exposer le tractus gastro-intestinal (Figure 1B). Il est important de noter que les cornes utérines peuvent souvent être situées directement sous le péritoine, alors faites des incisions avec prudence et ne touchez pas les cornes car cela peut affecter la motilité utérine.
5. À l'aide de forceps, retirer le fascia et le tissu adipeux couvrant le tractus gastro-intestinal. Enlever les segments gastro-intestinaux suivants de la cavité abdominale : le duodénum, le jejunum, l'iléum, le cecum, le côlon ascendant et transversal (Figure 1C).
6. Pour localiser les organes reproducteurs, identifiez d'abord la vessie urinaire (figure1C, « 4 »), qui peut avoir une apparence dégonflée en raison de l'annulation après l'euthanasie. Le vagin sera juste sous la vessie.
7. Localiser la symphyse pubienne au confluent des os pubiens (caudally à la vessie).
8. À l'aide de ciseaux, enlever la symphyse pubienne en faisant soigneusement des incisions sur ses côtés latéraux à travers le tissu fibrocartilagineux interpubère pour accéder et fournir une voie pour l'extraction du vagin (Figure 1D).
9. Couper à travers le périnée situé entre l'anus et la partie inférieure de la vulve.
10. À l'aide de forceps, soulevez le vagin et excisez lentement le rectum.
11. Identifiez deux cornes utérines qui bifurquent en une fourchette, rostalement au vagin. Localiser un oviducte et un ovaire alambiqués à l'extrémité de chaque corne, qui peuvent être cachés sous les segments gastro-intestinaux restants. Utilisez de petits ciseaux disséquants pour enlever les ligaments qui se connectent aux cornes, les oviductes et les ovaires dans la cavité abdominale et les soutiennent.
12. Retirez l'appareil reproducteur, qui comprend le vagin, l'utérus, les oviductes et les ovaires, de la cavité abdominale.
13. Transférer l'appareil reproducteur isolé (Figure 1E) dans un plat Petri de 100 mm rempli de 10 ml de DPBS. Ne comprimez pas les cornes utérines pour éviter d'endommager le myometrium.
14. Utilisez des forceps et des ciseaux chirurgicaux pour enlever tout tissu conjonctif et adipeux entourant les cornes utérines et le vagin ainsi que toute fourrure dans la région pubienne qui pourrait nuire à la qualité de l'image. Enlever le ligament large pour permettre la motilité des cornes utérines.
15. Laver l'appareil reproducteur isolé avec dPBS frais deux fois et le transférer dans un plat Petri de 35 mm rempli de 3 ml de solution Krebs oxygénée.

5. Imagerie tissulaire

1. Placez le plat Petri contenant l'appareil reproducteur dans un tampon Krebs oxygéné sur une surface noire. Maintenir le plat à température ambiante.
   REMARQUE: Il est possible d'utiliser un tampon de réchauffement infrarouge pour maintenir le tissu à 37 oC.
2. Laisser 15-30 min pour que les contractions spontanées commencent. Enregistrez la motilité utérine spontanée pendant 10 min à partir d'un avion axial à l'aide de n'importe quel type d'équipement vidéo numérique.
3. Transférer la préparation dans un plat Petri contenant le tampon Krebs oxygéné complété par un composé d'essai. Enregistrez la motilité utérine spontanée pendant environ 10 min à partir d'un avion axial en utilisant n'importe quel type d'équipement vidéo numérique.
4. Laver l'ensemble de l'appareil reproducteur dans un plat Petri de 100 mm avec 10 ml de DPBS pour évaluer la réversibilité du traitement.
5. Transférer la préparation dans un plat Petri avec le tampon Krebs fraîchement oxygéné. Enregistrez la motilité utérine spontanée pendant environ 10 min à partir d'un avion axial en utilisant n'importe quel type d'équipement vidéo numérique.
6. Transférer la préparation à un autre plat Petri de 35 mm rempli de tampon Krebs oxygéné complété avec le véhicule pour le composé d'essai pour s'assurer qu'il n'y a pas de changements induits mécaniquement dans la motilité utérine spontanée. C'est un contrôle important.
7. Transférez les séquences vidéo sur un disque dur de l'ordinateur.

6. Analyse des données

1. Faites des clips à l'aide de n'importe quel logiciel de montage vidéo à partir de la séquence vidéo originale contenant les épisodes de contrôle, de traitement et de lavage.
2. Utilisez le logiciel MATLAB et le script fourni (voir matériel supplémentaire en ligne) pour quantifier la motilité utérine spontanée.
   REMARQUE: L'add-on de boîte à outils de vision d'ordinateur pour MATLAB doit être installé pour que le script soit entièrement fonctionnel.
   1. Ouvrez le script MATLAB, allez à l'onglet Editor et cliquez sur Exécuter.
   2. Sélectionnez le premier fichier vidéo et cliquez sur Ouvrez.
   3. Entrez une étiquette pour le fichier vidéo dans la boîte de dialogue pop-up et cliquez sur OK.
   4. Entrez l'intervalle de temps (s) nécessaire pour calculer le taux de mouvement de la corne (distance eucliden / 's).
   5. Utilisez le curseur de souris pour sélectionner deux points sur la première image de la vidéo. Une fenêtre contextuel vous demandera de confirmer que les points sélectionnés doivent être utilisés pour le suivi. Cliquez sur Démarrer pour lancer le processus de suivi en temps réel qui sera affiché dans la fenêtre contexty. Vous pouvez également cliquer sur Reselect Points pour résélectionner les deux points.
   6. Surveillez l'exactitude du processus de suivi sur la fenêtre contextuelle.
   7. Observez un taux par rapport à l'intrigue de diffusion du temps et la distance vs l'intrigue de diffusion du temps dans une nouvelle fenêtre pop-up. Enregistrer les deux chiffres en sélectionnant le fichier . Enregistrer comme dans la même fenêtre pour documenter les données.
   8. Trouvez un dossier nommé PointTrackerData, automatiquement créé par MATLAB, dans le même répertoire où se trouve le script MATLAB. Identifiez un fichier Excel nommé label-Data contenant des points de données collectés à partir de la vidéo dans deux onglets de feuille de travail distincts.
      REMARQUE : N'importe quel logiciel alternatif de suivi de mouvement peut être employé pour quantifier la motilité spontanée d'utérus.
3. Utilisez un logiciel approprié (p. ex., Excel ou SigmaPlot 13) pour effectuer l'analyse statistique.

La figure 1 montre des images représentatives prises pendant toute la procédure d'isolement de l'appareil reproducteur qui est décrite dans ce protocole. Pour éviter de contaminer le tampon avec de la fourrure, ce qui diminuerait la qualité vidéo, nous avons humidifié le corps de la souris avec 70% d'éthanol. La principale référence pour la section de dissection du protocole est de trouver la vessie urinaire. L'utérus et le vagin seront situés inférieurs à la vessie.

Pour tester le protocole, nous avons traité l'ensemble de l'appareil reproducteur avec de l'épinéphrine. L'épinéphrine est bien connue pour causer la relaxation musculaire lisse utérine. Cette hormone est produite endogènement dans la médulle surrénale et sert d'hormone de stress chez les mammifères. Nous avons utilisé 1 'M d'épinéphrine dans nos expériences. Il s'agit d'une concentration saturante connue pour provoquer une réponse maximale12. Une série de quatre expériences ont été réalisées. Dans tous les essais, 1 épinéphrine de M a inhibé de façon réversible une motilité utérine spontanée (figure 2).

Pour quantifier la motilité spontanée de l'appareil reproducteur, nous avons conçu un algorithme nous permettant d'évaluer le taux moyen de changement dans la distance euclidienne entre deux points sélectionnés sur l'appareil reproducteur de la souris. Les positions ponctuelles sont suivies à l'aide du module de suivi des mouvements du logiciel MATLAB. Le script correspondant de MATLAB, que nous avons utilisé pour calculer les distances eucliden, est fourni dans le matériel supplémentaire en ligne. La position des points est essentielle pour une procédure de suivi des mouvements réussie. Il faut tenir compte de la qualité des vidéos, car les reflets lumineux du mur du plat Petri peuvent distraire le détecteur de mouvement, et il peut cesser de suivre le mouvement du klaxon tout en réaffectant le point à l'une des lumières Réflexions. Nous avons choisi de placer l'un des points au milieu d'une corne pour s'assurer qu'il était assez loin des reflets du mur à vaisselle Petri. Le deuxième point a été habituellement choisi sur le vagin puisqu'il n'a pas montré la motilité spontanée. La figure 3 fournit un échantillon d'analyse de données, et la figure 1 supplémentaire montre les images représentatives acquises lors du suivi des mouvements.

Figure 1 : Étapes de l'isolement de l'ensemble de l'appareil reproducteur. (A) Une incision dans la peau a été faite et la région abdominopelvic a été exposée au-dessus du péritoine (1). (B) La membrane séreuse a été lentement ouverte pour exposer le tractus gastro-intestinal (2). (C) Le tractus gastro-intestinal a été déplacé pour exposer les cornes utérines (3). La vessie urinaire (4) peut être visualisée près de la conjonction des cornes. (D) Les cornes utérines ont été libérées et des coupures ont été faites sur les côtés latéraux de la symphyse pubienne (5) pour exposer le vagin (6). (E) Enlèvement de l'appareil reproducteur isolé et placement dans la solution DPBS. Tout excès de fourrure ou de tissu conjonctif a été enlevé. (F) Une indentation profonde peut être vue sur le vagin (à droite) après l'ablation du rectum (gauche, 7). (G) Le tissu conjonctif environnant est enlevé. Un appareil photo numérique et un logiciel Application Suite (version 3.7.0) ont été utilisés pour acquérir des images en temps réel lors de la dissection (réglage de la caméra : teinte 20/saturation 80). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Une expérience représentative avec l'ensemble de l'appareil reproducteur isolé est montrée. Les images ont été prises 15 s d'intervalle avant (A), pendant (B), et après (C) l'application de 1 'M épinéphrine. La préparation de l'appareil reproducteur a montré une forte motilité dans les panneaux A et C en l'absence d'épinéphrine, mais elle est quiescente dans le panneau B avec la présence de 1 m d'épinéphrine. Les séquences vidéo inédites sont fournies sous forme de vidéos supplémentaires 1-3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Analyse des données dans l'expérience ex vivo décrite en Figure 2. (A) Un cours de temps du taux de changement de distance euclidn est montré. Les points de référence entre lesquels la distance a été déterminée au cours de la motilité utérine spontanée sont indiqués sous forme de points verts dans l'encastrement. Les points ont été choisis à la partie proximale du vagin et le segment moyen d'une corne utérine telle qu'elle est représentée. Les cercles bleus remplis montrent les valeurs spontanées de taux de motilité avant d'ajouter l'adrénaline, les cercles rouges montrent les taux spontanés de motilité en présence de 1 'M d'épinéphrine, et les cercles remplis verts montrent les taux spontanés de motilité après un lavage. (B) Comparaison des taux moyens de changement de distance euclidin (pixels/s) avant l'ajout de l'épinéphrine (barre bleue), en présence de 1 'M d'épinéphrine (barre rouge), et après un lavage (barre verte). Le logiciel MATLAB a été utilisé pour quantifier la motilité utérine. L'intervalle de t a été réglé à 5 s. « Distance » est calculé comme la différence entre la distance initiale du cadre et la distance du cadre 5 s plus tard. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide de Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks, suivie de toutes les procédures de comparaison multiples en deux termes selon la méthode dunn à l'aide de SigmaPlot 13. L'astérisque indique l'ensemble de données qui était significativement différent des autres ensembles de données expérimentales (P 'lt;0.001). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Film supplémentaire 1: Clip vidéo Time-lapse montrant la motilité utérine spontanée avant d'ajouter 1 'M d'épinéphrine. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Film supplémentaire 2: Clip vidéo Time-lapse montrant la motilité utérine spontanée lorsque le tampon Krebs a été complété par 1 'M d'épinéphrine. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Film supplémentaire 3: Clip vidéo Time-lapse montrant la motilité utérine spontanée après lavage. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Figure supplémentaire 1: Images représentatives prises tous les 15 s pendant le suivi des mouvements. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Matériel supplémentaire : Le script d'algorithme de suivi basé sur MATLAB. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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