Summary
Her beskriver vi en metode for å indusere meningokokk meningitt gjennom en intracisternal ruten av infeksjon i voksen mus. Vi presenterer en trinnvis protokoll for meningokokkinfeksjon fra utarbeidelse av inokulum til intracisternal infeksjon; deretter registrere dyret overlevelse og evaluere bakteriell belastninger i murine vev.
Abstract
Neisseria meningitidis (meningokokker) er en smal-Host-Range mikroorganismen, globalt anerkjent som den ledende årsaken til bakteriell meningitt. Meningokokker er en forbigående colonizer av menneskelig nasopharynx på ca 10% av sunne faget. Spesielt forhold, får den en invasiv evne til å trenge gjennom slimhinnene barriere og invaderer blodet forårsaker septicaemia. I det siste tilfellet, kan Fulminant sepsis oppstå selv uten påfølgende utvikling av hjernehinnebetennelse. Omvendt, bakterier kan dårlig formere seg i blodet, krysse blod hjerne barrieren, nå sentralnervesystemet, som fører til Fulminant hjernehinnebetennelse. Den murine modeller av bakteriell meningitt representerer et nyttig verktøy for å undersøke Host-patogen interaksjoner og å analysere pathogenetic mekanismer ansvarlig for denne dødelige sykdommen. Selv om flere eksperimentelle modellsystemer har blitt evaluert de siste ti årene, ingen av disse var i stand til å reprodusere de karakteristiske patologiske hendelsene i meningokokksykdom. I denne eksperimentelle protokollen, beskriver vi en detaljert prosedyre for induksjon av meningokokk hjernehinnebetennelse i en musemodell basert på intracisternal inoculation av bakterier. Den særegne tegn på menneskelig meningitt ble registrert i murine vert gjennom vurdering av kliniske parametre (f. eks, temperatur, kroppsvekt), evaluering av overlevelse, Mikrobiologisk analyse og histologiske undersøkelse av hjerneskade. Når du bruker intracisternal (i. cist.) inokulum, meningococci komplett levering direkte inn i Cisterna magna, fører til en svært effektiv meningokokk replikering i hjernevevet. En 1 000-fold økning av levedyktig antall bakterier er observert i ca 18 h. Videre er meningococci også funnet i milten, og lever av infiserte mus, noe som tyder på at leveren kan representere et mål organ for meningokokk replikering.
Introduction
Neisseria meningitidis er et gram negativ β-proteobacterium begrenset til den menneskelige vert, kjent for å være en av de vanligste årsakene til hjernehinnebetennelse og sepsis i den menneskelige befolkning over hele verden. Det overvekst den øvre luftveiene (nese og hals) av sunne og asymptomatisk bærere (2-30% av befolkningen), men bakterien noen ganger omgår ulike vert immunforsvar og sprer seg fra blodet til hjernen forårsaker en ukontrollert lokal betennelse, kjent som meningokokk hjernehinnebetennelse. En kombinasjon av vert og bakterielle faktorer ser ut til å bidra til overgangen fra Commensal til invasiv atferd1.
N. meningitidis er spesialisert utelukkende i menneskelig kolonisering og infeksjon. Den har en smal rekke og har derfor begrenset in vivo patogenesen studier på grunn av mangelen på egnede dyremodeller som reproduserer den menneskelige meningokokksykdom. Som et resultat, hadde det ført til grunnleggende hull i forståelsen om patogenesen av septikemi og hjernehinnebetennelse forårsaket av meningokokker. I de siste ti årene tillot utviklingen av mange in vitro-systemer identifikasjonen av flere meningokokk virulens faktorer2,3,4. Selv om disse verdifulle studiene ga viktig innsikt for å forstå rollen til disse faktorene for en vellykket meningokokkinfeksjon, tillot ikke disse modellene vurdering av konsekvensene av bakteriell interaksjon med humoral og mobilnettet immunsystem og enda mindre med hele vevet. In vivo dyremodeller av infeksjon er av stor relevans i tillegg til evaluering av beskyttelsesgrad gitt av vaksine formuleringer. Som et menneske-Tropic patogen, meningokokker besitter nødvendige faktorer som er nødvendige for vellykket infeksjon som overflatestrukturer (dvs. type IV Pili og dekkevne proteiner) og jern opptak systemer for menneskelige reseptorer og transport proteiner (dvs. transferrin og Laktoferrin)5,6,7 til riktig overholde, overleve og invadere den menneskelige verten. Til slutt bidrar den genetiske variasjonen evnene til patogen til å unngå og/eller blokkere den menneskelige immunresponsen videre til de høyeartene tropism. Derfor, fravær av spesifikke vert faktorer, involvert i samspillet, kan blokkere trinn av patogene livssyklus, etablere betydelige vanskeligheter i utviklingen av små dyremodeller som oppsummerer meningokokk livssyklus.
I løpet av de siste ti årene har flere tilnærminger blitt utviklet for å forbedre vår forståelse av meningokokk smittsomme syklus. Infeksjoner av to dyremodeller, mus og rotte, enten intraperitonealt (IP) eller intranasalt (i.n.), ble utviklet for å reprodusere meningokokksykdom10,11,12,13,14 ,15,16,17. Laboratoriet musen er trolig en av de mer allsidige dyr for inducing eksperimentell meningokokkinfeksjon.
Imidlertid fører den IP måten av smitte til utvikling av alvorlig sepsis selv om det ikke etterligner den naturlige ruten for smitte, mens den i.n. ruten av infeksjonen var nyttig å evaluere meningokokk patogenesen, selv om det kan indusere lungeinfeksjon før sepsis10,11,12,13,14,15,16,17.
Den IP muse modellen var medvirkende til å vurdere beskyttelsen fra meningokokk Challenge10,11,12. Musen modell av meningokokk kolonisering basert på den i.n. ruten av infeksjonen har blitt utviklet med spedbarn mus, som de er mer utsatt for meningococci, å reprodusere en invasiv infeksjon etterligne løpet av meningokokksykdom hos mennesker 13,14,15,16,17. Videre, for å fremme meningokokk replikering i murine vert, et økende antall tekniske strategier ble også brukt, inkludert administrering av jern til dyrene for å forbedre infeksjonen, bruk av høy bakteriell inokulum, mus-passert bakteriell stamme samt ansettelse av spedbarn eller immunsupprimerte dyr vertene10,13,15,18,19. Uttrykk for konkrete menneskelige faktorer som CD4620 eller transferrin21 har økt mottakelighet av mus til denne menneske-Tropic bakterien; sysselsettingen av den menneskelige huden xenograft modell av infeksjonen har også vært nyttig å evaluere vedheft evne til meningococci til menneskelig endotelet22,23. Samlet sett har den nylige utviklingen av humanisert transgene mus forbedret forståelsen av meningokokk patogenesen og dens verts interaksjoner.
Tidligere har vi utviklet en murine modell av meningokokk hjernehinnebetennelse der inoculation av bakterier ble utført i Cisterna magna av voksne mus med mus-passert bakterier24. Kliniske parametre og overlevelse av infiserte mus viste opprettelsen av hjernehinnebetennelse med egenskaper som kan sammenlignes med de som er sett i den menneskelige verten, samt mikrobiologisk og histologiske analyse av hjernen. Fra disse infiserte mus, var bakterier, også, utvinnes fra blod, lever og milt, og bakteriell belastninger fra perifere organer korrelert med smittsomme dosen. Spesielt ble denne modellen benyttet for å evaluere virulens av en isogenic mutert stamme som var defekt i L-glutamat transporter GltT24. Nylig, ved hjelp av vår mus modell av meningokokk meningitt basert på i. cist. rute med serogruppe C stamme 93/42862,24 og en isogenic mutant defekt i cssA gen koding for UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase25, har vi analysert rollen som eksponert Sialic syre i etableringen av sykdom hos mus.
I denne protokollen, beskriver vi en grei metode for å indusere eksperimentell meningokokk hjernehinnebetennelse basert på i. cist. smitte ruten i Balb/c voksen mus. Denne metoden er spesielt nyttig for karakterisering av meningokokkinfeksjon i en murine vert, samt for vurdering av virulens mellom vill type referansestammer og isogenic mutanter. Den intra-cisternal ruten av infeksjonen sikrer fullstendig levering av meningococci direkte inn i Cisterna magna, som igjen forenkler bakteriell replikering i spinalvæsken (CSF) og induserer hjernehinnebetennelse med funksjoner som etterligner de tilstede hos mennesker2,24,25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble utført for å minimere animalsk lidelse og redusere antall mus i samsvar med det europeiske fellesskap rådsdirektiv av 24 november 1986 (86/609/EØF). In vivo eksperimenter i denne studien ble godkjent av etisk dyre omsorg og bruks komité (beskytte nummer 2, 14. desember 2012) og det italienske Helsedepartementet (beskytte nummer 0000094-A-03/01/2013). Alle prosedyrene skal utføres inne i biosafety Cabinet 2 (BSC2) i et BSL2 rom, og det potensielle infiserte avfallet skal avhendes i dedikerte beholdere.
1. infeksjon av mus med N. meningitidis serogruppe C stamme
Forsiktig: N. meningitidis er potensielt en skadelig patogen og alle nødvendige forholdsregler må tas når du håndterer denne mikroorganismen. Hele eksperimentering krever biosafety Level 2 (BSL2) forvaring. Forskeren involvert i dyrestudier bør bruke disponibel personlig verneutstyr (PPE) for varigheten av eksperimentet.
- Utarbeidelse av bakterier for in vivo infeksjon studier
- Velg en enkelt koloni fra en fersk Neisseria meningitidis kultur på GC (gonococcal) agar plate supplert med 1% (Vol/Vol) Polyvitox supplement og vaksinere i 10 ml GC kjøttkraft.
- Dyrke bakteriene ved 37 ° c i en orbital shaker inkubator med hastigheten på 220 RPM. Fortsett å sjekke OD av kulturen med en spektrofotometer. Dyrke kulturen til tidlig eksponentiell fase ved en optisk tetthet OD600nm av 0,7, tilsvarende ≈ 7 x 108 CFU/ml.
- Når den nødvendige OD er innhentet, gjør frosne aksjer ved å legge 10% glyserol. Dispensere 1 mL av kulturen i cryovials. Oppbevar hetteglassene ved-80 ° c til bruk.
Merk: Selv om det er bedre å bruke fersk bakteriekultur, ble frosne aksjer brukt til å forenkle og standardisere in vivo eksperimentet. Vanligvis frosne bestandene har vært ansatt innen ca 6 måneder fra forberedelsene. - Før infeksjonen, tine frosne bakterier ved romtemperatur.
- Høste Bakteriecellene ved sentrifugering i 15 min ved 1 500 x g og resuspend i 1 ml fersk GC buljong som inneholder jern dextran (5 mg/kg).
Merk: GC suppen er utarbeidet med tillegg av jern dextran (5 mg/kg) for å favorisere replikering av meningococci i verten tissue14,18,27. - Før du bruker, utføre levedyktige tellinger av bakterier for å fastslå det nøyaktige antallet CFU for smitte. For å gjøre dette, plukke opp 10 μL av bakteriell suspensjon og fortsette med seriell fortynninger og spre hver fortynning på GC agar plater og ruge ved 37 ° c med 5% CO2, for 18-24 h.
- Intra-cisternal injeksjon av mus
Merk:Hele prosedyren utføres i laminær Flow kabinett for å opprettholde aseptisk forhold.- House laboratoriet mus (8 uke gamle, kvinnelige Balb/c) under spesifikke patogen gratis betingelser. Skaffe næringen pellets og vann annonse lib.
- Bosette dyrene i det nye miljøet for 1 uke før du starter eksperimentet.
- Før du starter eksperimentet, veie og evaluere deres kroppstemperatur.
Merk: Den innavlet Balb/c kvinnelige mus av åtte uker gamle veie et gjennomsnitt på ca 19 g. Den gjennomsnittlige temperaturen på laboratoriet mus fysiologisk spenner fra 36-38 ° c24. - Scruff dyret fra nakken, rengjør magen området med 70% etanol og injisere IP jern dextran (oppløst i 1% fosfat saltvann buffer, 250 mg/kg) i nedre høyre kvadrant av murine magen ved hjelp av en 25 G nål 0,5 mm x 16 mm , ca 2-3 h før infeksjonen.
Merk: Den intraperitoneal injeksjon ble utført i nedre høyre kvadrant av murine magen for å unngå skadelige abdominal organer som urin blære, cecum, etc. Administrasjonen av eksogene Iron Source, i form av jern dextran, til dyr før infeksjonen favoriserer bakteriell multiplikasjon i verten14,18,27. - Etter 2-3 h, Utfør dyr anestesi med ketamin (50 mg/kg) og xylazine (3 mg/kg) og smøremiddel.
- Sjekk for dybden av anestesi ved å sikre fravær av smerte respons på knipe tåen.
- Plasser musen i sternal ligge og forsiktig strekke lemmer og cervical ryggraden for å holde vertebrale kolonnen i rett posisjon.
- Bland den bakterielle fjæringen forsiktig for å opprettholde en stabil suspensjon før du legger en sprøyte på 30 G nål x 8 mm.
Merk: Klargjør bakteriell suspensjonen så nært som mulig til injeksjons tiden; i mellomtiden, oppbevar den i romtemperatur. - Basert på innlegget tine bakteriell titer (CFU/mL), Fortsett med beregningen av den totale CFU som skal brukes, med hensyn til det totale antall dyr å være smittet (CFU bakteriell dose per antall dyr). Fortsett med beregningen av nøyaktig volum som skal tas fra hetteglasset for å få den totale CFU bruke en andel mellom innlegget tine bakteriell titer (CFU/mL) og den totale CFU nyttig for smitte av n mus (post tine bakteriell titer CFU : ml = total CFU: x). Etabler det endelige volumet med hensyn til det totale antallet dyr som skal smitte.
Merk: I disse eksperimentene ble det brukt et bredt spekter av titer fra10 til 10 9 per dyr. - Rengjør operasjonsområdet med 70% etanol.
- Identifiser injeksjonsstedet ved hjelp av en nål og injisere den etablerte CFU av meningococci (vill type belastning og isogenic mutant belastning), eller GC buljong supplert med jern dextran (5 mg/kg) som kontroll, i et samlet volum på 10 μL i Cisterna magna av mus gjennom en occipital Burr hullet ved hjelp av en 30 G nål x 8 mm.
- Utfør cisternal inokulum ved å plassere nålen i det craniocervical krysset, spesielt i rygg subarachnoid plass. Ventroflex hodet for å gjøre denne plassen tilgjengelig28.
- Kort, plasser dyret i lateral recumbency, hold ørene ut av veien og bøy nakken moderat (90 til 100 °). Sørg for at midtlinjen i nakken og hodet (fra nesen til bakhodet) er i perfekt parallell posisjon til bordplaten.
- Berør Atlas vinger og sørg for at de overlapper hverandre, eliminerer aksial rotasjon. En naturlig fordypning kan vanligvis bli berørt på midtlinjen hvor nålen er mest sannsynlig å gå inn i occipital hullet.
- Kast sprøyten og nålen trygt etter injeksjon av mus med Neisseria.
- Plasser dyret i buret og vent til oppvåkning og full gjenoppretting av bevegelse.
- Hold burene med infiserte mus under en laminær Flow kabinett.
- Overvåk mus, 24 h post infeksjon, for kliniske tegn på koma i koma skala29. Koma skala: 1 = koma, 2 = står ikke oppreist etter å ha blitt slått på ryggen, 3 = stands oppreist innen 30 s, 4 = står oppreist innen 5 s, minimal aktiviteter, 5 = normal.
Merk: Når i dyr ble registrert smerte, analgesi med meloksikam (5 mg/kg IP for varighet av studien) ble administrert. - Fortsett for dyret overlevelse eller CFU teller analysen på de infiserte dyrene som beskrevet i trinn 2.
- Utfør dødshjelp av mus med en poengsum på 2 av cervical forvridning og ta opp som døde for statistisk analyse.
2. Animal overlevelse og CFU teller
-
Overlevelse av dyr
- Forbered bakteriell inocula ved ulike doser (altfra 10 til 10 9 CFU per mus) å infisere dyr ved i. cist. ruten (se trinn 1,2).
- Vaksinere kontroll mus med GC buljong, supplert med jern dextran (5 mg/kg), på samme måte.
- Monitor dyr for kliniske symptomer: ruffled pels, bøyd utseende, nedkjøling, vekttap, apati, eller døende24,25,26,30, hver dag gjennom hele eksperimentet for 168 h (7 dager) minst to ganger om dagen for varigheten av eksperimentet.
- Mål kroppsvekt og temperatur ved hjelp av en digital balanse og et rektal termometer, henholdsvis hver dag.
- Record overlevelse av mus i en uke.
Merk: Record den naturlige død av dyret innlegg infeksjon mens dyrene som når en koma verdi på 2 eller som overlever over 168 h av observasjon vil bli euthanized. - Bedøve mus med koma verdi på 2 eller som overlever over observasjons tiden med ketamin (50 mg/kg) og xylazine (3 mg/kg) og påfør øyen salve.
- Sjekk at smerten respons er fraværende av toe knipe.
- Utføre aktiv død av mus ved cervical forvridning og ta opp som døde for statistisk analyse.
-
Evaluering av koloni forming enheter (CFU) teller i perifere organer
- Bruk en sub-dødelig bakteriell dose (5 x 105CFU/mus) på grunnlag av dyre overlevelse resultater å vaksinere dyr av i. cist. rute (se avsnitt 1,2).
- Monitor rektal temperatur hver dag under infeksjonen og utføre anestesi av dyr på 48 h innlegg infeksjon som nevnt i trinn 2.
- Fortsett med 70% etanol desinfeksjon av brystet og trekke 600-700 μL av blod ved hjerte punktering av brystet hulrom ved hjelp av en 25 G nål 0,5 mm x 16 mm.
- Samle blodet i et rør som inneholder 3,8% natrium citrate og oppbevar ved-80 ° c for den senere levedyktige bakterie celle tellingen.
- Utfør cervical forvridning å ofre dyrene. Bekreft døds opptaket fraværet av hjerterytme, etter å ha ofret musen i henhold til alle relevante institusjonelle og etiske retningslinjer.
- Lay musa i liggende posisjon og bruke saks og tang til å fortsette med kutt av pelsen langs sagittal planet av kroppen. Fest huden med pelsen på sidene av kroppen med pinner.
- Skjær av bukhulen ved hjelp av skarpe saks. Bruk saks og en gangs tang til avgiftsdirektoratet organene (f. eks, milt og lever) og putte hver og en i sterile Petri parabolen med 1 mL GC buljong supplert med 10% (Vol/Vol) glyserol.
- Kast musekroppen på en trygg måte i henhold til IACUC retningslinjer.
- Homogenisere organene mekanisk ved romtemperatur med stempelet på en 5 mL sprøyte i ca. 2-3 min inntil en enkelt celle fjæring dannes og overfører den i et rør.
- Sett røret med homogenisert vevsprøven umiddelbart på den tørre isen.
Merk: Prøvene kan oppbevares ved-80 ° c i et 2 mL sterilt rør for utføring av den levedyktige bakterie celle tellingen ved senere punkt. - Lag GC agar plater med antibiotika når det er nødvendig. Tørk platene før bruk pre-incubating ved 37 ° c for 2-3 h.
- Forbered 10-fold seriell fortynninger av prøvene i GC buljong fra hver homogenisert vev og plate på GC agar plater. Ruge over natten ved 37 ° c med 5% CO2.
3. utarbeidelse av Brain vev for CFU Count
- Bruk en sub-dødelig bakteriell dose (5 x 105 CFU/mus) på grunnlag av dyre overlevelse resultater å vaksinere dyr av i. cist. rute (se avsnitt 1,2).
- Utføre anestesi av dyr på etablerte infeksjons tid som nevnt i trinn 2.
- Utføre døds aktiv av dyr ved cervical forvridning.
- Rengjør operasjonsområdet med 70% etanol.
- Klipp av hodet på musen ved hjelp av en stor saks.
- Resect pelsen og huden ved hjelp av små kirurgiske saks og en fin tippet stål tang, fortsetter mot toppen av skallen for å kunne tydelig se sting og å veilede åpningen av kraniet.
- Sett tuppen av en liten saks gjennom foramen Magnum å åpne skallen.
- Skjær mot midten av kraniet og over midtlinjen av parietal bein til motsatt side av skallen. Skjær forsiktig langs den laterale kanten av lambdoid Sutur.
- Løft kraniet starter fra bakre parietal hjørne og dra den diagonalt oppover for å oppdage hjernen, ved hjelp av fine tippet tang.
- Vær sikker på at hjernen vevet ikke er festet til noen bein av hodet, når skallen er løftet.
- Bruk en gangs tang for å fjerne eventuelle bindevev mellom skallen og hjernen, for å sikre at hjernevevet blir fjernet sammen med skallen.
- Ikke la hjernevevet tørke ut for mye. Plasser hjernen, ved hjelp av en gangs tang, i en Petri parabolen med 1 mL GC buljong supplert med 10% (Vol/Vol) glyserol.
- Homogenisere hjernen mekanisk med stempelet på en 5 mL sprøyte (se trinn 2.2.9). Overfør prøvene til en 2 mL steril slange og oppbevar-80 ° c for den senere levedyktige bakterie celle tellingen evaluering som beskrevet i trinn 2,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overlevelse av mus smittet med N. meningitidis Wild type og isogenic mutant stammer.
Neisseria meningitidis stammer som brukes i disse representative resultatene er serogruppe C referanse belastning 93/4286 (ET-37) og dets isogenic mutant 93/4286ΩcssA fremstilt ved insertional deaktivering av cssA Gene, koding for UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase, som kart i kapsel syntese geometriske steder25. For å vurdere den virulens graden av den cssA-defekte belastningen i den nåværende murine modellen, ble den dødelige dosen i stand til å bestemme dødsfallet til 50% av infiserte dyr (ld50) evaluert. Til dette formålet tre grupper av dyr ble smittet intracisternally med doser som spenner fra 104 til 106 CFU av Wild type stamme 93/4286 og med doser av mutant belastning 93/4286ΩcssA mellom 107 til 109 CFU . Generelt, reduksjon av kliniske parametre (f. eks, kroppsvekt og temperatur) og den økende dødelighet skjedde i løpet av de første 72 h etter smitte. LD50 for den ville type belastningen tilsvarte den meningokokk utfordringen på 104 CFU, mens dødeligheten med dosen på 105 CFU var lik 83,4% og med 106 CFU av 100% (figur 1a). Motsatt, for å få LD50 for mutant belastning 93/4286ΩcssA, har det vært nødvendig en dose på 108 CFU (figur 1B), en mengde 10 000 folder høyere sammenlignet med vill type belastning.
Evaluering av N. meningitidis levedyktig CFU i musen hjernen vev.
Å følge Kinetics av infeksjon i hjernevevet av infiserte dyr, en gang kurs analysen ble utført med vill type eller cssA mutant stamme25. Etter i. cist. injeksjon med 5x105 CFU av 93/4286 eller 93/4286ΩcssA stammer, det var en rask økning av vill type bakterier i hjernevevet nådde de høyeste tallene på rundt 24 h innlegg infeksjon (figur 2a); motsatt i hjernen av mus utfordret med isogenic cssA-defekt mutant, den levedyktige teller droppet progressivt over tid til å 2,026 logge CFU ± 1,774 72 h innlegg infeksjon (figur 2a). Eksperimentet har vist at 33,3% av de muterte utfordret musene viste bakteriell klaring fra infeksjonen området, mens infeksjon med vill type stamme aldri ble utryddet fra hjernen til dyrene.
Evaluering av meningokokk belastning i milten og leveren 48h post-utfordring.
Dette eksperimentet ble utført for å evaluere clearance av bakterier fra infiserte mus 48 h post-utfordring i perifere organer. Til dette målet, to grupper av mus ble smittet med 5 x 105 CFU av enten 93/4286 eller 93/4286ΩcssA stammer, og bakteriell levedyktig teller ble evaluert i milten og leveren av infiserte mus25 (figur 2b). Etter 48 h fra meningokokk injeksjon, den cssA-defekte mutant ble helt ryddet i milt og lever, mens dyr smittet med vill type stamme utstilt en vedvarende systemisk infeksjon rammeverk. Gjennomsnittet verdier av CFU etter 48 h var faktisk fortsatt 3,212 loggen CFU ± 3,354 og 6,949 Logg CFU ± 1,37 i milten og leveren, henholdsvis. Forskjellen i bakterie belastninger i leveren vev av to dyr grupper var statistisk signifikant (med en P < 0,001).
Figur 1: overlevelse av mus infisert med 93/4286 vill type eller cssA-defekt N. meningitidis stammer. (A) tre grupper av Balb/c mus (n = 6/dose) var smittet i. cist. med 104, 105, og 106 CFU/mus av Wild type stamme 93/4286 og (B) med 107, 108, og 109 CFU/mus av isogenic cssA-defekt mutant. Mus ble overvåket i en uke, og overlevelse ble registrert. Resultatene uttrykkes som prosent overlevelse ved ulike doser over tid, log Rank p-verdien ble < 0,05 for mus som var infisert med den ville type belastningen. Dette tallet har blitt modifisert fra Colicchio et al.25. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: evaluering av bakterielle belastninger over tid i mus inokulert med 93/4286 eller 93/4286ΩcssA stammer. (A) tid løpet av bakterielle belastninger i hjernen vev følgende i. cist. Infeksjon. To grupper av Balb/c mus (n = 20/Group) ble smittet av i. cist. rute med 5 x 105 CFU av enten Wild type stamme 93/4286 eller cssA-defekt mutant. Dyr ble ofret 4, 24, 48, og 72 h etter smitte. Hjerner ble høstet, mekanisk homogenisert i GC medium, og levedyktige tellinger ble bestemt. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD-logg med CFU-tall per organ på ulike tidspunkter etter inoculation. Stjernene angir statistisk betydning (* *, P < 0,01). (B) bakteriell belastning over tid i milten og leveren. To grupper av Balb/c mus (n = 5/Group) var smittet i. cist. med 5 x 105 CFU av enten Wild type stamme 93/4286 eller cssA-defekt mutant. Dyrene var euthanized 48 h etter infeksjon. Spleens og lever ble høstet, mekanisk homogenisert, og levedyktige tellinger ble fastslått. Resultatene er uttrykt som log CFU tall per organ. Horisontale stolper indikerer gjennomsnittlig logger av bakteriell titers. Stjernene angir statistisk betydning (* * *, P < 0,001). Dette tallet har blitt modifisert fra Colicchio et al.25. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien, beskriver vi en eksperimentell protokoll for å indusere meningokokk hjernehinnebetennelse i voksen mus av i. cist. inoculation av meningokokk bakterier. Til vår kunnskap, har ingen annen modell av meningokokk hjernehinnebetennelse blitt utviklet i laboratoriet mus smittet av i. cist. rute i det siste, har denne måten blitt utforsket for å gi modeller av meningokokk hjernehinnebetennelse i både rotte31 og kanin32. Det er velkjent at den høyeste frekvensen av meningokokksykdom er funnet mellom små barn, ungdom og unge voksne33,34,35; av denne grunn, i vår hjernehinnebetennelse mus modell, i stedet for å fokusere på nyfødt eller spedbarn dyr, 8 uke gamle immunkompetente dyr ble ansatt.
I vår eksperimentelle modell, bestemte vi oss for å bruke i. cist. inokulum som det sikrer utgivelsen av meningococci direkte inn i Cisterna magna så tilrettelegge bakteriell replikering i CSF. Denne ruten av inoculation er fysiologisk mer tilgjengelig28 og mindre traumatisk enn intrakraniell subarachnoidal rute, som allerede brukes for utvikling av hjernehinnebetennelse på grunn av Streptococcus spp. 36,37. Selv om det ikke representerer den naturlige måten å smitte av meningokokker, injeksjon av bakterier i dette området var instrumental for induksjon av meningokokk hjernehinnebetennelse, som vist ved mus overlevelse, bakterier belastninger, kliniske parametre, og også av histologiske Analysis24,25,26. Interessant, referanse belastning 93/4286 indusert hjernehinnebetennelse med histopathologic funksjoner etterligne de som er observert i Human sykdom24,25,26.
Å etablere en standardisert murine infeksjon og for å garantere sikkerheten til forskere, det var foretrukket å starte fra en titrert frossen lager av bakterier i stedet for en frisk bakteriell vekst24,25,30, 38, videre bestemte vi oss for å bruke en sub-dødelig dose av Live meningococci med sikte på å begrense en rask dødelig utfall og tillate utvikling av hjerneskade2,24,25,26. Likevel, for å bestemme en hensiktsmessig smittsom dose for ulike stammer, må foreløpige eksperimenter utføres. I denne studien, testet vi en serogruppe C referanse belastning 93/4286 og en isogenic mutant belastning 93/4286ΩcssA med en dose på 5 x 105 CFU/mus.
Selv om denne modellen ikke etterligner de innledende fasene av kolonisering og invasjon av meningokokker, den bakterielle isolere vokser godt, ikke bare i CSF, men det er også i stand til å forbli i milten og leveren rom. I løpet av den hypoferremic fasen av neisserial infeksjon, forblir de fleste av måltema jern kombinert med lever ferritin. Som ferritin kan brukes meningococci å få jern39, leveren utgjør et mål organ for bakteriell replikering.
I denne eksperimentelle prosedyren, den innavlet Balb/c musen belastningen ble brukt i utskifting av outbred CD-1 belastning som opprinnelig var ansatt for å utvikle meningokokk hjernehinnebetennelse modell24. Outbred mus var preget av en bred genetisk variasjon som kan være mer hensiktsmessig å avdekke flere effekter i en variabel kohort som menneskelige befolkning40,41. Imidlertid trenger denne variasjonen en høyere utvalgsstørrelse for å oppnå tilstrekkelig statistisk betydning og kan forstyrre standardisering av prosedyrer og målrettede studier.
Til tross for den smale vert utvalg av meningokokker, for å sikre replikering av bakterier i murine vert og forsterke virulens av meningococci, jern dextran ble administrert til dyr før infeksjonen6,14. Til slutt, sammenlignet med andre eksperimentelle modellen av hjernehinnebetennelse, dyr ble ikke behandlet med noen antibiotika, å ikke påvirke Sykdomsforløpet og/eller profil av inflammatorisk respons26.
Hittil har våre studier fremhevet at i. cist. modellen er funksjonell å indusere både hjernehinnebetennelse og invasiv meningokokksykdom sammenlignet med IP eller i.n. modeller av infeksjon, som er karakterisert ved forekomsten av sepsis og kalles bacteremia før hjernehinnebetennelse er etablert10,11 ,12,13,14,15,16,17. Derfor, denne infeksjonen modell basert på induksjon av hjernehinnebetennelse i murine vert, kan være nyttig ikke bare å evaluere innovative terapeutiske strategi for å hindre bakteriell replikering direkte til CSF men også å analysere effekten av mulige passive immune behandling mot menneskelige patogener.
Men meningokokkinfeksjon er en flertrinnsprosess, som inkluderer nasopharynx kolonisering, tilgang til blodet, kryssing av blod hjerne barrieren og til slutt ukontrollert spredning i CSF, vår modell bare reproduserer noen aspekter av meningokokkinfeksjon, for å undergrave delvis disse begrensningene transgene dyremodell kan være nyttig å etterligne den menneskelige patogenesen av meningokokksykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Studiene ble støttet delvis av PRIN 2012 [Grant Number 2012WJSX8K]: "Host-mikrobe interaksjon modeller i slimhinne infeksjoner: utvikling av romanen terapeutiske strategier" og av PRIN 2017 [2017SFBFER]: "en integrert tilnærming til å takle samspillet mellom tilpasning, stressende forhold og resistens resistens av utfordrende patogener ".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1 mL 25 G 5/8 inch | BD | 300014 | 05 mm x 16 mm |
| BD Plastipak syringe 5 mL | BD | 308062 | 07 mm x 30 mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3, Floor area 370 cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5 mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0.10 x 0.06 mm2 tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8 mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface: 15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90 x 14.2 mm2 |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20 μL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200 μLL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1,000 μL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5 mL |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor - ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume = 288 L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
References
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
- Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
- Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
- Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
- Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
- Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
- de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
- Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
- Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
- Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
- Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
- Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
- Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
- Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
- Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
- Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
- Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
- Johansson, L., et al.
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
- Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139 (2013).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
- Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
- Beverly, K. S. Chapter 105 - Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
- Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
- Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750 (2016).
- Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116 (2007).
- Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
- World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , Geneva: WHO. (2011).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36 (2004).
- Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137 (2018).
- Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653 (2012).
- Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
- Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
- Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).
