Summary
Aqui, descrevemos um método para induzir a meningite meningocócica através de uma via intracisternal de infecção em camundongos adultos. Apresentamos um protocolo passo a passo de infecção meningocócica desde a preparação do inóculo para a infecção intracisternal; registre então a sobrevivência animal e avalie as cargas bacterianas em tecidos do murine.
Abstract
Neisseria meningitidis (meningococcus) é um microorganismo de alcance estreito, reconhecido mundialmente como a principal causa de meningite bacteriana. Meningococcus é um colonizador transitório da nasofaringe humana de aproximadamente 10% do sujeito saudável. Em circunstâncias particulares, adquire uma capacidade invasiva de penetrar na barreira da mucosa e invade a corrente sanguínea causando septicemia. No último caso, a sepse fulminante poderia surgir mesmo sem o consequente desenvolvimento da meningite. Por outro lado, as bactérias poderiam se multiplicar mal na corrente sanguínea, atravessar a barreira do cérebro sanguíneo, alcançar o sistema nervoso central, levando à meningite fulminante. Os modelos de urina de meningite bacteriana representam uma ferramenta útil para investigar as interações hospedógeno-patógeno e analisar os mecanismos pathogenéticos responsáveis por esta doença letal. Embora, vários sistemas de modelos experimentais tenham sido avaliados nas últimas décadas, nenhum deles foi capaz de reproduzir os eventos patológicos característicos da doença meningocócica. Neste protocolo experimental, descrevemos um procedimento detalhado para a indução da meningite meningocócica em um modelo de camundongo baseado na inoculação intracisternal de bactérias. Os sinais peculiares da meningite humana foram registrados no hospedeiro murina por meio da avaliação de parâmetros clínicos (por exemplo, temperatura, peso corporal), avaliação da taxa de sobrevida, análise microbiológica e exame histológico de lesão cerebral. Ao usar inóculo intracisternal (i.cist.), meningococos entrega completa diretamente em cisterna magna, levando a uma replicação meningocócica muito eficiente no tecido cerebral. Um aumento de 1.000 vezes da contagem viável de bactérias é observado em cerca de 18 h. Além disso, meningococos também são encontrados no baço, e fígado de camundongos infectados, sugerindo que o fígado pode representar um órgão-alvo para a replicação meningocócica.
Introduction
Neisseria meningitidis é um Gram negativo β-proteobacterium restrito ao hospedeiro humano, bem conhecido por ser uma das causas mais comuns de meningite e sepse na população humana em todo o mundo. Coloniza o trato respiratório superior (nariz e garganta) de portadores saudáveis e assintomáticos (2-30% da população), mas a bactéria às vezes evita várias defesas imunes do hospedeiro e se espalha da corrente sanguínea para o cérebro, causando um local descontrolado inflamação, conhecida como meningite meningocócica. Uma combinação de fatores do anfitrião e bacterianos parece contribuir à transição do commensal ao comportamento invasor1.
N. meningitidis é especializada exclusivamente em colonização humana e infecção. Tem uma escala estreita do anfitrião e, conseqüentemente, limitou estudos in vivo do pathogenesis devido à falta dos modelos animais apropriados que reproduzem a doença meningocócica humana. Como resultado, levou a lacunas fundamentais na compreensão em relação à patogênese da septicemia e meningite causada pelo meningococcus. Nas últimas décadas, o desenvolvimento de muitos sistemas in vitro permitiu a identificação de vários fatores de virulência meningocócica2,3,4. Embora esses estudos valiosos fornecessem insights importantes para entender o papel desses fatores para uma infecção meningocócica bem-sucedida, esses modelos não permitiram a avaliação das consequências das interações bacterianas com o humoral e celular sistema imunológico e ainda menos com todo o tecido. In vivo modelos animais de infecção são de grande relevância, bem como para a avaliação do grau de proteção conferida por formulações vacinais. Como patógeno humano-trópico, meningococcus possuem determinantes apropriados necessários para infecções bem-sucedidas, como estruturas superficiais (ou seja, pili tipo IV e proteínas de opacidade) e sistemas de captação de ferro para receptores humanos e proteínas de transporte (ou seja, transferrina e lactoferrina)5,6,7 para aderir adequadamente, sobreviver e invadir o hospedeiro humano. Finalmente, as habilidades de variação genética do patógeno para fugir e/ou bloquear a resposta imune humana contribuem ainda mais para o tropotismo de espécies altas8,9. Portanto, a ausência de fatores hospedeiros específicos, envolvidos na interação, pode bloquear etapas do ciclo de vida do patógeno, estabelecendo dificuldades significativas no desenvolvimento de pequenos modelos animais resumindo o ciclo de vida meningocócica.
Ao longo das últimas décadas, várias abordagens foram desenvolvidas para melhorar a nossa compreensão do ciclo infeccioso meningocócico. Infecções de dois modelos animais, camundongos e camundongos, intraperitoneally (i.p.) ou intranasally (i.n.), foram desenvolvidas para reproduzir a doença meningocócica10,11,12,13, 14 , 15,16,17. O rato de laboratório é provavelmente um dos animais mais versáteis para induzir a infecção meningocócica experimental.
No entanto, a forma de infecção do i.p. leva ao desenvolvimento de sepse grave, embora não imite a via natural da infecção, enquanto a via de infecção do i.n. foi útil para avaliar a patogênese meningocócica, mesmo que possa induzir infecção pulmonar antes da sepse10,11,12,13,14,15,16,17.
O modelo de mouse i.p. foi fundamental para avaliar a proteção contra o desafio meningocócico10,11,12. O modelo do rato da colonização meningocócica baseada na rota i.n. da infecção foi desenvolvido com ratos infantis, porque são mais suscetíveis aos meningococci, para reproduzir uma infecção invasora que imita o curso da doença meningocócica nos seres humanos 13,14,15,16,17. Além disso, para promover a replicação meningocócica no hospedeiro murine, um número crescente de estratégias técnicas também foram aplicadas, incluindo a administração do ferro para os animais para melhorar a infecção, o uso de alto inóculobacteriano , cepa bacteriana passagem por camundongos, bem como o emprego de animais infantis ou imunocomprometidos hospeda10,13,15,18,19. A expressão de fatores humanos específicos como CD4620 outransferrin21 aumentou a susceptibilidade dos camundongos para esta bactéria humano-trópico; o emprego do modelo de xenoenxerto de pele humana de infecção também tem sido útil para avaliar a capacidade de adesão de meningococos ao endotelio humano22,23. Coletivamente, o recente desenvolvimento de camundongos transgênicos humanizados melhorou a compreensão da patogênese meningocócica e suas interações hospedeiras.
Anteriormente, desenvolvemos um modelo de urina de meningite meningocócica, onde a inoculação de bactérias foi realizada na cisterna magna de camundongos adultos com bactérias de passagem de ratos24. Parâmetros clínicos e a taxa de sobrevida de camundongos infectados demonstraram o estabelecimento de meningite com características comparáveis às observadas no hospedeiro humano, bem como as análises microbiológicas e histológicas do cérebro. Destes camundongos infectados, as bactérias foram, também, recuperados de sangue, fígado e baço, e cargas bacterianas de órgãos periféricos correlacionados com a dose infecciosa. Em particular, este modelo foi empregado para avaliar a virulência de uma cepa mutante isógênica com defeito no transportador L-glutamato GltT24. Recentemente, usando nosso modelo do rato da meningite meningococcal baseada em i.cist. rota com cepa sorogrupo C 93/42862,24 e um mutante isogênico defeituoso na codificação de genes cssA para UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerase25, analisamos o papel do ácido siálico exposto no estabelecimento de doença em camundongos.
Neste protocolo, descrevemos um método simples para induzir a meningite meningocócica experimental com base no i.cist. rota de infecção em camundongos adultos Balb/c. Este método é particularmente útil para a caracterização da infecção meningocócica em um hospedeiro de urina, bem como para a avaliação da virulência entre cepas de referência do tipo selvagem e mutantes isogênicos. A via intra-cisterna da infecção garante a entrega completa dos meningococos diretamente na cisterna magna, que por sua vez facilita a replicação bacteriana no líquido cefalorraquidiano (CSF) e induz meningite com características que imitam aqueles presente emseres humanos2,24,25,26.
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Protocol
Este protocolo foi conduzido para minimizar o sofrimento dos animais e reduzir o número de camundongos de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE). Experimentos in vivo relatados neste estudo foram aprovados pelo Ethical Animal Care and Use Committee (Prot. número 2, 14 de dezembro de 2012) e pelo Ministério da Saúde italiano (Prot. número 0000094-A-03/01/2013). Todos os procedimentos devem ser realizados dentro do Gabinete de Biossegurança 2 (BSC2) em uma sala BSL2, e os resíduos potenciais infectados devem ser descartados em recipientes dedicados.
1. Infecção de camundongos com N. meningitidis Serogroup C Strain
CUIDADO: N. meningitidis é potencialmente um patógeno prejudicial e todas as precauções necessárias devem ser tomadas ao manusear este microrganismo. Toda a experimentação requer contenção do Nível 2 de Biossegurança (BSL2). O pesquisador envolvido em estudos com animais deve usar equipamentos descartáveis de proteção individual (Epi) durante o experimento.
- Preparação de bactérias para estudos de infecção in vivo
- Escolha uma única colônia de uma nova cultura neisseria meningitidis em GC (Gonococcal) placa de ágar complementada com 1% (vol / vol) suplemento de polivitox e inoculação em 10 mL de caldo GC.
- Crescer a bactéria a 37 °C em uma incubadora orbital shaker com a velocidade de 220 rpm. Continue verificando o O.D. da cultura com um espectrômetro. Crescer a cultura até a fase exponencial precoce em uma densidade óptica OD600nm de 0,7, correspondente a 7 x 108 CFU/mL.
- Uma vez que o O.D. necessário é obtido, faça estoques congelados adicionando o glycerol de 10%. Dispense 1 mL da cultura nos crioviais. Guarde os frascos a -80 °C até o uso.
Nota: Embora seja melhor usar a cultura bacteriana fresca, os estoques congelados foram usados para simplificar e estandardizar a experiência in vivo. Normalmente, as unidades populacionais congeladas foram empregadas dentro de cerca de 6 meses a partir da preparação. - Antes da infecção, descongele bactérias congeladas à temperatura ambiente.
- Colher as células bacterianas por centrífuga por 15 min a 1.500 x g e resuspender em 1 mL de caldo GC fresco contendo dextran de ferro (5 mg/kg).
Nota: O caldo GC é preparado com a adição de ferro dextran (5 mg/kg) para favorecer a replicação de meningococos no tecido hospedeiro14,18,27. - Antes de usar, realizar contagens viáveis de bactérias para determinar o número exato de CFU para a infecção. Para isso, pegue 10 μL de suspensão bacteriana e prossiga com diluições em série e espalhe cada diluição em placas de ágar gc e incubaem a 37 °C com 5% de CO2, para 18-24 h.
- Injeção intracisterna de camundongos
Nota:Todo o procedimento é realizado no armário de fluxo laminar para manter condições assépticas.- Camundongos de laboratório da casa (8 semanas de idade, balb/c fêmea) condições específicas de livre patógeno. Fornecer pelotas de alimentos e água ad libitum.
- Acomode os animais no novo ambiente por 1 semana antes de iniciar o experimento.
- Antes de iniciar o experimento, pesar e avaliar a temperatura do corpo.
Nota: Os camundongos fêmeas Balb/c consanguíneos de oito semanas de idade pesam uma média de cerca de 19 g. A temperatura média dos ratos de laboratório fisiologicamente variando de 36-38 °C24. - Scruff o animal do pescoço, limpar a área do abdômen com o etanol de 70% e injetar i.p. ferro dextran (dissolvido em 1% tampão de soro fisiológico fosfato, 250 mg/kg) no quadrante inferior direito do abdômen murine usando uma agulha 25 G 0,5 mm x 16 mm aproximadamente 2-3 h antes da infecção.
Nota: A injeção intraperitoneal foi executada no quadrante direito mais baixo do abdômen do murine para evitar danificar órgãos abdominais tais como a bexiga urinária, o cecum, etc. A administração da fonte de ferro exógena, na forma de ferro dextran, para animais antes da infecção favorece a multiplicação bacteriana no hospedeiro14,18,27. - Após 2-3 h, realizar anestesia animal com cetamina (50 mg/kg) e xilamina (3 mg/kg) e lubrificante oftalmológico.
- Verifique se há profundidade de anestesia, garantindo a ausência de resposta da dor ao beliscar o dedo do pé.
- Posicione o rato em decubitus sternal e estique com cuidado os membros e a espinha cervical para manter a coluna vertebral em uma posição reta.
- Misture delicadamente a suspensão bacteriana para manter uma suspensão consistente antes de carregar uma seringa de 30 G agulha x 8 mm.
Nota: Prepare a suspensão bacteriana o mais próximo possível do tempo de injeção; enquanto isso, armazená-lo à temperatura ambiente. - Com base no titer bacteriano pós-descongelamento (CFU/mL), prossiga com o cálculo do total da UE a ser utilizado, no que diz respeito ao número total de animais a serem infectados (dose bacteriana da UEA por número de animais). Prossiga com o cálculo do volume exato a ser retirado do frasco para obter o total de CFU aplicando uma proporção entre o titer bacteriano pós-descongelamento (CFU/mL) e o CFU total útil para a infecção de n camundongos (após o descongelamento do titer bacteriano CFU : ml = CFU total : x). Estabelecer o volume final em relação ao número total de animais a serem infectados.
Nota: Nestes experimentos, uma ampla gama de titer de 104 a 109 por animal foi utilizado. - Limpe a área cirúrgica com 70% de etanol.
- Identifique o ponto de injeção com a ajuda de uma agulha e injete na CFU estabelecida de meningococos (cepa selvagem do tipo e cepa mutante isogênica), ou caldo GC complementado com dextran de ferro (5 mg/kg) como controle, em um volume total de 10 μL na cisterna magna de camundongos através de um buraco de rebarba occipital usando uma agulha 30 G x 8 mm.
- Realize o inóculo cisterna colocando a agulha na junção craniocervical, especificamente no espaço subaracnoide dorsal. Ventroflex a cabeça para tornar este espaço acessível28.
- Resumidamente, coloque o animal em recumbency lateral, segure as orelhas para fora do caminho e flexione o pescoço moderadamente (90 a 100°). Certifique-se de que a linha média do pescoço e da cabeça (do nariz ao occiput) estão em posição perfeitamente paralela à mesa.
- Toque nas asas atlas e certifique-se de que elas se sobrepõem, eliminando a rotação axial. Um recuo natural geralmente pode ser tocado no meio da linha, onde a agulha é mais provável de entrar no buraco occipital.
- Descarte a seringa e agulha com segurança após a injeção de ratos com Neisseria.
- Coloque o animal na gaiola e aguarde o despertar e a recuperação total do movimento.
- Mantenha as gaiolas com ratos infectados um armário de fluxo laminar.
- Monitor camundongos, 24 h pós infecção, para sinais clínicos de coma de acordo com a escala de coma29. Escala de coma: 1 = coma, 2 = não fica de pé depois de ser virado para trás, 3 = fica ereto dentro de 30 s, 4 = fica na posição vertical dentro de 5 s, atividades ambulatorativas mínimas, 5 = normal.
Nota: Quando nos animais foi registrado dor, foi administrada a analgesia com meloxicam (5 mg/kg i.p. para duração do estudo). - Prossiga para a sobrevivência animal ou CFU conta o ensaio sobre os animais infectados como detalhado no passo 2.
- Realize a eutanásia dos ratos com uma contagem de 2 pela deslocação cervical e recorde como inoperante para a análise estatística.
2. Sobrevivência animal e contagem de CFU
-
Sobrevivência animal
- Prepare inocula bacteriana em doses diferentes (variando de 104 a 109 CFU por rato) para infectar animais pelo i.cist. rota (ver passo 1.2).
- Inoculam camundongos controle com caldo GC, complementado com ferro dextran (5 mg/kg), da mesma maneira.
- Monitorar animais para sintomas clínicos: pele de babados, aparência curvada, hipotermia, perda de peso, letargia, oumoribundo 24,25,26,30, todos os dias durante todo o experimento por 168 h (7 dias) pelo menos duas vezes por dia durante o período do experimento.
- Medir o peso corporal e temperatura usando um equilíbrio digital e um termômetro retal, respectivamente todos os dias.
- Registre a sobrevivência de ratos por uma semana.
Nota: Registre a morte natural da infecção pós animal, enquanto os animais que atingem um valor de coma de 2 ou que sobrevivem mais de 168 h de observação serão sacrificados. - Camundongos anestesios com um valor de coma de 2 ou que sobrevivem durante o tempo de observação com cetamina (50 mg/kg) e xilazine (3 mg/kg) e aplicam pomada oftalmocômica.
- Verifique se a resposta à dor está ausente por pitada do dedo do pé.
- Executar a eutanásia dos ratos pela deslocação cervical e registro como inoperante para a análise estatística.
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Avaliação de unidades formadoras de colônias (CFU) conta em órgãos periféricos
- Use uma dose bacteriana subletal (5 x 105CFU/mice) com base nos resultados de sobrevivência animal para inocular animais pelo i.cist. rota (ver subseção 1.2).
- Monitorar a temperatura retal todos os dias durante a infecção e realizar anestesia de animais em 48 h pós infecção, como mencionado no passo 2.
- Prossiga com a desinfecção de etanol de 70% do tórax e retire 600-700 μL de sangue por perfuração cardíaca da cavidade torácica usando uma agulha de 25 G 0,5 mm x 16 mm.
- Coletar o sangue em um tubo contendo citrato de sódio de 3,8% e armazenar a -80 °C para as contagens de células bacterianas mais tarde viáveis.
- Realizar luxação cervical para sacrificar os animais. Confirme a morte registrando a ausência de batimento cardíaco, depois de sacrificar o mouse de acordo com todas as diretrizes institucionais e éticas relevantes.
- Coloque o rato na posição supina e use tesouras e fórceps para prosseguir com o corte da pele ao longo do plano sagital do corpo. Corrigir a pele com a pele nas laterais do corpo com pinos.
- Corte a membrana peritoneal usando tesoura afiada. Use tesouras e fórceps descartáveis para extirpar os órgãos (por exemplo, baço e fígado) e coloque cada um em placa de Petri estéril com 1 mL de caldo GC complementado com 10% (vol/vol) glicerol.
- Descarte com segurança o corpo do mouse de acordo com as diretrizes da IACUC.
- Homogeneize os órgãos mecanicamente à temperatura ambiente com o desentupidor de uma seringa de 5 mL por cerca de 2-3 min até que uma suspensão de célula única seja formada e a transfira em um tubo.
- Coloque o tubo com a amostra de tecido homogeneizado imediatamente no gelo seco.
Nota: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C em um tubo estéril de 2 mL para realizar a avaliação viável de contagens de células bacterianas em pontos posteriores. - Faça placas de ágar GC com antibióticos quando necessário. Seque as placas antes do uso pré-incubação a 37 °C para 2-3 h.
- Prepare diluições em série de 10 vezes das amostras em caldo GC de cada tecido homogeneizado e placa em placas de ágar GC. Incubar durante a noite em 37 °C com 5% CO2.
3. Preparação de tecidos cerebrais para contagem de CFU
- Use uma dose bacteriana subletal (5 x 105 CFU/mice) com base nos resultados de sobrevivência animal para inocular animais pelo i.cist. rota (ver subseção 1.2).
- Realizar anestesia de animais no tempo de infecção estabelecida, como mencionado no passo 2.
- Realizar a eutanásia de animais por luxação cervical.
- Limpe a área cirúrgica com 70% de etanol.
- Corte a cabeça do rato usando uma tesoura grande.
- Rsect a pele e a pele com a ajuda de tesouras cirúrgicas pequenas e de um forceps de aço derrubado fino, continuando para a parte superior do crânio para poder ver claramente as suturas e guiar a abertura do crânio.
- Insira a ponta de uma pequena tesoura através do foramen magnum para abrir o crânio.
- Corte em direção ao centro do crânio e através da linha média de osso parietal para o lado oposto do crânio. Corte suavemente ao longo da borda lateral da sutura lambdoid.
- Levante o crânio a partir do canto parietal posterior e puxe-o diagonalmente para cima para descobrir o cérebro, usando fórceps finos inclinados.
- Certifique-se de que o tecido cerebral não está ligado a nenhum osso da cabeça, quando o crânio é levantado.
- Use fórceps descartáveis para remover qualquer tecido conjuntivo entre o crânio e o cérebro, para garantir que o tecido cerebral seja removido junto com o crânio.
- Não permita que o tecido cerebral seque muito. Coloque o cérebro, usando fórceps descartáveis, em uma placa de Petri com 1 mL de caldo GC complementado com 10% (vol/vol) glicerol.
- Homogeneize o cérebro mecanicamente com o desentupidor de uma seringa de 5 mL (ver passo 2.2.9). Transfira as amostras para um tubo estéril de 2 mL e guarde -80 °C para a avaliação de contagem de células bacterianas mais viável posterior, conforme discutido no passo 2.2.
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Representative Results
Sobrevivência de camundongos infectados com N. meningitidis tipo selvagem e cepas mutantes isogênicos.
As cepas Neisseria meningitidis utilizadas nestes resultados representativos são a estirpe de referência serogrupo C 93/4286 (ET-37) e o seu mutante isogênico 93/4286ΩcssA obtido por inativação insercional do gene cssA, codificação para o UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerase, que mapeia na síntese cápsula locus25. Para avaliar o grau de virulência da cepa cssA-defeituosa no modelo atual de urina, a dose letal capaz de determinar a morte de 50% dos animais infectados (LD50)foi avaliada. Para este fim, três grupos de animais foram infectados incisternalmente com doses que variam de 104 a 106 FC da estirpe do tipo selvagem 93/4286 e com doses de estirpe mutante 93/4286ΩcssA entre 107 a 109 CFU . Geralmente, a redução dos parâmetros clínicos (por exemplo, peso corporal e temperatura) e o aumento da taxa de mortalidade ocorreram nos primeiros 72 h após a infecção. O LD50 para a cepa do tipo selvagem correspondeu ao desafio meningocócico de 104 FCU, enquanto a taxa de mortalidade com a dose de 105 FCU foi igual a 83,4% e com 106 FCu de 100% (Figura 1A). Por outro lado, para obter o LD50 para a cepa mutante 93/4286ΩcssA, foi necessário uma dose de 108 CFU (Figura 1B), uma quantidade de 10.000 dobras maior em comparação com a estirpe do tipo selvagem.
Avaliação de N. meningitidis CFU viável nos tecidos cerebrais do rato.
Para seguir a cinética da infecção no tecido cerebral de animais infectados, um ensaio de curso de tempo foi realizado com tipo selvagem ou cepa mutante cssA 25. Depois do i.cist. injeção com 5x105 CFU de 93/4286 ou 93/4286ΩcssA cepas, houve um rápido aumento de bactérias do tipo selvagem no tecido cerebral atingindo os números mais elevados em torno de 24 h pós infecção (Figura 2A); Inversamente no cérebro dos ratos desafiados com o mutante isogenic do cssA-defeituoso,as contagens viáveis deixaram cair progressivamente sobre o tempo até 2.026 cfu do registro ± 1.774 72 h após a infecção (Figura 2A). A experiência mostrou que 33.3% dos ratos desafiados do mutante mostraram o afastamento bacteriano do local da infecção, visto que a infecção com tensão selvagem do tipo foi erradicada nunca do cérebro dos animais.
Avaliação da carga meningocócica no baço e fígado 48h pós-desafio.
Este experimento foi realizado para avaliar a limpeza de bactérias de camundongos infectados 48 h pós-desafio em órgãos periféricos. Para este objetivo, dois grupos de camundongos foram infectados com 5 x 105 CFU de 93/4286 ou 93/4286ΩcssA cepas, e as contagens bacterianas viáveis foram avaliadas no baço e fígado de camundongos infectados25 (Figura 2B). Após 48 h da injeção meningocócica, o mutante cssA-defeituosofoi completamente limpo em baço e fígado, enquanto os animais infectados com cepa de tipo selvagem exibiram uma estrutura persistente de infecção sistêmica. Os valores médios da UE após 48 h foram de fato ainda 3.212 log CFU ± 3.354 e 6.949 log CFU ± 1,37 no baço e fígado, respectivamente. A diferença nas cargas bacterianas no tecido hepático de dois grupos animais foi estatisticamente significativa (com um P < 0,001).
Figura 1: Sobrevivência de camundongos infectados com 93/4286 tipo selvagem ou cssA-defeituoso N. meningitidis cepas. (A) Três grupos de camundongos Balb/c (n= 6/dose) foram infectados i.cist. com 104,105,e 106 CFU/mouse do tipo selvagem estirpe 93/4286 e (B) com 107,108, e 109 CFU / mouse do isogênico cssA-mutante defeituoso. Os camundongos foram monitorados por uma semana, e a sobrevivência foi registrada. Os resultados são expressos como a sobrevivência da porcentagem em doses diferentes sobre o tempo, o valor do p do rank do registro era < 0.05 para os ratos contaminados com a tensão selvagem do tipo. Este número foi modificado a partir de Colicchio et al.25. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Avaliação de cargas bacterianas ao longo do tempo em camundongos inoculados com as cepas 93/4286Ou.4286ΩcssA. (A)Tempo de cargas bacterianas nos tecidos cerebrais seguintes i.cist. Infecção. Dois grupos de camundongos Balb/c (n = 20/group) foram infectados pelo i.cist. rota com 5 x 105 CFU de qualquer estirpe tipo selvagem 93/4286 ou o mutante cssA-defeituoso. Os animais foram sacrificados 4, 24, 48 e 72 h após a infecção. Os cérebros foram colhidos, homogeneizados mecanicamente no meio do GC, e as contagens viáveis foram determinadas. Os resultados são expressos como significa ±SD log de números de CFU por órgão em diferentes pontos de tempo após a inoculação. Asteriscos indicam significância estatística (**, P < 0,01). (B)Cargas bacterianas ao longo do tempo no baço e fígado. Dois grupos de camundongos Balb/c (n = 5/group) foram infectados i.cist. com 5 x 105 CFU de qualquer estirpe tipo selvagem 93/4286 ou o mutante cssA-defeituoso. Os animais foram sacrificados 48 h após a infecção. Baços e fígados foram colhidos, homogeneizados mecanicamente e contagens viáveis foram determinadas. Os resultados são expressos como números de CFU de registro por órgão. Barras horizontais indicam registros média de titers bacterianos. Asteriscos indicam significância estatística (***, P < 0,001). Este número foi modificado a partir de Colicchio et al.25. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Neste estudo, descrevemos um protocolo experimental para induzir meningite meningocócica em camundongos adultos por i.cist. inoculação de bactérias meningocócicas. A nosso conhecimento, nenhum outro modelo da meningite meningococcal foi desenvolvido nos ratos do laboratório contaminados pelo i.cist. rota; no passado, desta forma tem sido explorada para fornecer modelos de meningite meningocócica em ambos os ratos31 e coelho32. É sabido que a maior taxa de doença meningocócica é encontrada entre crianças pequenas, adolescentes e adultos jovens33,34,35; por esta razão, em nosso modelo de camundongo meningite, em vez de se concentrar em animais neonatais ou infantis, 8 animais imunocompetentes de 8 semanas de idade foram empregados.
Em nosso modelo experimental, decidimos usar i.cist. inóculo, uma vez que garante a liberação dos meningococos diretamente em cisterna magna para facilitar a replicação bacteriana no CSF. Esta via de inoculação é fisiologicamente mais acessível28 e menos traumática do que a rota subaracnoidal intracraniana, já utilizada para o desenvolvimento da meningite devido ao Streptococcus spp. 36,37. Embora não represente a forma natural de infecção do meningococcus, a injeção de bactérias nesta área foi fundamental para a indução da meningite meningocócica, como mostrado pela sobrevivência do rato, cargas de bactérias, parâmetros clínicos, e também análise histológica24,25,26. Curiosamente, a cepa de referência 93/4286 induziu meningite com características histopatológicas imitando as observadas na doença humana24,25,26.
Para estabelecer uma infecção padronizada murine e para garantir a segurança dos pesquisadores, foi preferido para começar a partir de um estoque congelado titrado de bactérias, em vez de um novo crescimento bacteriano24,25,30, 38,além disso, decidimos usar uma dose subletal de meningococos vivos com o objetivo de limitar um resultado fatal rápido e permitir o desenvolvimento de danos cerebrais2,24,25,26. No entanto, para determinar uma dose infecciosa apropriada para diferentes cepas, experimentos preliminares devem ser realizados. No presente estudo, testamos uma cepa de referência serogrupo C 93/4286 e uma cepa mutante isogênica 93/4286ΩcssA com uma dose de 5 x 105 CFU/ camundongos.
Embora este modelo não imite as fases iniciais de colonização e invasão de meningococo, o isolado bacteriano cresce bem não só no CSF, mas também é capaz de permanecer nos compartimentos baço e fígado. Durante a fase hipoferrêmica da infecção neisserial, a maioria dos restos de ferro derivados de heme combinados com ferritina hepática. Como a ferritina pode ser usada meningococos para obter ferro39,o fígado constitui um órgão alvo para replicação bacteriana.
Neste procedimento experimental, a cepa de camundongo Balb/c consanguíneo foi usada na substituição da cepa CD-1 outbred que foi originalmente empregada para desenvolver o modelo de meningite meningocócica24. Camundongos outbred foram caracterizados por uma ampla variabilidade genética que pode ser mais apropriada para revelar vários efeitos em uma coorte variável, como a população humana40,41. No entanto, essa variabilidade precisa de um tamanho amostral maior para obter significância estatística suficiente e pode interferir na padronização de procedimentos e estudos direcionados.
Apesar da estreita gama de hospedeiros de meningococcus, para garantir a replicação de bactérias no hospedeiro de urina e aumentar a virulência de meningococos, dextran ferro foi administrado a animais antes da infecção6,14. Finalmente, em comparação com outro modelo experimental de meningite, os animais não foram tratados com antibióticos, para não afetar o curso da doença e/ou perfil da resposta inflamatória26.
Até à data, nossos estudos destacaram que o i.cist. modelo é funcional para induzir meningite e doença meningocócica invasiva em comparação com i.p. ou i.n. modelos de infecção, que são caracterizados pela ocorrência de sepse e bacteremia antes da meningite é estabelecida10,11 ,12,13,14,15,16,17. Portanto, este modelo de infecção baseado na indução da meningite no hospedeiro de urina, poderia ser útil não só para avaliar uma estratégia terapêutica inovadora para evitar a replicação bacteriana diretamente em CSF, mas também para analisar a eficácia do possível imune passivo terapia contra patógenos humanos.
No entanto, a infecção meningocócica é um processo de vários passos, que inclui a colonização da nasofaringe, o acesso à corrente sanguínea, o cruzamento da barreira cerebral sanguínea e, finalmente, a proliferação descontrolada no CSF, nosso modelo só reproduz alguns aspectos do Infecção meningocócica, a fim de subverter, em parte, essas limitações modelo animal transgênico pode ser útil para imitar a patogênese humana da doença meningocócica.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os estudos foram apoiados em parte pelo PRIN 2012 [número de subvenção 2012WJSX8K]: "Modelos de interação host-micróbio em infecções mucosas: desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas" e pela PRIN 2017 [2017SFBFER]: "Uma abordagem integrada para enfrentar a interação entre adaptação, condições estressantes e resistência antimicrobiana de patógenos desafiadores".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1 mL 25 G 5/8 inch | BD | 300014 | 05 mm x 16 mm |
| BD Plastipak syringe 5 mL | BD | 308062 | 07 mm x 30 mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3, Floor area 370 cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5 mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0.10 x 0.06 mm2 tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8 mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface: 15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90 x 14.2 mm2 |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20 μL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200 μLL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1,000 μL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5 mL |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor - ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume = 288 L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
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