A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TE definitely ) in Cancers A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TE^definitely) in Cancers

Étant donné que les cancers TEdeff sont un obstacle important contre l’immunothérapie, notre modèle pharmacologique est un outil avantageux parce qu’il imite convenablement les défauts transcriptionnels et épigénétiques répandus observés dans de tels cancers, et il permet d’étudier ces anomalies non génétiques pour obtenir de nouvelles idées, trouver de nouvelles utilisations pour les médicaments existants, ou trouver de nouvelles stratégies contre ces cancers. Il s’agit d’un modèle facile à établir et généralisable pour étudier les défauts transcriptionnels d’allongement dans les cancers, permettant d’étudier les interactions tumeur-immunitaire à la fois in vitro et in vivo. Cette méthode peut également être appliquée aux lignées de carcinome humain.

Nous l’avons testé sur T47D et CAL51 à court terme, donnant lieu à des caractéristiques similaires de type TEdeff. Le protocole que nous décrivons ici donne un cadre de base pour minimiser les variables connues critiques pour la génération de fonctionnalités de genre TEdeff par inhibition chronique cdk9. Cependant, il faut prendre soin d’optimiser la dose sublethal exacte de flavopiridol pour d’autres lignées murines.

L’impact de la variation de la densité de placage cellulaire, des conditions de culture, des conditions de stimulation de cytokine peut varier pour différentes lignes de murine cellulaire. Commencez par extraire l’ARN polyA-positif de la moitié des échantillons précédemment ribosomal ARN-épuisés utilisant des perles magnétiques d’oligo dT. Resuspendez les perles dans le flacon en vortexant pendant 30 secondes, et transférez 200 microlitres des perles dans un tube.

Ajoutez un volume égal de tampon de liaison et mélangez le contenu. Placez le tube dans un aimant pendant une minute et jetez le surnatant. Ensuite, retirez le tube de l’aimant et réutilisez les perles lavées dans 100 microlitres de tampon liant.

Ajustez le volume de l’échantillon ribosomal appauvri en ARN à 100 microlitres avec tris-HCl de 10 millimolaires au pH 7,5. Ajouter 100 microlitres de tampon liant à l’échantillon. Chauffer le mélange à 65 degrés Celsius pendant deux minutes pour perturber les structures secondaires de l’ARN, puis le placer immédiatement sur la glace.

Ajouter les 200 microlitres d’ARN total aux 100 microlitres de perles lavées et bien mélanger sur un rotor pendant cinq minutes. Placez le tube sur l’aimant pendant une à deux minutes, retirez soigneusement tout supernatant, puis retirez le tube de l’aimant et ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage. Mélangez soigneusement l’échantillon en faisant monter et descendre à quelques reprises, retournez le tube à l’aimant pendant une minute et retirez le surnatant.

Ensuite, utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la pureté et la concentration de l’ARNm isolé lié aux perles. Utilisez la moitié restante de l’échantillon ribosomal appauvri en ARN comme intrant dans les colonnes de protéines A pour immunoprécipifier les ARN plafonnés à cinq premiers avec un anticorps monoclonal de 7 méthylguanosine. Laver la protéine A perles magnétiques du kit RIP selon le protocole du fabricant pour pré-lier l’anticorps aux perles, de l’anticorps de 7 méthylguanosine à la perle suspendue en 100 microlitres de tampon de lavage du kit.

Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes tout en tournant à basse vitesse. Puis centrifugez brièvement les tubes, et mettez-les sur le séparateur magnétique. Retirer et jeter le supernatant, puis retirer les tubes du séparateur magnétique, et resuspendre les perles avec 500 microlitres de tampon de lavage.

Vortex les tubes, les centrifuger brièvement, et les remettre sur le séparateur magnétique, et de nouveau jeter le supernatant. Ensuite, ajoutez 120 nanogrammes d’ARN ribosomal appauvri en ARN aux perles liées aux anticorps ainsi qu’un microlitre d’inhibiteur de la RNase, et incubez le mélange à température ambiante pendant 60 à 90 minutes avec une légère agitation. Après l’incubation, faites tourner l’échantillon à 300 fois g pendant 10 secondes et transférez le supernatant avec l’ARNm non plafonné dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.

Répétez le lavage deux fois de plus avec 100 microlitres de tampon de lavage, et mettre en commun le supernatant collecté. Elute l’ARNm plafonné des perles en ajoutant 300 microlitres de tampon de lyse d’urée préparés selon les instructions manuscrites et en chauffant le mélange à 65 degrés Celsius pendant deux à trois minutes. Mélanger 300 microlitres de l’échantillon émincé avec 300 microlitres de phénol: chloroforme: alcool isoamyle, inverser pour mélanger, et laisser pendant 10 minutes.

Mélanger délicatement l’échantillon à nouveau et la centrifugeuse pendant deux minutes. Pipette soigneusement la couche supérieure à un tube frais, et jeter la couche inférieure. Ajouter 300 microlitres de 2 propanol et 30 microlitres d’acétate de sodium trois molaires à l’échantillon, l’inverser à quelques reprises, et le mettre en moins 20 degrés Celsius pendant 20 heures.

Après l’incubation, centrifuger l’échantillon pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez soigneusement le surnatant et séchez la pastille à température ambiante pendant cinq minutes. Resuspendez la pastille dans de l’eau exempte de nucléase et mesurez la pureté et la concentration de l’ARN à l’l’l’arme spectrophotomètre.

Isoler les cellules CD8 positives selon les instructions manuscrites, puis résuspendre les cellules dans le tampon du système de séparation magnétique disponible dans le commerce. Ajouter 100 microlitres de cocktail d’anticorps pour chaque millilitre de cellules, et incuber les cellules sur la glace pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de perles magnétiques par 100 microlitres de cocktail d’anticorps, et laissez les cellules sur la glace pendant encore 15 minutes.

Après l’incubation, ajouter sept millilitres de tampon de séparation magnétique aux cellules, aliquot trois à quatre millilitres à un tube frais, et placer le tube sur un magnétique pendant cinq minutes. Décanter le liquide avec les cellules CD8-positives à un tube frais sur la glace. Ensuite, ajouter les trois à quatre millilitres restants de cellules aux perles magnétiques, et placer le tube sur l’aimant pendant cinq minutes.

Décanter le deuxième lot de cellules CD8 positives au tube avec le premier lot. Les cellules SAMBOK fibroblastes adhérentes de semence avec la molécule co-stimulante à 75.000 cellules par puits dans les plaques de 24 puits, et les culture dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone humidifié. Après 24 heures, lavez le monocouche APC une fois avec le médium modifié de Dulbecco d’Iscove, et ajoutez 0,5 fois 10 aux six cellules naïves en deux millilitres de milieu complétées selon les instructions manuscrites.

Culture des cellules pendant 20 heures, puis récoltez doucement les cellules OT-I nonherent en recueillant les médias et en pelletant les cellules à 191 fois g pendant deux minutes. Comptez les cellules et ensemencez-les à un rapport un pour un dans une co-culture avec les cellules B16/F10, B16/F10-OVA non traitées et B16/F10-OVA prétraitées avec du flavopiridol. Culture des cellules pendant 20 heures dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius et de dioxyde de carbone, puis enlever les cellules OT-I CD8 positives, et laver les cellules Adhérentes B16/F10-OVA dans PBS.

Essayez les trois groupes de cellules attachées à 05%EDTA avec de la trypsine pendant cinq minutes, puis pelletez-les à 191 fois g pendant cinq minutes. Incuber les cellules B16/F10-OVA récoltées dans des PBS froids avec colorant de viabilité et anticorps étiquetés pertinents, puis analyser la viabilité avec la cytométrie de flux. Ce protocole a été employé pour établir un modèle défectueux d’allongement de transcription qui montre une perte profonde de phosphorylation à la position de sérine 2 sur le domaine de répétition de C-terminal de polymésase II d’ARN et une diminution significative de H3K36me3, qui est impliqué dans la définition des limites d’exon et inhibant des transcriptions cryptiques emballements.

Les cellules présentent des défauts critiques de traitement de l’ARNm avec des ratios croissants d’ARNM mal plafonnés et non polyadéthylés. En outre, la répression spécifique des gènes clés de voie inflammatoire de réponse et de la mort cellulaire FasL- médiateurs sont observées dans ce modèle cellulaire. Un essai exploratoire pour tester si le modèle cellulaire confère la résistance à l’attaque cytotoxique de T-cellule montre que les défauts chroniques d’allongement de transcription flavopiridol-induits peuvent accorder un moyen d’échapper à une attaque immunisée anti-tumeur.

Les cellules B16/F10 traitées en flavopiridol qui surexpriment le gène OVA n’étaient pas sensibles aux lymphocytes T cytotoxiques CD8 positifs, qui ont une toxicité sélective pour les cellules exprimant l’OVA. Les cellules non prétraitées avec le flavopiridol ont subi la mort cellulaire principale, alors que les parents B16/F10 qui n’expriment pas l’antigène d’OVA ont survécu. Il est important de se rappeler que la réduction du niveau de triméthylation de la phosphoserine 2 et du H3K36 sur le traitement flavopiridol de 25 nanomolaires ne garantit pas une réduction du niveau de phopsho-STAT1 et de phospho-NF-kappaB.

Chaque lignée de carcinome de souris est unique, et JAK1 et CCNT1 peuvent sauver l’effet du flavopiridol. En outre, ce modèle peut être utilisé in vivo pour surveiller la résistance offerte par les cancers TEdeff contre les réponses immunitaires antitumorales innées et adaptatives. Par exemple, des traitements anti-asialo pourraient être utilisés pour réguler l’activité des cellules NK, et la thérapie de point de contrôle immunitaire pourrait être administrée aux souris porteuses de tumeurs TEdeff.

Le lymphocyte tumeur-infiltration, ou TIL, charge est un indicateur du succès dans l’immunothérapie. Notre modèle nous a permis d’explorer l’étendue de l’activation et de l’épuisement des TIL dans le microenvironnement du cancer TEdeff avant et après l’immunothérapie.