Summary
프로토콜은 비 유전적 결함 전사 신장의 시험관 내 뮤린 암종 모델을 자세히 설명합니다. 여기서, CDK9의 만성 억제는 모든 암 유형의 약 20%에서 존재하는 임상적으로 과용된TE 를 모방하고 연구하기 위해 프로-염증 반응 유전자를 따라 RNA Pol II의 생산적인 신장을 억압하는 데 사용된다.
Abstract
우리는 이전에 암의 부분 집합이 mRNA 전사 신장 (TE)에 있는 광범위한 결핍을 가진 글로벌 전사 deregulations에 의해 정의된다는 것을 보고했습니다- 우리는 TE와 같은 암을확실히칭합니다. 특히, TE확실히 암은 그들의 억압으로 이끌어 내는 인터페론/JAK/STAT 및 TNF/NF-θB 통로와 같은 유전자의 큰 세트에서 가짜 전사 및 결함이 있는 mRNA 처리를 특징으로 합니다. TE는 신장 세포 암및 전이성 흑색종 환자에 있는 종양의확실히 특수형은 면역 요법에 있는 나쁜 반응 및 결과와 유의하게상관합니다. 면역 요법에 대한 중요한 장애물을 포팅으로 -이 프로토콜의 목표는 이러한 광범위하고 비 유전적 연구를 위해 체외 TE확실히 마우스 모델을 확립하는 것입니다. 암에 있는 전사 이상 및 새로운 통찰력, 기존 약에 대한 새로운 용도를 얻거나, 그 같은 암에 대하여 새로운 전략을 찾아내십시오. 우리는 RNA 폴리머라제 II(RNA Pol II)의 C 말단 반복 도메인(CTD)에 세린 2 잔기의 인산화를 폐지하기 위해 만성 플라보피리돌 중재 CDK9 억제를 상세히 설명하며, RNA Pol II의 방출을 생산적인 전사체로 억제합니다. 신장. TE가확실히 어떤 특정 체세포 돌연변이의 밑에 분류되지 않다는 것을 감안할 때, 약리학 모형은 유리하고, 그(것)들에서 관찰된 광범위한 전사 및 후생유전학 결함을 가장 잘 모방합니다. 플라보피리돌의 최적화된 치사용량의 사용은 전사 신장 및 mRNA 처리 결함에서 비유전적 광범위한 중단의 일반화 가능한 모델을 만드는 유일한 효과적인 전략이며, 임상적으로 관찰된 TE를 밀접하게 모방합니다. 확실히 특성. 따라서, TE의 이 모형은확실히 면역성이 있는 중재한 세포 공격에 저항하는 에서 그(것)들을 가능하게 하는 세포 자율적인 요인을 해부하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
거의 모든 활성 유전자의 발현에서 중요한 속도 제한 단계는 프로모터 근위식 일시에서 생산적인 신장1,2로의RNA 폴리머라제 II(RNA Pol II)의 전이이다. 전사 신장의 후생 유전학 적 dysregulationTE확실히로 정의 된 여러 인간의 악성 종양의 진행에 도움이 주어진, 가난한 응답에 달하는 프로 염증 반응 경로에서 최적이 아닌 신호로 이어지는 면역 요법3에대한 결과, 이 프로토콜의 가장 중요한 목표는 암에서 이러한 광범위한 비 유전 적 전사 이상을 연구하는 유용한 시험관 내 모델을 확립하는 것입니다. 이러한 관점에서, CDK9의 만성 약리학적 억제의 사용은 전사 신장 및 mRNA 처리 결함에 있는 비 유전적 광범위한 중단의 일반화 가능한 모형을 만들기위한 효과적인 전략이다. 만성 CDK9 억제를 사용하는 근거는 RNA Pol II의 C 말단 반복 도메인(CTD)에 세린 2 잔기의 인산화를 제거하여 RNA Pol II의 방출을 생산적인 전사 신장으로 억제한다는 것입니다. 또한,TE확실히 암, 우리의 그룹3에의해 이전에 설명한, 어떤 특정 체세포 돌연변이의 밑에 분류되지 않습니다. 따라서 비유전적(pharmaological) 모델은 유리하며 그(것)들에서 관찰된 광범위한 전사 및 후생유전학 적 결함을 가장 잘 모방한다. 본 명세서의 방법은 뮤린 암세포의 만성 플라보피리돌 치료 모델의 생성 및 특성화를 상세히 설명한다. 이 방법은 더 긴 게놈 길이를 특징으로 하는 유전자를 따라 전사 신장을 명백하게 방해하며, TNF/NF-θB 및 인터페론/STAT 신호와 같은 유도성 발현과 함께, 심오하게 조절되는 유전자의 수준에서 제어됩니다. 전사 신장3,4,5. 전반적으로, 전사 신장 결함의 이 최적화된 뮤린 세포주 모형은 새로 기술된TE를 연구하는 우리의 지식에 유일한 모형이 확실히 종양을 연구하기 위하여- 반대로 종양 면역 공격에 저항을, 악용하기 위하여 유용한 시스템을 렌더링하고 암에서 핵심 전사 기계에서 비 유전 적 결함의 취약점을 검사 vis-à-vis 면역 매개 세포 공격.
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Protocol
신시내티 아동 연구 재단의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 및 기관 생물 안전위원회는 모든 동물 실험 절차 (IACUC 프로토콜 #2017-0061 및 IBC 프로토콜 #IBC2016-0016)를 승인했으며, 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 설명된 표준에 따라 수행되었다.
1. 플라보피리돌 치료에 의한 RNA Pol II의 만성 억제-기본 전략
- 종자 B16/F10 마우스 흑색종 세포는 저밀도 (0.2 x 106)그들의 해당 배지에서 10cm 배양 판 (덜베코의 변형 된 독수리 배지 [DMEM], 10 % 태아 소 혈청 [FBS], 1 % 페니실린 및 연쇄상 구균 [펜 / 스트렙]) 및 밤새 인큐라토리 37°C, 5%CO2 가습 인큐베이터에.
- 다음 날, 1x 인산완충식염수(PBS)로 세포를 세척하고, RNA Pol II 연신계 p-TEFb(사이클린 T/CDK9)의 억제제인 플라보피리돌의 서브치명적인 용량(25nM으로 추정)을 가진 배양 배지의 새로운 배치를 추가합니다-1주일 동안 추가 없이 하위 배양.
- flavopiridol 처리의 주 에 따라,TE에서 본 전사 신장 결점의 각종 속성을 재량화하는 모형의 능력을 평가하기 위하여 확증적인 계산을 능력을 확실히 암.
2. 생성된 마우스TE에서 의한 인터페론(IFN) 통로 및 종양 괴사 인자(TNF) 경로 신호의 결함있는 RNA Pol II 기능 및 손상을 평가하는 확인 면역블롯 분석법
- 배양 균등수 (105)B16/F10 마우스 흑색종 세포와 부모 B16/F10 마우스 흑색종 세포의 두 개의 서로 다른 세트에 12 웰 플레이트 (RNA Pol II 기능 특성화에 대한 하나의 세트및 사이토 카인에 대한 다른 세트 자극)을 37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에서 하룻밤 동안.
- 다음날, 37°C에서 45분 동안 마우스 IFN-γ, IFN-α(5 ng/mL) 또는 TNF-α(5 ng/mL)로 설정된 사이토카인 자극에서 세포를 치료한다.
- 지금, 사이토카인 및 RNA Pol II 기능적 특성화 세트 모두에서 세포로부터 단백질을 추출하는 것은 다음과 같은 방식으로 방사성 면역 침전 분석(RIPA) 용해 완충액을 이용하여 설정한다:
- 1x PBS로 세포를 세척하고 잘 당 50 μL의 lyse. 4 °C, 21,130 x g에서용해 된 세포를 긁어 낸 다음.
- 세제 용해 (Bradford 또는 유사한 분석법)에 따라 단백질 농도에 대한 표준 색색 분석법을 사용하여 세포 용해 초온제에서 단백질을 측정합니다.
- 각 시료에서 측정된 단백질(15 μg)을 4%-18% 나트륨 도데실 황산염(SDS) 폴리아크릴라미드 젤로 적재하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮긴다.
- 1시간 동안 1시간 동안 트리스 완충식포-폴리소르베이트 20(TBST)에서 5% 건조 우유에서 PVDF 멤브레인을 차단하고 1차 항체를 가진 4°C에서 하룻밤 배양을 한 후(RNA Pol II 1:1000; p-SER2 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II; 1:1000; H3K36me3 1:2000; 총 H3 1:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; NFθB 1:1000; p-NFθB 1:1000; β-액틴 1:5000) 5% 소 혈청 알부민.
- 다음날, PVDF 멤브레인을 실온(RT)에서 15분 동안 1x TBST로 세척하고, 적절한 이차 항체(RNA Pol II, p-SER2 RNA Pol II, p-SER5 RNA Pol II, P-SER5 RNA Pol II, H3K36me3, 총 H33에 대한 항-토끼(1:5000)로 배양한다. STAT1, p-STAT1, NFθB 및 p-NFθB는 RT에서 50분 동안 향상된 화학발광을 함유한 시판 고추냉이 과산화 증제(HRP) 기판을 사용하여 단백질 신호를 감지합니다.
참고: β-액틴 1차 사용은 HRP-컨쥬게이드, 따라서 이차없이 개발될 수 있다.
3. 생성된 마우스 TE에서 mRNA 처리 결함을 평가하는 확인 분석법확실히 모델
- 종자 동등한 수 (0.2 x 106)플라보피리돌 처리 B16/F10 마우스 흑색종 세포 및 부모 B16/F10 마우스 흑색종 세포를 37°C에서 37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에서 하룻밤 동안 처리하였다.
- RNA 추출 시약 또는키트(물자 표)를이용하여 60% 동률에서 배양된 세포로부터 총 RNA를 추출한다.
- 추출된 총 RNA로부터 rRNA를 다음과 같은 방식으로 고갈시면 다음과 같은 방식으로
참고: 낮은 입력 프로토콜은 rRNA를 고갈시키기 위해 시판되는 키트에서 공동 선택되었습니다.- 한 개의 수조 또는 열 블록을 70-75°C로 설정하고 다른 수조 또는 열 블록을 37°C로 설정합니다.
- 1 μL의 선택적 rRNA 고갈 프로브와 30 μL의 하이브리드화 버퍼로 총 RNA(뉴클레아제 없는 물 2 μL에 100-500 ng)를 추가하고, 소용돌이에 의해 부드럽게 혼합하고 5 분 동안 70-75 °C에서 배양하십시오.
- 이제 튜브를 37°C 수조/열 블록으로 옮기고, 30분 동안 시료를 37°C로 냉각시우려한다.
- 1.5 mL RNase-free 미세원원원지 튜브에서 선택적 rRNA 고갈 프로브 자기 비드를 소용돌이에 의해, 및 비드의 aliquot 75 μL을 재중단시켰다.
- 비드 서스펜션을 마그네틱 분리기위에 1분 동안 놓습니다. 부드럽게 흡인하고 상급을 버립니다. 75 μL의 뉴클레아제 없는 물을 추가하고 자기 분리 후 상판을 폐기하여 다시 한 번 구슬을 세척반복합니다.
- 혼성화 완충제의 75 μL에서 세척된 비드를 재중단하고, 25 μL의 바이쿼트(aliquot)를 다른 튜브에 재중단하고 나중에 사용하기 위해 37°C에서 유지한다.
- 나머지 50 μL 비드를 자기 분리기위에 1분 동안 놓고 상한체를 버립니다. 혼성화 완충제의 20 μL에서 비드를 다시 중단하고 나중에 사용하기 위해 37 °C에서 유지하십시오.
- RNA/선택적 rRNA 고갈 프로브 혼합물을 30분 동안 37°C로 냉각한 후, 튜브를 잠시 원심분리하여 튜브의 바닥으로 샘플을 수집하였다.
- 3.3.7단계에서 준비된 자기 비드로 RNA/선택적 rRNA 고갈 프로브 혼합물의 33 μL을 전달한다. 저속 소용돌이로 섞으세요.
- 튜브를 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 배양 중에 내용물기를 가끔 부드럽게 섞으세요. 이어서 튜브의 바닥에 샘플을 수집하기 위해 간단한 원심분리를 하였다.
- 튜브를 자기 분리기 위에 1분 동안 놓고 rRNA-프로브 복합체를 펠렛합니다. 이번에는 상급을 버리지 마십시오. 상급은 rRNA 고갈된 RNA를 포함합니다.
- 3.3.6단계에서 25 μL의 구슬 튜브를 자기 분리기위에 1분 동안 놓고 상한체를 버립니다. 3.3.11 단계에서 상급체를 구슬의 새로운 튜브에 추가합니다. 저속 소용돌이로 섞으세요.
- 튜브를 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 배양 중에 내용물기를 가끔 부드럽게 섞으세요. 튜브를 잠시 원심분리하여 튜브의 바닥으로 샘플을 수집합니다.
- 튜브를 자기 분리기 위에 1분 동안 놓고 rRNA-프로브 복합체를 펠렛합니다. 상급제는 버리지 마십시오. rRNA 고갈RNA를 함유하는 상층부(약 53 μL)를 새로운 튜브로 옮니다.
- 분광광도계에 의하여 RNA 수율의 농도를 측정합니다.
- 올리고(dT)25를 함유하는 자기 비드에 대한 입력으로 rRNA 고갈된 샘플의 절반을 사용하여 다음과 같은 방식으로 polyA+ RNA를 추출합니다.
참고: 자기 비드의 표면에 결합된 올리고 dT 서열을 사용하여 폴리아 테일 메신저 RNA를 분리하는 이 프로토콜은 시판되는키트(물자 표)로부터공동 선택되었다.- >30s에 대한 간략하게 소용돌이에 의해 바이알내의 올리고 dT 비드를 재중단하고 200 μL의 올리고 dT 비드를 튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 한다. 바인딩 버퍼의 동일한 볼륨(200 μL)을 추가하고 다시 일시 중단합니다.
- 튜브를 자석에 1 분 동안 놓고 상류를 버립니다. 이제, 자석으로부터 튜브를 제거하고 100 μL의 결합 완충제에서 세척된 올리고 dT 비드를 다시 중단한다.
- 입력 rRNA 고갈 된 총 RNA 샘플의 부피를 100 μL로 10mMM Tris-HCl pH 7.5로 조정합니다. 이제 바인딩 버퍼의 100 μL을 추가합니다.
- 이차 RNA 구조를 방해하기 위해 2 분 동안 65 °C로 가열하십시오. 지금, 즉시 얼음에 배치.
- 총 RNA의 200 μL을 100 μL 세척 된 구슬에 추가하십시오. RT에서 5분 동안 로터에서 지속적으로 회전하여 완전히 혼합하고 바인딩할 수 있습니다.
- 튜브를 자석에 1-2 분 동안 놓고 조심스럽게 모든 상급체를 제거하고 조심스럽게 모든 상급을 제거하십시오.
- 자석에서 튜브를 제거하고 세척 버퍼 200 μL을 추가합니다.
- 추출 광도계에 의해 추출된 폴리아+ RNA의 순도와 농도를 측정합니다.
참고: 1.90-2.00의 260/280 비율과 모든 RNA 샘플에 대해 260/230 의 260/230 비율이 허용되는 것으로 간주됩니다. - 단클론 7-메틸구아노신을 사용하여 면역 침전5-프라임 캡드 RNA를 면역 침전증에 단백질 A 컬럼에 입력으로 섹션 3.3에서 rRNA 고갈 된 샘플의나머지 절반을 사용 다음과 같은 방식으로 항체:
참고: 시판되는 RNA 면역침전 키트를 사용하여 m7G 캡핑 메신저 RNA를 분리하는 이 프로토콜은 공동 선택되고 추가로 수정되었다.- 제조자의 프로토콜에 따라 RIP 키트로부터 얻어진 단백질A 자기 비드를 세척하여 항체를 비드에 미리 결합한다.
- 7-메틸구아노신 항체의 3 μg(키트에 제공된 토끼 IgG는 네거티브 컨트롤을 사용할 수 있음)을 키트로부터 100 μL 세척 버퍼에 부유된 미세원심지 튜브에 구슬을 사용한다.
- RT. 원심분리기 튜브에서 30 분 동안 저속 회전으로 인큐베이션 한 다음 튜브를 자기 분리기에 놓고 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
- 튜브를 제거하고 키트와 소용돌이에서 500 μL의 세척 버퍼를 잠시 추가합니다. 튜브를 잠시 후 다시 한 번 자기 분리를 제거하고 상판을 제거합니다.
- 3.6.4 단계를 다시 한 번 반복합니다.
- 약 120 ng의 rRNA 고갈(섹션 3.3으로부터)을 미리 세척된 7-메틸구아노신 항체 결합 구슬에 첨가한다. RNase 억제제 1 μL을 첨가합니다. 가벼운 교반으로 1-1.5 시간 동안 RT에서 배양하십시오.
- 10s에 대한 300 x g에서 구슬을 스핀 다운하고 새로운 미세 원심 분리 튜브에 뚜껑이없는 (비- 메틸 과노신) mRNA를 포함하는 상급물질을 제거합니다.
- 100 μL의 세척 버퍼를 추가하고 두 번 더 비슷하게 씻으하십시오. 수집된 상급체를 동일한 미세원심지 튜브에 풀링하여 미뚜껑이 없는(비-7-메틸과노신) mRNA로 표시하였다. 얼음에 보관하십시오.
- 7 M 요소, 2% SDS, 0.35 M NaCl, 10 mM EDTA 및 10 mM Tris, pH 7.5를 함유하는 300 μL의 요소 용해 완충액(ULB)을 함유하는 비드로부터 mRNA(7-메틸구아노신) mRNA를 65°C에서 2-3-3분 동안 가열한다.
- 용출 된 샘플 (뚜껑 및 미포함 된 mRNA)의 300 μL의 페놀 : 클로로 포름 : 이소아밀 알코올 (25 : 24 : 1; 시판 가능)을 혼합하십시오 (4 °C에서 보관). 뒤집어잘 섞어서 약 10분간 그대로 두은 다음 다시 부드럽게 섞어주세요.
- 18,928 x g의 원심분리기를 2분 간 조심스럽게 피펫하여 상층을 신선한 튜브로 만들고 바닥층을 버립니다.
- 300 μL의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1; 4°C에서 보관)을 시료에 넣습니다. 18,928 x g에서 원심 분리기를 1 분 동안 잘 섞어 조심스럽게 상단 층을 신선한 튜브에 파이펫하고 바닥 층을 버립니다.
- 2-포르파놀 300 μL과 3M 아세테이트 나트륨 30 μL(pH 5.2)을 뚜껑이 없는 RNA에 넣습니다. 샘플을 몇 번 반전시키고 20 시간 동안 -20 °C에 놓습니다.
- 이제 4°C에서 10분 동안 18,928 x g에서 샘플을 원심분리합니다. 조심스럽게 상류를 제거하고 70 % 에탄올의 500 μL을 추가합니다.
- 4 °C에서 10 분 동안 18,928 x g에서 다시 원심 분리기. 조심스럽게 상류물을 버리고 RT에서 펠릿을 5 분 이내에 건조시십시오.
- 분광광도계에 의하여 RNA 수율의 순도 및 농도를 측정합니다. 260/280 비율은 모든 RNA 샘플에 대해 1.90-2.00, 260-230 비율의 범위에 있어야 합니다.
4. FasL 매개 세포 사멸에 마우스 TE의 반응을 평가하는 확인 분석법확실히 모델
- 플라보피리돌의 종자 동등한 수(30,000세포)는 B16/F10 마우스 흑색종 세포와 부모B16/F10 마우스 흑색종 세포를 그들의 상응하는 배지(DMEM)에서 96웰 배양판에서, 37°C에서 하룻밤 배양하고, 5%CO2 가습 부 화기.
- h의 다른 농도를 가진 배양후드에서 세포를 치료 (0.1-1000 ng/mL) 존재 10 μg/mL 항-그의 항체및 37°C에서 24 시간 동안 배양, 5%CO2 가습 인큐베이터.
- 1x PBS 버퍼로 세척하여 죽은 세포를 제거합니다. 부착된 세포를 RT에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드에 고정하고 4% 파라포름알데히드(씻을 필요가 없음)를 버리고 크리스탈 바이올렛 용액(메탄올 20%, 1x PBS에서 0.5% 크리스탈 바이올렛)으로 얼룩을 30분 동안 제거합니다.
- 수돗물로 접시를 부드럽게 헹구어 여분의 얼룩을 제거합니다. RT에서 플레이트를 건조상태로 유지하십시오.
- 1x PBS에 용해된 100 μL의 100 μL에서 크리스탈 바이올렛을 재용해 내고, 마이크로플레이트 리더에서 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 밀도를 측정한다.
5. 항원 특이적 세포독성 T 세포 발작에 대한 마우스 TE의 반응을평가하는 탐사 분석법
- OT-I CD8+ 세포독성 T 세포 발작(CTL)의 격리 및 활성화
- 마우스 CD8 T 셀 분리 키트를 사용하여 자기 세포 분리에 의해 OT-I TCR TG RAG-1−− 마우스의 비장으로부터 CD8+ 세포를 다음과 같이 정화한다:
- 완전한 RPMI 매체에 두 개의 OT-I TCR TG RAG-1−/− 마우스에서 두 개의 비장을 수확합니다.
- 70 μm 필터로 비장을 으깨서 20 mL의 RPMI로 채워진 50 mL 튜브에 보관하고, 주사기의 뒷면을 사용하여 지방만 필터에 남습니다.
- 4°C에서 5분 동안 220 x g에서 원심분리기를 통과한다. 상급제는 버리십시오.
- 이전 원심분리 단계에서 비장 펠릿에 적혈구 (RBC) 용해 완충액 1 mL을 추가하고 혼합물을 1 분 동안 피펫합니다.
- 최대 10mL의 RPMI를 추가하여 솔루션을 중화합니다.
- 220 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기. 상급을 버리고 RPMI의 10 mL에서 다시 일시 중단하십시오.
- 계산을 위해 작은 별칭을 가져 가라. 나머지 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 220 x g에서.
- 계산된 모든 백만 개의 세포에 대해, 시판되는 자기 분리 시스템 버퍼(Mojo buffer 또는 이와 유사한 완충제)의 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- 5.1.8 단계에서 펠릿 세포의 1 mL마다 부피 100 μL의 항체 칵테일을 준비합니다. 항체 칵테일에는 비오틴 항 CD4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, TCR γ/δ 및 CD44가 포함됩니다.
- 이 칵테일을 1 mL 펠릿 셀에 넣고 15 분 동안 얼음에 보관하십시오.
- 1mL 재부유 펠릿 비장 세포에 첨가된 항체 칵테일의 100 μL마다 자기(스트렙타비딘) 비드 100 μL을 추가합니다. 15분 동안 얼음에 보관하십시오.
- 시판시 사용 가능한 자기 분리 시스템 버퍼 7mL를 추가합니다. 지금, 신선한 튜브에 혼합물의 약 3-4 mL의 알리쿼트. 잘 섞어서 자석에 5분 동안 고정시다.
- 액체 (CD8 + 세포 포함)를 얼음에 신선한 튜브에 장식합니다. 이제, 5.1.12단계로부터 혼합물의 나머지 3-4 mL을 튜브로 그리고 5분 동안 자석에 고정시키고, 액체(CD8+ 세포의 두 번째 배치)를 얼음 위에 보관된 CD8+ 세포의 첫 번째 배치를 포함하는 동일한 튜브에 액체(CD8+ 세포의 두 번째 배치)를 고정한다.
- 종자 공학 부착 섬유 아세포 APC-(MEC) B7. SigOVA)라인은 특정 ovalbumin (OVA)유래, H-2Kb 제한 펩티드 에피토프 OVA257-264 (SIINFEKL)와 함께, 24 웰 플레이트에서 웰 당 75,000 세포에서 37°C, 5%CO2 가미드 인큐베이터에서.
참고: 사용된 부착 섬유아세포는 CCHMC에 있는 에디스 얀센 박사의 실험실에서 받은 선물입니다. 이 라인은 원래 라호야 알레르기 및 면역학 연구소의 스티븐 P. 숀버거 박사의 연구실에서 만들어졌습니다6. - 24 시간 후, HEPES 버퍼, 나트륨 피루바트, L-글루타민 및 높은 포도당으로 시판되는 Iscove의 수정 된 덜베코 배지 (IMDM)로 APC의 단층을 한 번 씻고 0.5 x 106 순진한 OT-I CD8 + 세포를 2mMM의 2mMM에서 추가하십시오. 50 mM β-ME, 2 mL EDTA, 4 mM L-글루타민 및 HEPES 및 10 % FBS로 보충.
- 20 시간 후, 부드럽게 비 부착 OT-I 세포를 수확 (부동 OT-I 세포와 배양 접시에 매체를 수집하고 2 분 동안 191 x g에서 세포를 펠릿하여; 가능한 OT-I 세포를 계산) 공동 배양을 위해 그들을 전송.
- 마우스 CD8 T 셀 분리 키트를 사용하여 자기 세포 분리에 의해 OT-I TCR TG RAG-1−− 마우스의 비장으로부터 CD8+ 세포를 다음과 같이 정화한다:
- B16/F10-OVA 세포를 가진 CD8+ 세포의 공동 배양
- 종자 OT-I-유래 CD8+ 세포는 B16/F10(항원 ovalbumin 결여), 처리되지 않은 B16/F10-OVA, B16/F10-OVA 와 함께 공동 배양에서 1:1(각각 300,000개 세포)의 비율로 1주일 동안 플라보피리돌(25 nM)으로 사전 처리된 DME 를 6주에 잘 처리했습니다. 5%CO2 가습 인큐베이터에서 37°C에서 20시간 동안 미디어를.
- 20시간 후, OT-I-유래 CD8+ 세포를 제거한다(부동 OT-I 유래 CD8+ 세포로 배양 접시내의 배지를 수집함으로써). 부착된 B16/F10-OVA 세포를 1x PBS로 세척합니다.
- 0.05% EDTA에서 부착된 B16/F10-OVA 세포의 세 그룹을 5분 동안 트립신을 함유한 트립신을 트립시니화시켰다.
- 수확한 B16/F10-OVA 세포를 차가운 PBS(0.5% FBS 및 0.05% 나트륨 아지드 포함)에 배양하여 생존용 염료 및 관련 라벨이 부착된 항체(고칠 수 있는 생존성 염색 염료 e780, AF647-접합 마우스 CD8 및 BV421-컨쥬게이트 마우스4)로 배양하여 염색 ).
- 유세포분석에 의한 B16/F10-OVA 세포의 세 그룹의 생존 가능성을 분석한다.
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Representative Results
여기서, 우리는 25 nM에서 플라보피리돌로 치료한 만성 서브치사(도2)에의해 얻어진TE확실히 세포 모델을 확립하기 위한 상세한 계획(도1)을제공한다. 도 3에서,플라보피리돌로 치료한 3일 동안, B16 OVA 세포는 TE의 부분적인 특성을확실히 나타내지만, 1주일의 치료 후, B16/F10 OVA 세포는 RNA Pol II의 CTD에 대한 세린 2 위치에서 의인산화의 심오한 손실을 나타낸다. H3K36me3의 현저한 감소와 함께, 엑슨 경계를 정의하는 데 연루된 히스톤 수정과 도망가는 비밀 전사의 억제제. 결과적으로, TE확실히 세포 모델은 부적절하게 캡및 비-폴리-아데닐화 mRNA의 명백하게 증가된 비율로 중요한 mRNA 처리 결함을나타낸다(도 4A,B). 또한, 주요 염증 반응 경로 유전자 및 FasL 매개 세포 사멸 경로의 특정 억압은 도 5 및 도 6에서볼 수 있다. 인터페론(IFN-α, IFNγ) 및 TNF-α에 대한 부과된 저항성은 STAT1 및 NFθB의 인산화를 자극하고, 사망 수용체 리간드 FasL에 의한 세포 사멸에 대한 내성은 TE에 대한 면역 세포 공격의 세포 독성을크게 감소시킨다. 종양. 이러한 확증 기술은 전사 신장의 만성 섭동이 광범위한 자극 반응 유전자에 미치는 영향의 정도를 테스트하기 위해 설계되었으며, 주어진 마우스 세포주 모델에서 이러한 섭동이 충분한지 여부는 염증 반응 신호 유전자에 있는 기능적인 mRNA의 심각한 지구를 자극합니다, TE의 기본적인 본질을 임상적으로확실히 모방하. 플라보피리돌 치료에 대한 당사의 연구에 기초하여, RNA Pol II CTD의 제2 세린 잔류물(pSER2)에서의 인산화 억제는 전사 신장을 표시하기 때문에 매우 중요하다. 임의의 주어진 마우스 암종 세포주의 치사 용량은 세포주의 성장 및 생존율에 미미한 영향을 미칠 뿐만 아니라 pSER2 수준의 감소를 달성해야 한다. 우리는 일관되게 25 nM 플라보피리돌 치료에 pSER2 및 H3K36me3 수준의 감소를 볼 수 있지만, 그것은 pSTAT1 및 pNFθB 수준 모두의 억압을 보장하지 않습니다 (IFN-α, IFNγ 및 TNF-α 자극에 각각). 각 마우스 암종 세포주 (시간의 기간 동안 다른 실험실에서 배양 된 B16 / F10 OVA 또는 CT26 세포는 약간 변경 된 효과를 가질 수있다) 그들은 JAK1 또는 CCNT1 부분적으로 억제에 플라보 피리돌의 효과를 구출 할 수있다 염증 반응 통로 유전자. 이러한 경우, pSTAT1 및 pNFθB 수준의 역학은 JAK1 또는 CCNT1에 의한 플라보피리돌 중재 효과및 그 구조의 시간성을 이해하기 위해 상이한 시점(5-70분)에서 확인되어야 할 수도 있다. 따라서 이 모델을 설정하려면 JAK1 및/또는 CCNT1을 무너뜨려야 할 수 있습니다.
플라보피리돌 모델이 확립되고 전술한 분석문을 사용하여 특징지어지면, TE가확실히 세포 모델이 세포독성 T 세포(CTL) 공격에 대한 저항성을 부여하는지 테스트하기 위한 탐색적 분석방법을 제공한다. 최적화된 프로토콜에 기초하여, 플라보피리돌은 OVA 발현 세포(DR로부터의 선물)에 선택적 독성을 갖는 활성화된 CD8+ CTL(OVA257-264 에피토프에 특이적)과 함께 배양된 OVA 유전자(B16 OVA)를 안정적으로 과발현하는 B16/F10 세포를 처리하였다. 스티븐 P. Schoenberger의 실험실6)OT-I CTL 매개 종양 용해에 취약 하지 않았다. B16/F10 OVA 세포 (플라보피리돌로 전처리되지 않음)는 이 시스템에서 대규모 세포 사멸을 겪었으며, B16/F10 부모 세포는 OVA 항원을 발현하지 않기 때문에 살아남았습니다(그림7). 만성 플라보피리돌 유도 TE가확실히 생체 내에서도 항종양 면역 공격으로부터 탈출할 수 있는 수단을 수여할 수 있다는 제안된 탐사 분석의 결과로부터 분명하다. 이는 생체내 종양 모델에서 선천적이고 적응적인 항종양 면역 반응을 탈출하는 TE 모델의 성향을확인하기 위해 추가로 시험될 수 있다. 항아시아로 치료는 종양 베어링 마우스에서 생체 내 NK 세포의 활성을 조절하는데 사용될 수 있다. 또한, 면역 체크포인트 요법(항-CTLA4 및 항-PD1)은TE확실히 종양 베어링 마우스에 투여될 수 있다.
전체적으로,TE는 제안된 탐사 분석과 함께 확실히 확증적인 분석실험을 함께 다른 종양 면역 시험 조건의 전체 호스트에 이 TE확실히 세포 모형을 통합하는 의 유용성을 보여줍니다. 이 모형은 종양 세포에 있는 불완전한 전사 신장 및 면역 세포 상호 작용에 그들의 반응에서 유래한 분자 세부사항을 구문 분석하는 것을 도울 수 있습니다.
그림 1: 작업 흐름의 개략적 표현입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: B16 OVA 세포의 세포 성장 특성은 저용량 플라보피리콜로돌로 만성적으로 처리되었다: 발료후 투여일 에서 대조군 및 플라보피리돌 치료 세포 B16 OVA의 생존율(생존성 시약에 의해 측정). 이 그림은 Modur 등에서 수정되었습니다3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: RNA Pol II 및 히스톤 프로파일을 평가하기 위한 확인 분석: 72시간 또는 1주 동안 플라보피리돌로 처리된 B16 OVA 세포에서 표시된 히스톤 및 RNA Pol II 마크의 면역블롯. 이 그림은 Modur 등에서 수정되었습니다3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: mRNA 처리에서 심각한 결함을 평가하기 위한 확인 분석. 의 비율 5′-제한 5′-capped(A)그리고 3′-폴리아데닐화 3′-폴리아데닐화(B)mRNA 농도 표시 된 세포 주에서 rRNA 고갈 후. 오류 막대는 세 가지 기술 복제본을 기반으로 하는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 사이토카인 자극 프로파일을 평가하기 위한 확인 분석. STAT1, pSTAT1, NFθB 및 p NFθB의 면역블롯을 IFN-α, IFNγ 또는 TNF-α로 자극한 전처리된 B16 OVA 세포를 30분 동안 (5 ng/mL)에서 대조군 및 플라보피리돌 전처리된 B16 OVA 세포에 자극하였다. 이 그림은 Modur 등에서 수정되었습니다3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 시험관내에서 FasL 매개 세포 사멸에 대한 내성을 평가하기 위한 확인 분석. 제어 및 플라보피리돌 전처리된 B16 OVA 세포는 생존성 분석에 의해 측정된 24시간 판독에 대해 FasL로 처리하였다. 이 그림은 Modur 등에서 수정되었습니다3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 시험관내 항원 제한 세포 독성 T 세포 매개 공격에TE의 저항성을 평가하는 탐색분석법. 왼쪽: 탐구 분석의 도식 구성표. 오른쪽: OT-I 마우스의 비장으로부터 분리된 활성화된 CD8+ CTL(1:1 비율)과 함께 배양된 B16/F10-OVA 세포의 상대생존율. P: 웰치 2 샘플 t-test. 이 그림은 Modur 등에서 수정되었습니다3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
RNA Pol II 신장 조절은 악성 세포의 이점에 대한 자극 반응유전자 발현을 조절하기 위한 결정적인 지렛대로 대두되고있다 5,7,8. 발기인-근위성 일시 중단을 극복하여 연신장 및 후속 mRNA 생산을 위해서는 P-TEFb9,10,11의키나아제 활성이 요구됩니다. 우리의 모델은 필수 사이클린 의존키나제 CDK9의 억제제인 플라보피리돌(25 nM)을 사용하여TE에서 Pol II 신장 기간 동안 관찰된 결함을 모방합니다. 이전3.
CDK9 키나아제 활성은 오랫동안 Pol II의 대형 소단위의 CTD에서 세린 2 잔기의 인산화에 필수적인 것으로 알려져 있다. 비판적으로, 우리는 B16/F10 OVA에서 CDK9(1주동안 25nM)의 만성 억제를 최적화하는 데 성공했으며, CTD 인산화를 억제하는 것 외에도, 25 nM 플라보피리돌 치료가 적절한 전사 후 를 방지합니다. 예기치 않은 방식으로 mRNA의 수정과 효과적으로 p-TEFb 의존적 생산 신장을 pro-염증 반응 신호 유전자와 같은 긴 유전자를 따라 폐지, 크게 mRNA에서 발현의 그들의 패턴을 변경 단백질 수준. 우리가 아는 한, 문학에 설명된 다른 모델은 효과적으로 동일한 것을 달성합니다.
TE의 확립하기 쉬운, 일반화 가능한 모델은확실히 해부하기 위하여 이용될 수 있고, TE가확실히 면역 매개 세포 공격에 적응하는 TE를 가능하게 하는 전사 및 후생유전학 수정 둘 다. 더욱이, 이 뮤린 모델은 생체 내 성장 분석법3(여기에 프로토콜에 언급되지 않음)에서 플라보피리돌 방출 후 21일 후 총 및 포스포-RNA Pol II 수치의 감소와 같은 TE를확실히유지하며, 이것의 안정성 정도를 시사합니다. 생체 내 추가 실험을 위한 비유전적 모델. 그러나, 주의는 다른 뮤린 라인에 대한 플라보피리돌의 정확한 치사 용량을 최적화하기 위해 취해야한다 (예를 들어, 약 20 nM 플라보피리돌 치료 1 주일 MC38 뮤린 암종 라인에 대한 하부 용량이다; 이 프로토콜에 사용되지 않음), 세포의 변화의 영향 도금 밀도, 배양 조건 및 사이토카인 자극 조건은 상이한 뮤린 라인에 대해 달라질 수 있다. 여기서 설명된 프로토콜은 만성 CDK9 억제에 의한 TE의 생성에중요한것으로 알려진 변수를 확실히 최소화하는 기본 프레임워크를 제공한다. 또한, T47D 및 CAL51과 같은 인간 암종 세포주는 단기 (3 일) 플라보피리돌 치료로 테스트되어 유사한 TE를확실히발생시켜 -LIKE RNA Pol II 프로파일, 플라보피리돌 기반 만성 억제의 유용성을 나타내는 CDK9의 확실히TE를공부하는 모델 인간의 라인을 만드는 전사 신장을 중재 .
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 부분적으로 NCI (CA193549)와 카카얀 코무로프에 CCHMC 연구 혁신 파일럿 상, 국방부 (BC150484) 해군 싱에 대한 상을 지원했다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 암 연구소 또는 국방부의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 기금 모금자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을 하지 않았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
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