Ici, nous décrivons une méthode pour induire la méningite méningococcique par une voie intracisternal d'infection chez les souris adultes. Nous présentons un protocole étape par étape de l'infection méningococcique de la préparation de l'inoculum à l'infection intracisternal ; enregistrez ensuite la survie animale et évaluez les charges bactériennes dans les tissus murines.
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Article de méthode
Induire la méningite méningococcique Sérogroupe C chez les souris par l'intermédiaire de la livraison intracisternal
Dans cet article
Résumé
Résumé
Neisseria meningitidis (méningocoque) est un micro-organisme à portée étroite, mondialement reconnu comme la principale cause de méningite bactérienne. Le méningocoque est un colonisateur transitoire du nasopharynx humain d'environ 10% de sujet sain. Dans des circonstances particulières, il acquiert une capacité invasive de pénétrer la barrière muqueuse et envahit la circulation sanguine causant la septicémie. Dans le dernier cas, la septicémie fulminante pourrait survenir même sans le développement conséquent de la méningite. Inversement, les bactéries pourraient mal se multiplier dans la circulation sanguine, traverser la barrière hémato-encéphalique, atteindre le système nerveux central, conduisant à une méningite fulminante. Les modèles murins de la méningite bactérienne représentent un outil utile pour étudier les interactions hôte-pathogène et pour analyser les mécanismes pathogétiques responsables de cette maladie mortelle. Bien que plusieurs systèmes modèles expérimentaux aient été évalués au cours des dernières décennies, aucun d'entre eux n'a été en mesure de reproduire les événements pathologiques caractéristiques de la méningococcie. Dans ce protocole expérimental, nous décrivons une procédure détaillée pour l'induction de la méningite méningococcique dans un modèle de souris basé sur l'inoculation intracisternal des bactéries. Les signes particuliers de la méningite humaine ont été enregistrés dans l'hôte murine par l'évaluation des paramètres cliniques (par exemple, température, poids corporel), évaluation du taux de survie, analyse microbiologique et examen histologique des lésions cérébrales. Lors de l'utilisation de l'inoculum intracisternal (i.cist.), les méningocoques complètent la livraison directement dans la cisternamagna, conduisant à une réplication méningococcique très efficace dans le tissu cérébral. Une augmentation de 1 000 fois du nombre viable de bactéries est observée dans environ 18 h. En outre, les méningocoques sont également trouvés dans la rate, et le foie des souris infectées, suggérant que le foie peut représenter un organe cible pour la réplication du méningocoque.
Introduction
Neisseria meningitidis est un Gram négatif - proteobacterium limité à l'hôte humain, bien connu pour être l'une des causes les plus courantes de méningite et de septicémie dans la population humaine à travers le monde. Il colonise les voies respiratoires supérieures (nez et gorge) des porteurs sains et asymptomatiques (2-30% de la population), mais la bactérie échappe parfois à diverses défenses immunitaires de l'hôte et se propage de la circulation sanguine au cerveau provoquant un local incontrôlé l'inflammation, connue sous le nom de méningite à méningocoques. Une combinaison de facteurs d'hôte et de bactéries semble contribuer à la transition du comportem....
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Protocole
Ce protocole a été mis en œ]s pour minimiser la souffrance animale et réduire le nombre de souris conformément à la directive du Conseil des Communautés européennes du 24 novembre 1986 (86/609/CEE). Les expériences in vivo rapportées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d'éthique des soins et de l'utilisation des animaux (Prot. numéro 2, 14 décembre 2012) et le ministère italien de la Santé (numéro 0000094-A-03/01/2013). Toutes les procédures doivent être effectuées à l'intérieur du Cabinet de biosécurité 2 (BSC2) dans une pièce BSL2, et les déchets infectés potentiels doivent être éliminés dans des conteneurs dédiés.
1. Infectio....
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Résultats
Survie des souris infectées par n. meningitidis de type sauvage et souches mutantes isogéniques.
Les souches Neisseria meningitidis utilisées dans ces résultats représentatifs sont la souche de référence du sérogroupe C 93/4286 (ET-37) et son mutant isogénique 93/4286CssA obtenu par inactivation insertionnelle du gène cssA, codage pour l'UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase, qui cartographie dans la synthèse capsule locus25. Pour évaluer le de.......
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Discussion
Dans cette étude, nous décrivons un protocole expérimental pour induire la méningite méningococcique chez les souris adultes par i.cist. l'inoculation des bactéries méningococciques. À notre connaissance, aucun autre modèle de méningite à méningocoque n'a été développé chez des souris de laboratoire infectées par i.cist. itinéraire; dans le passé, cette façon a été explorée pour fournir des modèles de méningite à méningocoques chez le rat31 et le lapin32. Il est bien connu .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Les études ont été soutenues en partie par PRIN 2012 [numéro de subvention 2012WJSX8K]: "Host-microbe interaction models in mucosal infections: development of new therapeutic strategies" et par PRIN 2017 [2017SFBFER]: "Une approche intégrée pour lutter contre l'interaction entre les l'adaptation, les conditions stressantes et la résistance aux antimicrobiens des pathogènes difficiles ».
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1,8 Jupe Cryovial Avec filetage externe | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL Polypropylène Tube Conique | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| Pince Adson | F.S.T. | 11006-12 | |
| Thermomètre d’alarme | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Seringue fine | BD | 320837 | U-100 Insuline |
| BD Seringue Plastipak 1 mL 25 G 5/8 pouce | BD | 300014 | 05 mm x 16 mm |
| Seringue BD Plastipak 5 mL | BD | 308062 | 07 mm x 30 mm |
| BIOHAZARD AURA B ARMOIRE VERTICALE À FLUX LAMINAIRE | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| Eppendorf | Modèle #6131 | ||
| Bouteille D | Tecniplast | D | Gradué jusqu’à : 400 mL, Volume total 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm |
| C150 CO2 Liant d’incubateur | 9040-0078 | ||
| Corps de cage Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3, Surface au sol 370 cm2 |
| cellulaire Boîte de Pétri avec couvercle | Thermo Scientific | 150288 | Volume de travail : 5 mL |
| Centrifugeuse | Eppendorf | Microcentrifugeuse 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| hydrogénophosphate dipotassique trihydraté | Carlo erba | 471767 | |
| hydrophosphate di-sodique anhydre ACS-pour analyse | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Granulés alimentaires pour animaux |
| Dumont Hp Pince à épiler 5 Acier inoxydable | F.S.T. de DUMONT | AGT5034 | 0,10 x 0,06 mm2 pointe |
| Balance électronique | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200 g, d = 0,01 g, T = -1200 g |
| Eppendorf Microcentrifugeuse tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycine | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| Ciseaux Bonn extra fins | F.S.T. | 14084-08 | Filtre supérieur en acier inoxydable |
| (mini-isolateur), H-Temp avec pinces de verrouillage | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC base de gélose | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Pince 1 x2 dents | F.S.T. | 11028-15 | |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 L |
| Pince Graefe | F.S.T. | 11052-10 | Dentelé Largeur de l’embout : 0,8 mm |
| Couvercle intérieur | Tecniplast | 1264C116 | |
| Solution de fer dextran | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Kétamine | Intervet | ||
| Armoire de sécurité microbiologique BH-EN et BHG Classe II | Plus rapide | BH-EN 2004 | |
| Tubes de microcentrifugation 1,5 mL ; | MARQUE | PP780751 | bouchon à vis PP, grad |
| Pince de manipulation de souris | F.S.T. | 11035-20 | Caoutchouc dentelé ; Surface de préhension : 15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| Gants en latex naturel | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90 x 14,2 mm2 |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20 &mu ; L |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200 &mu ; LL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1 000 &mu ; L |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Chlorure de potassium | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 g |
| de dihydrogénophosphate de potassium | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| PS Pince jetable | VWR | 232-0191 | |
| Séparateur amovible | Tecniplast | 1264C812 | |
| Tubes en polypropylène à fond rond | Falcon | 352063 | 5 mL |
| Chlorure de sodium | MOLEKULA | 41272436 | |
| Retenue en acier inoxydable et Feuille filtrante en polyester | Tecniplast | 1264C | |
| Pince à motif standard | F.S.T. | 11000-12 | |
| Ciseaux de ténotomie Stevens | F.S.T. | 14066-11 | |
| Ciseaux chirurgicaux en acier inoxydable - ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | |
| Gants jetables en nitrile Stainless Touch N Tuff | Ansell | 92-500 | |
| Congélateur ultra basse température (ULT) | Haier | DW-86L288 | Volume = 288 L |
| Ciseaux Wagner | F.S.T. | 14070-12 | Acier inoxydable |
| Xylazine | Intervet |
Références
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al.
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Réimpressions et autorisations
