Summary
Presentert her er en electroporation metode for plasmider DNA-levering og ependymoglial cellemerking i den voksne sebrafisk Telencephalon. Denne protokollen er en rask og effektiv metode for å visualisere og spore individuelle ependymoglial celler og åpner opp nye muligheter til å anvende electroporation til et bredt spekter av genetiske manipulasjoner.
Abstract
Electroporation er en transfeksjoner metode der et elektrisk felt brukes til celler for å skape midlertidige porer i en celle membran og øke sin permeabilitet, og dermed tillater ulike molekyler å bli introdusert til cellen. I denne utredningen, electroporation brukes til å innføre plasmider til ependymoglial celler, som linje ventrikkel sonen av den voksne sebrafisk Telencephalon. En brøkdel av disse cellene viser stilk cellen egenskaper og genererer nye neurons i sebrafisk hjernen; Derfor er det viktig å studere deres adferd for å bestemme deres roller i neurogenesis og gjenfødelse. Innføringen av plasmider via electroporation muliggjør lang tidsmerking og sporing av en enkelt ependymoglial celle. Videre kan plasmider som grobunn recombinase eller Cas9 leveres til enkelt ependymoglial celler, som muliggjør gen rekombinasjon eller genredigering og gir en unik mulighet til å vurdere cellenes autonome gen funksjon i en kontrollert, naturlig Miljø. Til slutt, denne detaljerte, steg-for-steg electroporation protokollen brukes til å oppnå vellykket innføring av plasmider i et stort antall enkelt ependymoglial celler.
Introduction
Sebrafisk er utmerket dyr modeller å eksamen hjerne gjenfødelse etter en stikke såret skaden. I forhold til pattedyr, på den evolusjonære stigen, mindre utviklet seg arter som sebrafisk generelt viser høyere forekomst av konstituerende neurogenesis og bredere områder av voksen nevrale stilk cellen bolig, som fører til konstant generering av nye neurons hele de fleste hjerneområder i det voksne livet. Denne funksjonen ser ut til å relatere med betydelig høyere regenererende kapasitet på sebrafisk i forhold til pattedyr1, som sebrafisk har bemerkelsesverdig potensial til å effektivt generere nye neurons i de fleste hjerneskade modeller studert2, 3,4,5,6,7,8. Her er sebrafisk Telencephalon studert, siden det er et hjerne område med fremtredende neurogenesis i voksen alder. Disse sonene av voksne neurogenesis er homologe til neurogenic soner i den voksne pattedyr hjernen9,10,11.
Rikelig neurogenic områder i sebrafisk Telencephalon er til stede på grunn av eksistensen av radial glia som celler eller ependymoglia celler. Ependymoglial celler fungere som Resident Adult neural stamceller og er ansvarlig for generering av nye neurons i både intakt og regenererende hjerne3,5. Sporing av slektslinje har vist at ventrikkel ependymoglia reagerer på skade, deretter sprer og genererer nye neuroblasts som migrerer til lesjon området5. På grunn av den vrenges ut natur sebrafisk Telencephalon, ependymoglial celler linje ventrikkel overflaten og bygge ventrale ventrikkel veggen. Rygg ventrikkel veggen er formet av et rygg ependymal celle lag (figur 1a). Viktigere, sebrafisk ependymoglia legemliggjøre karakteristikkene av både pattedyr radial glia og ependymal celler. Lange radial prosesser er et typisk trekk ved radial glia celler, mens cellulære utvidelser og tette veikryss (så vel som deres ventrikkel posisjoner) er typiske trekk ved ependymal celler12,13,14. Derfor er disse cellene referert til som ependymoglial celler.
Å følge in vivo atferden til enkelt ependymoglial celler under regenerering, de må være pålitelig merket. Ulike metoder for in vivo cellemerking for fluorescerende mikroskopi har vært tidligere beskrevet, for eksempel endogene journalister eller lipofile fargestoffer15. Disse metodene, i motsetning til electroporation, kan kreve lengre tidsperioder og ofte ikke gir mulighet for enkelt cellemerking eller permanent langsiktig tracing. Electroporation, men (foruten enkelt cellemerking), tilbyr muligheten for å innføre nye DNA inn i verten cellen. Videre, sammenlignet med andre metoder for DNA-overføring i cellene, electroporation har vist seg å være en av de mest effektive metodene16,17,18,19.
Presentert her er en electroporation protokoll som har blitt raffinert med det formål å merke enkelt ependymoglial celler i den voksne sebrafisk Telencephalon. Denne protokollen tillater merking av single ependymoglial celler for å følge dem over en langsiktig periode20 eller for å manipulere spesifikke trasé i en celle-autonome måte21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr som brukes i denne protokollen ble holdt under standard Hold forhold, og eksperimenter har blitt utført i henhold til håndtering retningslinjer og forskrifter i EU og regjeringen i øvre Bayern (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. utarbeidelse av plasmider blanding for electroporation
- Fortynne plasmider av interesse for sterilt vann og tilsett rask grønn beis lagerløsning [1 mg/mL]. Sørg for at den endelige konsentrasjonen av plasmider er ∼ 1 μg/μL. Tilsett flekken ved en konsentrasjon på ikke mer enn 3%, som det eneste formålet er å farge løsningen og visualisere ventrikkel injeksjon.
- En gang forberedt, blande det plasmider løsning av pipettering opp og ned adskillige timene eller av finger tapping. Oppbevares ved romtemperatur (RT) til bruk.
Merk: For electroporation av to plasmider i samme celle, sørg for at konsentrasjonen av hver enkelt plasmider som brukes i blandingen er minst 0,8 ng/μL med molar ratio på 1:1 for å oppnå 80% – 90% co-electroporation effektivitet.
2. forberedelser til injeksjon og electroporation prosedyre
- Forbered glasset blodkar (ytre diameter 1 mm, innvendig diameter 0,58 mm) nødvendig for injeksjon i nålen trekke apparatet.
- For å injisere riktig mengde plasmider (se over), dra kapillær ved en temperatur på 68,5 ° c med to lys og to tunge vekter (se tabell over materialer for avtrekker spesifikasjoner).
Merk: I tilfelle en annen avtrekker brukes, kalibrere kapillær å levere riktig volum av electroporation mix. - Sett injeksjons enheten manuelt til et injeksjons Trykk på 200 hPa (ved å dreie på pi-knotten) og konstant trykk på 0 hPa. Still inn injeksjons tiden manuelt i manuell modus og kontroller trykket med fotpedalen.
- Sett electroporation enheten til "LV-modus" med fem pulser på 54 – 57 V (25 MS hver med 1 s intervaller). Koble elektrodene til enheten.
- Forbered en fisk tank med rent fiskevann, hvor fisken vil bli vekket fra anestesi etter electroporation prosedyren. Aerate vannet ved å holde luft steinen festet til luft pumpen for hele utvinnings perioden til fisken er fullstendig vekket.
- Ta en vanlig kjøkken svamp og lage en langsgående kutt i svamp til å holde fisken i under injeksjon og electroporation prosedyre (se forrige publikasjon3).
Merk: Kjøkken svamp bør regelmessig vaskes eller byttes for å fjerne potensielle giftige kjemikalier. - Plasser en liten mengde høy ledende flerbruks ultralyd gelé ved siden av injeksjons-og electroporation oppsettet.
Merk: Dette vil sikre tilstrekkelig elektrisk ledningsevne, og følgelig, distribusjon av electroporated celler gjennom hele Telencephalon.
3. sebrafisk anestesi
- Før bedøvelsen, utarbeide en lagerløsning av anestesi med 0,2% MS222 i destillert vann og justere pH til 7 med Tris-HCl buffer. Fortynne denne lager 1:10 (i.e., å 0,02% MS222) benytter fisken vann.
- Bedøve fisken ved å holde dem i denne arbeids løsningen til bevegelsen av kroppen og gjellene avtar (typisk for et par minutter).
4. plasmider løsning injeksjon
- Fyll den tilberedte glass kapillær med 10 μL av plasmider oppløsning ved hjelp av microloader Tupper. Unngå dannelse av luftbobler inne i kapillær.
- Trykk på meny/endre kapillær på injeksjons enheten. Sett inn og fest nålen i nåle holde ren.
- Under en stereomikroskopet med en forstørrelse på 3,2 x eller 4X, kutt bare tuppen av kapillær med fine-end tang. Bytt injeksjons enheten fra endre kapillær modus til injeksjons modus, deretter Påfør trykk med en fot pedal for å sikre at den plasmider løsningen går lett ut av nålen og uten hindring.
- Overfør fisken fra holderen tanken til beholderen (plastboks) med bedøvelse løsning. Vent noen minutter til bevegelse av gjellene avtar.
- Plasser fisken i den pre-fuktet svamp med rygg side vendt opp. Utfør alle følgende injeksjons trinn under stereomikroskopet for å sikre nøyaktigheten av prosedyren.
- Ved hjelp av en dissekere mikro-kniv fra rustfritt stål med 40 mm cutting edge og 0,5 mm tykkelse, lage et lite hull i fisken skallen på bakre side av Telencephalon (figur 1B), like ved siden av grensen med optikk tectum.
Merk: Dette trinnet bør utføres nøye siden hullet skal være svært liten og overfladisk, gjennomtrengende utelukkende skallen, for å unngå hjerneskade. - Vipp fisken etter behov og orientere tuppen av glass kapillær mot skallen i riktig vinkel for å lette inntrengning av kapillær spissen gjennom hullet.
- Sett tuppen av kapillær gjennom hullet i skallen nøye til den når telencephalic ventrikkel (se figur 1B). Dette vil kreve inntrengning gjennom rygg ependymal celle lag. Vær spesielt forsiktig med å sette inn kapillær for dypt for å unngå kontakt med hjernevevet. Hold kapillær nøyaktig mellom halvkuler, resterende inne i ventrikkel like etter piercing i rygg ependymal lag.
Merk: Dette er en veldig delikat skritt. Nøyaktigheten av denne prosedyren er forbedret ved hjelp av pigmentering mutant linjer som brassy24, slik at bedre visualisering av glass kapillær posisjon under injeksjon. - Med kapillær spissen innsiden av ventrikkel, injisere plasmider løsningen ved å legge press med fotpedalen i ca 10 s, som tilsvarer ca 1 μL av plasmider løsning.
Merk: Ved endring av nål avtrekker, blodkar eller injeksjonssystem, skal systemet kalibreres for å alltid levere 1 μL av plasmider oppløsning. Kalibrering kan utføres ved å måle diameteren av plasmider dråpe utvist til en mineralolje (f. eks, parafinolje) og deretter beregne volumet av dråpe. Etter 10 s av injeksjon, bør det være ~ 1 μL av plasmider væske utvist i mineral oljen. - Bekreft suksessen til forrige trinn ved å observere spredningen av væske i hele ventrikkel.
5. electroporation
- Fjern fisken fra injeksjons oppsettet mens du fremdeles holder den i svamp.
- Dypp innsiden av spissen av elektrodene i ultralyd gelen.
- Dekk fisken Telencephalon med en liten mengde av ultralyd gel.
- Plasser fisken hodet mellom elektrodene, plassere den positive elektroden på ventrale siden av fisken hode og den negative elektroden på rygg side (figur 1C), mens du fremdeles holder fisken kroppen i svamp. Dette setter retningen på flyten av gjeldende nødvendig for å electroporate ependymoglia plassert ved subventricular sone.
- Trykk elektrodene forsiktig og nøyaktig mot Telencephalon (figur 1C). Administrer strømmen med fotpedalen. Hold elektrodene på plass til alle fem pulser er ferdige.
6. fisk Recovery
- La fisken komme seg i den tidligere forberedte, kontinuerlig luftet tanken til den våkner. Lidokain gel kan påføres på skallen for å avlaste noen muligens utviklet smerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne electroporation metoden tillater levering av plasmider DNA til ependymoglial celler, som ligger overfladisk i sebrafisk Telencephalon og like under rygg ependymal celle lag (figur 1a).
Hvis resultatet av electroporation er positivt, kan merket enkelt ependymoglial celler (røde celler i figur 2a, b) observeres blant andre ependymoglial celler (hvit i figur 2a, b). Avhengig av effektiviteten til electroporation prosessen, kan en høyere (figur 2a) eller lavere (figur 2b) antall ependymoglial celler merkes. Likevel gir denne protokollen høyere antall merkede celler enn tidligere utgitt20, som er tydelig i figur 3a og Video 1. Det er verdt å nevne at den høyeste tettheten av merket celler har en tendens til å dukke mest på indre, ventrikkel siden av begge halvkuler (figur 3a), på grunn av måten injisert plasmider væsken distribuerer mellom halvkuler. I Video 1, en halvkule av sebrafisk Telencephalon er presentert i 3D, og ependymoglial celler med radial prosesser kan sees fra siden. Cellene er co-electroporated og merket med to plasmider, tdTomato-mem (rødt fluorescerende protein forankret til cellemembranen) og H2B-YFP plasmider (merking kjerner). Celledelingen av to kjerner omgitt av gule sirkler bør bemerkes.
Mislykket electroporation resulterer i svært lavt tall eller ingen merkede ependymoglial celler. Dette utfallet kan generelt forklares med unøyaktig injeksjon, der tuppen av kapillær ikke trenger inn i rygg ependymal celle lag. I dette tilfellet plasmider løsningen sprer seg over rygg ependymal celle lag i stedet for å fylle telencephalic ventrikkel. Dette fører til ependymal celler som bare merkes (figur 3b). Rygg ependymal celler (blå piler i figur 3b) skiller morfologisk fra ependymoglial celler (gul pil i figur 3a). Deres Soma er større og Cuboid, og de ikke besitter radial, langstrakte prosesser. Dette er tydelig fra å sammenligne en sidevisning av ependymoglial celle laget (figur 4a, B). TdTomato-mem merkede celler er mest sannsynlig ependymal celler, som er plassert over laget av ependymoglia (figur 4b). Til sammenligning, i figur 4a, introduseres en tdTomato-mem som uttrykker plasmider til individuelle ependymoglial celler. Dermed uttrykker de tdTomato-mem i tillegg til deres første merking (i dette tilfellet, transgene GFAP: GFP Fish line, sett her i hvitt).
Denne protokollen gjør det mulig å merke og etterfølgende følgende av oppførselen til ependymoglial celler i sebrafisk Telencephalon etter skade over en kort-21 eller lang sikt3 periode. Dette oppnås gjennom Live, in vivo Imaging og hjelper ta opp spørsmålet om deres roller i regenerering og neurogenesis.
Figur 1: skjematisk fremstilling av koronale delen av vrenges ut sebrafisk Telencephalon. (A) ordningen med en koronale del av sebrafisk Telencephalon, fremhever plasseringen av ependymoglial celler, som er lining ventrikkel overflate og bygge ventrale ventrikkel veggen. Rygg ependymal lag er å bygge bro over de to halvkuler og dekker ventrikkel (V), som ligger i mellom to celle lag: ependymoglial og ependymal. Svart pil og representasjon av øyet indikerer visning er vist i figur 2 og Figur 3. (B) på venstre, et fotografi av sebrafisk hodet tatt ovenfra, fremhever plasseringen av Telencephalon med en hvit stiplet linje. En glass kapillær er avbildet i rødt, sammen med målområdet for kapillær innsetting. Avbildet til høyre er en skjematisk av sebrafisk hjernen viser plasseringen av plasmider injeksjon i rødt. Det bør bemerkes at glasset kapillær ikke berører Telencephalon og at plasmider injiseres like over Telencephalon inn i ventrikkel. T = Telencephalon, OT = optikk tectum. (C) avbildet til venstre er et bilde av sebrafisk hode (sidevisning), og til høyre er en skildring av hodet (sidevisning) som viser posisjonen til elektrodene for å målrette Telencephalon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: micrographs viser effektive electroporation utfall. Tredimensjonal representasjon av a (a) større eller (B) mindre antall electroporated ependymoglial celler i den voksne sebrafisk Telencephalon, sett ovenfra. Electroporation ble gjort i TG (GFAP: GFP) fisk linje uttrykker GFP fluorescerende protein (avbildet i hvitt) i alle ependymoglial celler. Individuelle electroporated celler er merket med pCS2-tdTomato-mem plasmider3. Skala bars = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: konfokalmikroskopi micrographs som viser forskjellen mellom vellykket og mislykket electroporation. (A) tre-dimensjonale konfokalmikroskopi bilde av BABB-ryddet sebrafisk TELENCEPHALON (Ref) med et stort antall PCer-tdTomato-mem electroporated ependymoglial celler. Den morfologi av ependymoglial celler med lange, langstrakte prosesser (gule piler) bør bemerkes. Begge telencephalic halvkuler, markert med gule stiplede linjer, kan observeres. (B) konfokalmikroskopi bilde av mislykket electroporation av PCS2-tdTomato-mem plasmider. Mostly rygg ependymal celler er merket, og få ependymoglial celler uttrykke tdTomato-mem plasmider. Den klare forskjellen i morfologi av ependymal celler (blå piler) bør bemerkes. Skala bars = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:3D lateral visning av electroporated og ikke-electroporated ependymoglial celler. (A) tredimensjonal lateral representasjon electroporated ependymoglial celler, positiv for både TG (GFAP: GFP) og pCS2-tdTomato-mem (gul pil). (B) 3D lateral representasjon av mislykkede electroporation. Plasseringen av pCS2-tdTomato-mem positive celler over TG (GFAP: GFP) ependymoglia laget bør bemerkes. Mest sannsynlig rygg ependymal lag celler var electroporated (blå pil). Skala bars = 30 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1:3D-film av sebrafisk Telencephalon og electroporated ependymoglial celler. Video viser en halvkule av sebrafisk Telencephalon i 3D. Ependymoglial celler er co-electroporated med to plasmider: tdTomato-mem (rødt fluorescerende protein forankret til cellemembranen) og H2B-YFP plasmider (merking kjerner). Individuelt merket ependymoglia med radial prosesser som kan observeres fra side. Gule sirkler fremhever ependymoglial celle med mitotisk figur som er bilde av H2B-YFP-merket kromatin. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne electroporation protokollen er en pålitelig in vivo-metode for merking av individuelle ependymoglial celler. Protokollen kan trenge en ytterligere tilpasning for å merke andre celletyper som nevroner eller oligodendrocytes. For å oppnå vellykket merking, kan plasmider som inneholder ulike arrangører brukes. Chicken-beta utgangen promoter, eF1alpha, CMV og ubiquitin promoter har tidligere blitt brukt til å drive uttrykk for ulike transgenes i ependymoglia og deres avkom23. Imidlertid ble det observert forskjellige Kinetics av transgene uttrykk som bør tas inn i kontoen. For eksempel, CMV promoter drevet transgene uttrykk er veldig fort (uttrykket kan sees etter 24 h), mens eF1alpha tar lengre tid. Bortsett fra merking, kan electroporation protokollen brukes som en rask og grei plattform av genredigering med bruk av grobunn recombinase eller CRISPR Cas9 teknikker22. Videre, bruk av flip-kassett25-inneholdende plasmider og deres electroporation i celle type-spesifikke grobunn linjer kan tjene som en klar forlengelse av en metode som tillater merking eller gen-redigering i ependymoglial avkom generert etter electroporation.
Denne protokollen har flere kritiske trinn. Først under injeksjon trinn, må den eksperimentelle være forsiktig at injisert plasmider beløpet er lik for hver enkelt fisk, slik at antall merkede celler forblir sammenlignbare lignende. Dette kan oppnås ved å kontrollere størrelsen på glass kapillær åpningen, noe som betyr at snittet av hvert tips bør være konstant mellom forskjellige blodkar eller kalibrering bør utføres for hver enkelt kapillær. I tillegg bør varigheten av injeksjon, reguleres av en fot pedal, være den samme for hver enkelt injeksjon. For det andre er riktig posisjon av et hull i skallen laget med mikro-kniven avgjørende for riktig dispersjon av plasmider væske gjennom hele Telencephalon. Det er like viktig å trenge inn i rygg ependymal celle lag med kapillær spissen, som angitt i protokollen. Dessuten er det også viktig at hullet som skapes ikke er for stort til å forhindre at plasmider blanding og spinalvæske lekker ut av Telencephalon. Et annet kritisk trinn er styrken av anvendt elektrisk strøm. Det er viktig å sørge for at electroporation enheten fungerer så nøyaktig som mulig, slik at styrken på anvendt strøm ikke avviker mye fra spenningen som vises på skjermen, som ikke alltid er nøyaktig. Hvis disse verdiene ikke er konsekvente, er det nødvendig å justere styrken på strømmen på electroporation enheten, siden en administrert strøm høyere enn den anbefalte 54-57 V kan kompromittere fiske overlevelse.
Sammenlignet med andre metoder for plasmider levering og cellemerking som vanligvis brukes i felten, har electroporation åpenbare fordeler. Til tross for de kritiske trinnene som er nevnt ovenfor, skjer det svært sjelden at ingen electroporated celler kan observeres eller at rygg ependymal celler feilaktig electroporated. Vanligvis, suksessen rate av denne electroporation protokollen er 90%-95% og vi observerer nært nei TUNEL + celler etter electroporation. I motsetning til lipofection for eksempel under electroporation, kationiske liposomer (f. eks, lipofectamine) ikke brukes, og dermed toksisitet forbundet med bruken er helt unngått26. Det ble tidligere rapportert at lipofection og electroporation har like effektivitets rater (20-50 celler per Telencephalon)27. Imidlertid gir denne optimaliserte protokollen vanligvis 100-200 celler per Telencephalon. I forhold til viral vektorer, biosafety er ikke et problem med electroporation.
I tillegg brukte AAVs eller lentiviruses ikke klarer å produsere synlig uttrykk for transgenes i sebrafisk Brain17,28. Til slutt, til tross for det grobunn-LOX system er nå til dags vanligvis anvendt inne sebrafisk, plasmider electroporation er hurtigere siden den er ikke forlange lang venter timene på krevd for fisken formering og voksing og innrømmer individ cellen merking og tracing. Imidlertid krever en slik teknikk svært dyktige forskere for å oppnå vellykket electroporation og høy overlevelse av eksperimentelle dyr (vi vanligvis opplever overlevelse på ~ 70%-80%). Denne prisen har også en tendens til å svinge avhengig av eksperimentator. Læring prosedyren krever praksis og vanligvis tar tre forsøk. Dette er imidlertid avhengig av den manuelle fingerferdighet av den enkelte og kan ta lengre tid i noen tilfeller.
Den presenterte electroporation-protokollen er en rask, svært effektiv metode for å electroporating et stort antall ependymoglial celler med de nødvendige forholdsregler for å oppnå optimale resultater. Electroporation av den voksne sebrafisk Telencephalon er avgjørende for å visualisere individuelle ependymoglial celler og studere deres roller i neurogenesis og gjenfødelse prosesser. Nylig har suksess blitt oppnådd i samtidig avbrudd av flere gener av den voksne sebrafisk Telencephalon gjennom genredigering via electroporation og StagR-Cas9 teknikker22. Dette åpner mange muligheter og fremtidige anvendelser av electroporation for et bredt spekter av genetiske manipulasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Spesiell takk til James Copti for redigering av manuskriptet. Vi har også takknemlig erkjenner finansiering til JN fra German Research Foundation (DFG) av SFB 870 og SPP "Integrative Analysis of luktesans" og SPP 1738 "Emerging roller av ikke-koding RNAs i nervesystemet utvikling, plastisitet & sykdom", SPP1757 " Gliacellene heterogenitet ", og Excellence Strategy innenfor rammen av München Cluster for Systems nevrologi (eks 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
