Summary
Tau é uma proteína neuronal presente tanto no citoplasma, onde liga microtúbulos, e no núcleo, onde exerce funções não convencionais, incluindo a modulação dos genes relacionados à doença de Alzheimer. Aqui, descrevemos um método para investigar a função do tau nuclear, excluindo quaisquer interferências provenientes de Tau citoplasmamic.
Abstract
Tau é uma proteína de ligação microtúnuo expressa nos neurônios e sua principal função conhecida está relacionada à manutenção da estabilidade citosquelética. No entanto, evidências recentes indicaram que Tau também está presente em outros compartimentos subcelulares, incluindo o núcleo onde está implicado na proteção do DNA, na transcrição do rRNA, na mobilidade de retrotransposons e na organização estrutural do Nucléolo. Recentemente, demonstramos que tau nuclear está envolvido na expressão do gene VGluT1, sugerindo um mecanismo molecular que poderia explicar o aumento patológico da liberação de glutamato nos estágios iniciais da doença de Alzheimer. Até recentemente, o envolvimento do tau nuclear na modulação da expressão de genes-alvo tem sido relativamente incerto e ambíguo devido a limitações técnicas que impediram a exclusão da contribuição de Tau citoplasmic ou o efeito de outros fatores a jusante não relacionados ao nuclear Tau. Para superar essa incerteza, desenvolvemos um método para estudar a expressão de genes-alvo especificamente modulados pela proteína tau nuclear. Nós empregamos um protocolo que acople o uso de sinais da localização e do fration subcellular, permitindo a exclusão da interferência das moléculas citoplasmômicas de Tau. Mais notavelmente, o protocolo é fácil e é composto por métodos clássicos e confiáveis que são amplamente aplicáveis para estudar a função nuclear de Tau em outros tipos de células e condições celulares.
Introduction
As funções da proteína Tau no núcleo têm atraído interesse significativo nos últimos anos, uma vez que tem se mostrado intimamente associada com os ácidos nucleicos1,2,3,4,5,6. Na verdade, um estudo recente em todo o genoma demonstrou que Tau liga seqüências de DNA genic e intergênicos in vivo7. Um papel na organização nucleolar foi sugerido8,9,10,11. Além disso, Tau foi proposto para se envolver na proteção do DNA contra o estresse oxidativo e hipertermiômico5,10,12,13, enquanto tau mutado tem sido associada à instabilidade cromossômica e aneuploide14,15,16.
Até agora, os desafios em estudar as funções de Tau no compartimento nuclear permaneceram quase sem solução devido às dificuldades em dissecar a contribuição específica de Tau nuclear da contribuição de Tau citoplasmic. Além disso, as funções atribuídas às moléculas tau no compartimento nuclear, até agora, são apenas correlativas porque não têm uma demonstração inequívoca do envolvimento direto das proteínas nucleares Tau. De fato, o envolvimento de Tau na mobilidade de retrotransposons ou na transcrição rRNA ou na proteção do DNA11,12,17,18,19 também pode ser explicado pela contribuição de Tau citoplasmic ou pelo efeito de outros fatores a jusante não relacionados ao nuclear Tau.
Aqui, fornecemos um método que pode resolver este problema explorando um procedimento clássico para isolar o compartimento nuclear combinado com o uso de tau constrói 0N4R marcado com localização nuclear (NLS) ou sinais de exportação nuclear (NES). Esta abordagem elimina as questões complexas relacionadas com possíveis artefatos devido à repercussão das moléculas tau do compartimento citoplasmático. Além disso, as construções Tau-NLS e Tau-NES induzem o enriquecimento ou a exclusão das moléculas tau do compartimento nuclear, respectivamente, fornecendo controles positivos e negativos para o envolvimento de moléculas nucleares tau em uma função específica. O protocolo é tecnicamente fácil e é composto por métodos clássicos e confiáveis que são amplamente aplicáveis ao estudo da função nuclear de Tau em outros tipos de células, diferenciados ou não, como células cancerosas que reativam a expressão tau20,21. Além disso, pode ser aplicado também a outras proteínas que estão presentes tanto no citoplasma quanto no núcleo, a fim de dissecar funções biológicas relacionadas a diferentes compartimentos.
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Protocol
1. Cultura celular
- Células Cultura SH-SY5Y (linha de células neuroblastoma humanas, CRL-2266) em meio completo (o meio modificado eagle de Dulbecco:mistura de nutrientes F12 [DMEM/F-12] complementada com 10% de soro bovino fetal [FBS], 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina). Manter as células em uma incubadora a 37 °C e 5% CO2. Crescer as células em placas de 10 cm e dividir quando confluent.
2. Diferenciação celular
- Para diferenciar as células SH-SY5Y, no dia seguinte ao revestimento, adicione 10 μM ácido retinóico (AR) para completar o meio por 5 dias.
- O sexto dia substitui médio por meio de diferenciação: DMEM/F-12 complementado com 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamina. Não adicione FBS ou antibióticos.
- Crescer as células em meio de diferenciação por 3 dias.
3. Chimeric Constrói Cloning
- Gerar Tau-NLS construir por clonagem por restrição digestão enzimática no quadro no final de 3' de Tau seqüência 0N4R (383aa) o 3xNLS (SV40NLS):5'-CCAAAAAAAAHAGAAGGTAGATCCAtCCAAAAAAGAGAAGGATCCAAAAAAAAGAAGAAGAAGAAAGGTA-3'.
Nota: O 3xNLS no final de 3' de Tau é clonado no plasmid pCMV-Tau para expressão de mamíferos explorando os locais de restrição XhoI e BamHI no local de multiclonagem (MCS). - Gere tau-nes construção por clonagem por restrição enzima digestão no quadro no final de 3' tau seqüência 0N4R (383aa) a seqüência NES: 5'-AGTGAGGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATGGGGACTCGCGTACA-3'.
Nota: O NES no final de 3' de Tau é clonado no plasmid pCMV-Tau para expressão de mamíferos explorando os locais de restrição EcoRI e BamHI no MCS. - Transforme a cepa DH5alpha E.coli com 100 ng de DNA a partir do passo 3.1 ou 3.2 e células de placa em placas LB-Agar com 100 mg/mL ampicilina. Deixe crescer durante a noite a 37 °C.
- Escolha uma única colônia e spike as células em 5 mL de LB com ampicilina. Deixe as células crescerem a 37 °C em agitação durante a noite.
- Extraia plasmid com um miniprep do ADN(tabela dos materiais)e seqüência para verificar as construções.
- Transforme a cepa DH5alpha E. coli com a sequência de construções e células de placa verificadas em placas LB-Agar com ampicilina. Deixe crescer durante a noite a 37 °C.
- Escolha uma única colônia e spike as células em 5 mL de LB com ampicilina. Deixe as células crescerem a 37 °C em agitação por 2 h.
- Coloque as células do passo 3.7 em 200 mL de LB com ampicilina. Deixe crescer durante a noite a 37 °C.
- Pelotas as células a 3.500 x g por 10 min a 4 °C.
- Extrato plasmídeo com um dna maxiprep (Tabela de Materiais).
4. Transfecção celular
- Sementes 400.000 células do passo 1.1 em placas de 6 poços ou 20.000 células em lâminas de câmara de 8 poços. Amostras da placa quatro: células de controle a serem transpartidas com um vetor vazio, células a serem transpartidas com Tau não escaloado, células a serem transpartidas com Tau-NLS e células a serem transpartidas com Tau-NES.
- No dia seguinte à semeadura transfect 400 ng de DNA para cada poço usando os lipídios cationic(Tabela de Materiais)em placas de 6 poços ou 200 ng de DNA para cada poço para slides de câmara de 8 poços, de acordo com as instruções do fabricante.
- Incubar o DNA e os lipídios cationic separadamente em 250 μL (para placas de 6 poços) ou 25 μL (para slides de câmara de 8 poços) de médio sérico reduzido para 5 min em RT. Em seguida, combiná-los para gerar o complexo dna-lipídios e incubar por 20 min.
- Substitua o meio de cultura por 2 mL (para placas de 6 poços) ou 250 μL (para slides de câmara de 8 poços) de meio de cultura completa fresco. Adicione o complexo dna-lipídio s as células e incubar a 37 °C durante a noite.
- Alternativamente, dna transfect com o reagente cationic polietiletilimina (PEI).
- Misture 2 μg de DNA e 6 μL de PEI com 200 μL de meio de cultura completa (para cada poço em placas de 6 poços), ou 1 μg de DNA e 3 μL de PEI com 100 μL de meio de cultura completa (para cada poço em slides de câmara de 8 poços) , vórtice e incubação de 10 min em RT.
- Adicione a mistura às células e adicione 1,8 mL de meio de cultura completa por poço em placas de 6 poços ou 150 μL de meio de cultura completa por poço em lâminas de câmara de 8 poços para alcançar o volume de revestimento.
- Mude o meio no dia seguinte à transfecção e adicione os meios de diferenciação, conforme descrito na etapa 2.2.
5. Imunofluorescência
- Retire o meio de cultura e lave as células com 1x PBS. Corrija células com 100% de gelo frio metanol para 3 min sem tremer. Retire a solução de fixação e lave brevemente com 1x PBS.
- Permeabilize com 0,1% surfactante não-iônico em 1x PBS por 5 min à temperatura ambiente (RT). Resumidamente, lave com 1x PBS, 3 vezes.
- Incubar células com tampão de bloqueio (0,1% Tween 20 e 1% BSA em PBS) por 30 min em RT em um agitador orbital.
- Incubado com anticorpos primários apropriados (por exemplo, anticorpo monoclonal monoclonal anti-Tau13) diluído 1:500 no bloqueio tampão durante a noite em 4 °C em um agitador orbital. Retire a solução de anticorpos e lave, brevemente, com 1x PBS.
- Incubado com anticorpos secundários conjugados ao fluorophore (por exemplo, anticorpos anti-rato de cabra conjugados a Alexa Fluor 633) diluído 1:500 no tampão de bloqueio por 1 h em RT. Remover a solução de anticorpos e lavar brevemente com 1x PBS 3 vezes.
- Para manchar núcleos, incubar com DAPI diluído 1:20,000 em bloqueio tampão por 10 min em RT. Wash com 1x PBS 3 vezes. Monte coverslips em um slide usando antifade montagem médio.
6. Blot ocidental
- Para coletar a pelota da pilha da etapa 4.4, remova o meio, e lave pilhas com PBS. Incubar com 500 μL de 0,1% de trippsina por 4 min a 37 °C. Adicione um volume igual de células médias completas e resuspende.
- Coletar células em um tubo e centrífuga a 500 x g por 5 min. No final da centrifugação remover cuidadosamente o supernatant. Adicione 1 mL de PBS, centrífuga a 500 x g por 5 min e retire cuidadosamente o supernatant. Armazenar pelotas de células no gelo para uso imediato ou congelar a -80 °C para armazenamento a longo prazo.
- Para extratos totais de proteína, incubar a pelota de células por 30 min no gelo em lupa (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glicerol, 1% octylphenoxy poli (etilenoxia) etanol, ramificado(Tabela de Materiais), 10 mM EDTA) complementado com inibidores protease e phosphatase. De acordo com a abundância da pelota, use 50 μL a 100 μL de tampão de lyse.
- Centrífuga o extrato a 16.000 x g por 15 min. Recolher o supernatant e quantificar a concentração de proteína por qualquer ensaio quantificação padrão. Prepare as amostras de proteína para o SDS-PAGE misturando 20 μg de proteínas com 5 μL de 4x Laemmli buffer em um volume total de 20 μL e ferver a 100 °C por 5 min.
Nota: A amostra pode ser armazenada a -20°C.
- Centrífuga o extrato a 16.000 x g por 15 min. Recolher o supernatant e quantificar a concentração de proteína por qualquer ensaio quantificação padrão. Prepare as amostras de proteína para o SDS-PAGE misturando 20 μg de proteínas com 5 μL de 4x Laemmli buffer em um volume total de 20 μL e ferver a 100 °C por 5 min.
- Para fracionamentos subcelulares, resuspenda as células do passo 6.2 em meio completo e coleta 1 x 106 células por cada amostra. Centrífuga a 500 x g por 10 min para obter pelotas celulares para as seguintes etapas.
- Para isolar compartimentos subcelulares, fracionado de acordo com as especificações do kit. Para isolar cada fração, incubar a pelota celular do passo 6.4 com o amortecedor correspondente, centrífuga, recolher o supernatant e adicionar o próximo buffer para a pelota, conforme descrito em 6,4.1.1-6.4.1.5. Adicione em ordem o amortecedor de extração citoplasmática, o amortecedor de extração de membrana, o amortecedor de extração nuclear, o amortecedor de extração nuclear complementado com 5 mM CaCl2 e 3 U/μL microcococtal nuclease e tampão de extração citoesquelética.
Nota: Todos os buffers devem ser complementados com inibidores da protease. Escala de volumes tampão de acordo com o volume da pelota celular.- Para isolar a fração citossólica, as pelotas de células incubadas em 100 μL de tampão de extração citoplasmática gelada complementada com inibidores protease a 4 °C com mistura suave por 10 min. Centrífuga a 500 x g a 4 °C por 5 min e transferem o supernatant para tubos pré-refrigerados.
- Adicione 100 μL de tampão de extração de membrana gelada complementado com inibidores da protease à pelota do passo 6.4.1.1, e incubar a 4 °C com mistura suave por 10 min. Centrífuga a 3.000 x g a 4 °C por 5 min e coletar o supernatant.
- Para a fração nuclear solúvel, adicione 50 μL de buffer de extração nuclear complementado com inibidores da protease à pelota do passo 6.4.1.2 e vórtice. Incubar a 4 °C por 30 min, centrífuga a 5.000 x g a 4 °C por 5 min, e recolher o supernatant.
- Para a fração nuclear insolúvel, adicione 50 μL de buffer de extração nuclear complementado com inibidores da protease, CaCl2 e nuclease microcócica à pelota do passo 6.4.1.3 e vórtice. Incubar a 37 °C para 5 min, e depois vórtice novamente. Centrífuga a 16.000 x g em RT por 5 min e recolher o supernatant.
- Para a fração citoesquelética, adicione 50 μL de tampão de extração citoesquelética complementado com inibidores da protease à pelota do passo 6.4.1.4 e vórtice. Incubar 10 min em RT. Centrífuga o tubo em 16.000 x g por 5 min, recolher o supernatant e descartar a pelota.
Nota: Volumes de buffer de escala de acordo com o volume celular, como indicado no protocolo do kit. Consulte o protocolo do kit para mais detalhes sobre incubação e tempo de centrífuga e temperatura22,23,24,25,26,27,28,29. Alternativamente, use todos os métodos padrão30 que, usando detergentes e aumentando a força iônica e a velocidade da centrífuga, separam o citosólico, o membrana-limite, o citoskeletal e as frações nucleares. Separe a fração nuclear solúvel e a fração nuclear insolúvel explorando amortecedores padrão da extração nuclear. A amostra pode ser armazenada a -20°C.
- Para o SDS-PAGE, adicione 7 μL de buffer 4x Laemmli a 20 μL de frações subcelulares obtidas a partir dos passos 6,4,1,1-6,4,1,5, ferva a 100 °C por 5 min.
- Para isolar compartimentos subcelulares, fracionado de acordo com as especificações do kit. Para isolar cada fração, incubar a pelota celular do passo 6.4 com o amortecedor correspondente, centrífuga, recolher o supernatant e adicionar o próximo buffer para a pelota, conforme descrito em 6,4.1.1-6.4.1.5. Adicione em ordem o amortecedor de extração citoplasmática, o amortecedor de extração de membrana, o amortecedor de extração nuclear, o amortecedor de extração nuclear complementado com 5 mM CaCl2 e 3 U/μL microcococtal nuclease e tampão de extração citoesquelética.
- Carregue amostras em um gel de acrilamida e realize eletroforese em uma tensão constante de 120 V. Transfira proteínas para membrana nitrocelulose a 250 mA por 90 min.
- Verifique a eletroforese de gel de proteína adequada e aborrecto bem sucedido incubando a membrana por 5 min na solução de coloração Ponceau. Lave a membrana em água destilada até que o fundo esteja limpo. Retire a mancha continuando a lavar com Tris soline amortecida com Tween 20 (TBST) por 10 min em uma coqueteleira.
- Incubar a membrana com solução de bloqueio (5% de leite em TBST) para 1 h no RT em shaker. Lave 3 vezes com TBST por 5 min.
- Hibridize a membrana com o anticorpo primário na solução de bloqueio (1% de leite no TBST) durante a noite a 4 °C. Lave 3 vezes com TBST por 5 min.
- Hibridize a membrana com o anticorpo secundário sARRh-conjugado na solução de bloqueio para 1 h no RT. Lave 3 vezes com TBST por 5 min.
- Detecte a banda de proteínausando chemiluminescence. Quantifique a intensidade das bandas western blot por ImageJ. Normalize a expressão proteica no produto de um gene de limpeza: histona H2B para a fração solúvel e insolúvel nuclear, GAPDH para a fração citoplasmaee e extratos totais.
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Representative Results
A estratégia utilizada para dissecar o impacto do tau nuclear na expressão gênica evitando a contribuição de proteínas tau citoplasmasais tem sido retratada na Figura 1. Resumidamente, as proteínas Tau marcadas com NLS ou NES são acumuladas ou excluídas do compartimento nuclear, respectivamente. O efeito funcional deste desequilíbrio é a alteração da expressão gênica medida como produto do gene VGluT1.
Seguindo a descrição do protocolo, as células SH-SY5Y foram tratadas com RA por 5 dias e, em seguida, com BDNF por 3 dias, a fim de obter células semelhantes a neurônios pós-mitocôtas (Figura 2). Na ausência de RA e BDNF, células SH-SY5Y indiferenciadas assumem uma morfologia redonda e formam grupos celulares. Como esperado, iniciando o protocolo de diferenciação, aglomerados descontrair e as células se espalham neurites; no final da diferenciação, as células são uniformemente distribuídas e interconectadas através de uma rede de neuritos ramificados.
No dia seguinte à semeadura, as células foram transfeccionadas com plasmídeos Tau-NLS ou Tau-NES (seção 4.2) com lipídios cationic. Para células que expressam construções Tau-NLS ou Tau-NES, a localização subcelular tau pode ser detectada por imunofluorescência com anticorpos anti-Tau. Dependendo da eficiência da transfecção, as células exibem uma forte coloração nuclear fundindo-se com o sinal DAPI ou uma coloração citoplasmática com núcleos vazios se forem transfeccionadas com sucesso com Tau-NLS ou Tau-NES, respectivamente (Figura 3). A falta desses sinais específicos indica uma transfecção ineficiente.
Para analisar as proteínas enriquecidas em diferentes compartimentos subcelulares, as células foram coletadas e contadas para processar quantidades iguais de células por amostra. Qualquer método de fracionamento padrão que explora o aumento da força detergente e iônica e o aumento da velocidade de centrífuga pode ser usado para separar os compartimentos celulares uns dos outros e, assim, isolar o citosolico, o limite de membrana, o citoskeletal e as frações nucleares.
Uma vez que os núcleos foram isolados, a fração solúvel nuclear e a fração ligada à cromatina foram separadas adicionando 3 U/μL de nuclease micrococócica e 5 mM CaCl2.
Para a análise ocidental da mancha, os volumes iguais de frações citoplasmic e da membrana e os meio volumes das outras frações foram carregados em um gel da acrilamida do precast do gradiente, para corrigir para a quantidade diferente de amortecedor adicionada em cada etapa.
Para verificar a separação eficiente de diferentes frações, a mancha ocidental explorando os seguintes anticorpos foi realizada: anti-GADPH (presente em todas as frações, exceto o citoesqueleto e particularmente enriquecido na fração citoplasma); anti-actina (particularmente enriquecida na fração citosquelética); anti-tubulina (particularmente enriquecida em frações citoplasmaeeele e citosqueléticas); anti-H2B (enriquecido nas frações nucleares) (Figura 4).
Um enriquecimento desses marcadores em diferentes frações subcelulares indica que o fracionamento não é bem executado. Deve-se notar que qualquer protocolo para fracionamento subcelular pode apresentar um 10-15% de contaminação entre frações.
Uma vez verificado o fracionamento bem sucedido da amostra, a mancha ocidental foi realizada para verificar o sinal de Tau no compartimento nuclear e o sinal VGluT1 no extrato total(Figura 5). Enquanto Tau não escalonado é detectável em todas as frações, Tau-NLS é fortemente enriquecido no compartimento nuclear e é pouco detectável na fração citoplasmana. Pelo contrário, Tau-NES é enriquecido na fração citoplasmaee e é menos detectável na fração nuclear. A presença de uma pequena quantidade de Tau-NES na fração nuclear solúvel tem que ser esperada desde que, como o Tau endógeno, é translocado no núcleo e uma vez no compartimento nuclear o sinal nuclear da exportação permite sua translocação ao cytoplasm. A detecção de um enriquecimento diferente para essas duas proteínas de fusão pode indicar um problema na eficiência da transfecção ou na clonagem de construções ou em fracionamento.
A análise quantitativa da mancha ocidental pode ser feita usando ImageJ. Os valores são normalizados para o gene da limpeza específico para cada fração (GAPDH para fração citoplasmana; histona H2B para frações nucleares e com cromatinas solúveis).
O gráfico na Figura 5B relata a proporção de Tau na fração nuclear solúvel e fração citoplasmapara destacar que Tau-NLS é altamente enriquecido na fração nuclear solúvel (SNF), enquanto Tau-NES é diminuída. Além disso, tau-NLS é enriquecido na fração cromatina-bound (CBF) no que diz respeito à fração citoplasma (CF), enquanto Tau-NES é diminuída. SNF/CF = 1 e CBF/CF = 1 correspondem à relação Tau nas células controle. O Tau endógeno é fracamente detectável em todas as frações, como esperado. O gráfico na Figura 5C relata a quantificação da expressão VGluT1 nos extratos totais de amostras expressando diferentes quantidades de Tau nuclear. Nas células que expressam Tau-NES, a expressão de VGluT1 é comparável à expressão de base nas células controle. Pelo contrário, nas células que expressam Tau ou Tau-NLS não escalonados, a expressão de VGluT1 é mais do que duplicada.
Figura 1: Representação gráfica da estratégia usada para permitir um acúmulo nuclear ou citoplasmicde Tau. Tau-NLS é acumulado no compartimento nuclear, enquanto Tau-NES é excluído. A leitura experimental é a modulação da expressão VGluT1. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Cultura celular representativa indiferenciada e diferenciada. Imagem de SH-SY5Y indiferenciado (à esquerda), células diferenciadas por RA (meio) e diferenciadas por RA e BDNF (direita). Barra de escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Imagem representativa do enriquecimento subcelular tau por imunofluorescência. Imagem de células não transviadas ou expressando construções não escalonadas de Tau, Tau-NES ou Tau-NLS. O sinal tau foi obtido por imunofluorescência (vermelho), o sinal de núcleos foi obtido pela coloração DAPI (azul), imagens fundidas são relatadas. Barra de escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Detecção representativa de proteínas enriquecidas em frações subcelulares pela mancha ocidental. Mancha ocidental de frações subcelulares das células SH-SY5Y. CF = fração citoplasmana; MF = fração de membrana; SNF = fração nuclear solúvel; CBF = fração de cromatina; CKF = fração citoesquelética. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Detecção representativa de proteínas nucleares Tau e VGluT1. (A)Mancha ocidental da proteína de Tau detectada nas frações nucleares e citoplasmais. (B) O gráfico relata a proporção de Tau nas frações nucleares e fração citoplasma. Os valores foram normalizados no endogéneo Tau. SNF/CF = 1 e CBF/CF = 1 corresponde à proporção endogênea tau nas células controle. (C)Mancha ocidental da proteína VGluT1. (D)O gráfico relata a quantificação da expressão VGluT1 nos extratos totais de amostras expressando diferentes quantidades de Tau nuclear. Kruskal-Wallis ANOVA e Mann-Whitney testem; p < 0.001, **** p < 0.0001, n.s. p > 0.05. Todos os resultados são mostrados como média ± SEM de pelo menos três experimentos independentes. Este número representativo foi modificado a partir de Siano et al.31. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Descrevemos um método para medir o impacto da proteína tau nuclear na expressão gênica. Com este protocolo, a contribuição do tau citoplasmic é fortemente limitada. Os passos críticos deste protocolo são os seguintes: a diferenciação das células neuroblastoma humana SH-SY5Y, o fracionamento subcelular e a localização da proteína Tau no compartimento nuclear.
Primeiro, como mostrado na seção de resultados representativos, a diferenciação das células SH-SY5Y, adicionando RA e BDNF é crucial para obter uma boa preparação de células neuronais na cultura. A densidade das células semeadas é particularmente importante, uma vez que uma menor densidade pode afetar a proliferação celular. Além disso, para experimentos que precisam de um elevado número de células, como fracionamento celular e mancha ocidental, é importante notar que a etapa de diferenciação da BDNF bloqueia a proliferação celular para permitir a diferenciação terminal, limitando assim o número de células na cultura. Protocolos alternativos de diferenciação usam apenas RA ou NGF em vez de BDNF. No entanto, ao adicionar BDNF após RA permite atingir uma melhor diferenciação morfológica32,33, NGF induz uma vegetação mais fraca neurite em células SH-SY5Y34. Além disso, tem sido amplamente demonstrado que a combinação de RA e BDNF permite obter uma população neuronal homogênea com expressão de marcadores neuronais e diminuição da proliferação35. Por esta razão, o protocolo de diferenciação explorado aqui combina RA e BDNF.
No entanto, o procedimento relatado para dissecar o papel de Tau em diferentes compartimentos subcelulares pode ser usado também para células indiferenciadas ou para diferentes tipos de células.
O fracionamento subcelular é um passo muito crítico e é crucial ter material inicial suficiente: um kit comercial requer apenas 1 x 106 células, enquanto outros procedimentos podem precisar de uma quantidade inicial muito maior. Além disso, o uso de um kit com buffers padrão e etapas garante a reprodutibilidade do experimento que é inevitável e essencial. No entanto, uma vez que a composição dos amortecedores é muitas vezes proprietária, eles podem conter detergentes que podem alterar a função da proteína de interesse e pode ser difícil otimizar o isolamento das frações. Além disso, mesmo nas melhores condições, pode haver uma contaminação de 10-15% entre frações. Um rendimento pobre de cada fração poderia ser superado aumentando o tempo de incubação em amortecedores de extração de frações específicas.
Uma vez que as funções do tau nuclear ganharam interesse significativo nos últimos anos, é particularmente importante fornecer um método confiável para dissecar a função de Tau em diferentes compartimentos celulares. O acoplamento do fracionamento subcelular, com a expressão de tau constrói especificamente dirigido ou excluído do núcleo, permite que um ajuste ça finamente a quantidade de Tau em compartimentos diferentes.
Um passo crítico nesta parte do protocolo é a clonagem de Tau marcada com sinal de localização nuclear ou com o sinal de exportação nuclear. A eficiência da SNL é garantida pela presença de uma sequência de consenso 3XNLS do vírus SV40. A translocação nuclear da proteína pode ser facilmente verificada pela imunofluorescência, e a falta de sinal no núcleo pode ser devido a uma clonagem incorreta ou a uma transfecção ineficiente. Pelo contrário, a exportação nuclear é garantida pela sequência de consenso do NES. Neste caso, a imunofluorescência permite a verificação da exportação de Tau do núcleo. No entanto, um sinal nuclear fraco não deve ser excluído desde que a proteína Tau-NES entra no núcleo e, em seguida, devido à seqüência NES, é exportado para o citosol.
Até agora, a função do tau nuclear foi estudada somente pelas aproximações correlativas que não asseguram sua participação direta. O protocolo aqui descrito, fornecer a primeira abordagem que permite discriminar claramente a função específica de Tau no compartimento nuclear. Como demonstrado anteriormente, o tau endógeno não afeta os resultados obtidos por este protocolo. Na verdade, o mesmo experimento realizado em células não neuronais que não expressam Tau endógeno, leva à expressão alterada VGluT1. Aplicamos este protocolo para estudar a expressão de genes relacionados à doença31. De qualquer forma, ele poderia ser explorado também para investigar outras funções nucleares tau, como o envolvimento em danos ao DNA, a interação com cofatores nucleares ou com a cromatina.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por doações da Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10,000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10,000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15,000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5,000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH = 8, 0.5 M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1,000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
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