Summary
Dans cette étude, nous décrivons une procédure détaillée de la fibrose intestinale TNBS-négociée, qui montre la pathophysiologie comparable à Crohn' fibrose de s. Nous discutons également cette approche à la lumière de la rapamycine a facilité des effets inhibiteurs sur la fibrose intestinale.
Abstract
Des études significatives ont été menées pour comprendre la gestion efficace de la fibrose intestinale. Cependant, le manque de meilleure connaissance de la fibrose a entravé le développement d'un médicament préventif. Principalement, trouver un modèle animal approprié est difficile en comprenant le mécanisme de crohn's-associé la pathologie intestinale de fibrose. Ici, nous avons adopté une méthode efficace où l'exposition chimique de TNBS aux rectums de souris produit l'ulcération sensiblement profonde et l'inflammation chronique, et les souris développent alors chroniquement la fibrose intestinale. En outre, nous décrivons une technique où une injection de rapamycine montre des effets inhibiteurs sur la fibrose TNBS-négociée dans le modèle de souris. Pour évaluer le mécanisme sous-jacent de la fibrose, nous discutons méthodiquement d'une procédure pour purifier les cellules Cx3Cr1MD à partir de la propria lamina des souris traitées et témoins de TNBS. Ce protocole détaillé sera utile aux chercheurs qui étudient le mécanisme de la fibrose et ouvrir la voie à la recherche d'une meilleure invention thérapeutique pour la fibrose intestinale associée à Crohn.
Introduction
Dysregulation de l'homéostasie immunitaire dans l'intestin conduit à une inflammation pathogène et a été largement connu pour causer une maladie inflammatoire de l'intestin (IBD)1,2. La fibrose intestinale est une conséquence chronique des maladies inflammatoires de l'intestin (MII), comme la maladie de Crohn (CD)3. La pathophysiologie irréversible de CD inclut la restriction intestinale ou la sténose de la fibrose, qui limite des options de traitement, et sans médicaments actuellement disponibles, le seul traitement est chirurgie. En fin de compte, le développement de thérapies efficaces pour contrer l'inflammation inappropriée est très nécessaire pour étudier le mécanisme de La CD, et cela nous mènera un pas de plus vers cela.
Une variété de modèles génétiques de souris sont disponibles pour étudier IBD comprenant IL10 KO, SAMP/Yit et Le transfert de cellules élevées de CD45etRB adoptif dans des souris de SCID4,5,6. Ici, nous montrons la procédure pour la fibrose TNBS-négociée dans le modèle de souris de CD, qui est comparable à la pathologie de la fibrose humaine de Crohn. Le modèle induit par le TNBS présente certains avantages. Ce modèle est techniquement simple; l'onde de la maladie est rapide, peu coûteuse et pourrait être largement utilisée chez différents animaux (p. ex., souris, rat et cobaye7). La co-administration de l'éthanol et du TNBS (2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid) endommage brusquement la barrière intestinale et expose la protéine de tissu du côlon au TNBS et suscite des réponses immunologiques substantielles8,9. L'exposition répétée de TNBS mène à un processus de réparation surréactif répondant à l'inflammation et aux dommages, et développe une réaction fibrotique dans l'intestin. Ainsi, le modèle de fibrose TNBS-induit sert à être un modèle très convaincant pour étudier crohn's-associé fibrose intestinale.
En outre, les phagocytes mononucléaires sont les cellules primaires qui arbitrent la réponse immunitaire innée à la pathogénie et aux dommages dans l'intestin10,11,12,13. Pour élucider le mécanisme cellulaire et pour établir le rôle des phagocytesmononucléaires Cx3Cr1 dans le modèle de fibrose TNBS, nous montrons la procédure de purification des phagocytes mononucléaires. L'analyse descellules Cx3Cr1 est une étape essentielle afin d'évaluer les marqueurs inflammatoires et de déterminer le mécanisme concomitant de la fibrose intestinale. Collectivement, cette procédure détaillée pour la fibrose de TNBS sera utile pour expliquer les mécanismes cellulaires de la fibrose intestinale.
Protocol
Pour ce manuscrit, tous les échantillons humains ont été achetés selon le protocole approuvé par la Commission d'examen de l'Institut (IRB) et par le Comité de recherche humaine du Albany Medical College. Toutes les recherches impliquant des animaux ont été strictement suivies selon le protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Albany Medical College ainsi que le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals .
1. Collecte de spécimens intestinaux humains
- Recueillir des échantillons de tissus humains selon les protocoles du comité de recherche de l'institution.
- Procurer le tissu intestinal (iléocolonique) d'un patient de CD diagnostiqué avec la fibrose et des échantillons de contrôle des patients sans histoire des IBD.
- Utilisez une partie du tissu intestinal pour l'immunohistologie, une autre partie du tissu pour l'analyse de l'ARNm, et une dernière partie pour l'expression des protéines des gènes/marqueurs fibrotiques et cytokines.
- Pour l'analyse immunohistologique, fixez d'abord l'échantillon de tissu humain dans 4% de paraformaldéhyde pendant au moins 48 h, puis transférez-le dans un tube contenant 70% d'éthanol pendant au moins 16 h. Utilisez ce tissu fixe pour faire un bloc paraffine ment incorporé et coupez 5 'm de tissu épais sections à l'aide d'un microtome tissulaire.
- À l'aide d'un pinceau, étaler délicatement chaque section coupée sur une lame de verre pour la coloration.
- La section des tissus de tache glisse avec la tache trichrome pour détecter le dépôt de collagène, et avec la tache de SMA pour détecter des myofibroblastes (voir la section 3 pour l'information détaillée au sujet de trichrome et de coloration de SMA). Examiner les sections tachées au microscope léger.
- Traiter une autre partie de l'échantillon de tissu humain obtenu pour fabriquer du lysate protéique pour détecter l'AMS par tache occidentale (voir la section 7 pour obtenir des renseignements détaillés sur l'analyse de la tache occidentale).
- Obtenir l'ARN de la dernière partie de l'échantillon de tissu humain à l'aide d'un réactif d'extraction (Tableau des matériaux) et convertir l'ARNm en aDNc par RT-PCR.
- Analyser les gènes fibrotiques et cytokine par qPCR (voir la section 6 pour obtenir des renseignements détaillés sur la préparation de l'ARNm).
2. Induction de la fibrose TNBS et du traitement de la rapamycine chez la souris
- Effectuer des recherches sur les animaux selon les protocoles de recherche sur les animaux approuvés par l'établissement.
- Raser les souris adultes autour de la région du cou afin de pré-sensibiliser à TNBS par l'intermédiaire de l'exposition cutanée. Tremper le TNBS dans un coton-tige, puis appliquer le TNBS sur la zone rasée du cou de la souris.
REMARQUE : La présensibilisation est une étape très importante puisqu'elle améliore la réponse retardée d'hypersensibilité pour initier l'inflammation TNBS-négociée. - Huit jours après la présensibilisation, induisez la colite par l'administration intra-rectale une fois par semaine pendant six semaines. Appliquer quatre mg de TNBS (dans 25 % d'éthanol) à l'aide d'un lavement de 100 l à l'aide d'une seringue de 1 ml fixée à un cathéter en polyuréthane de 3,5 Français et donner aux souris témoins 100 l d'éthanol de 25 % seulement.
- Anesthésiez les souris au pentobarbital (25 mg/kg intrapéritonéal) ou exposez-les à 2,5 % d'isoflurane ainsi qu'à 1 L/min d'oxygène pendant l'administration du TNBS. Confirmer l'anesthésie en pinçant doucement les orteils et en recherchant une absence de réflexe.
- Utilisez un onduleur vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant que les souris sont sous anesthésie.
- Injecter de la rapamycine à 2 mg/kg/jour ou véhicule (5 % de Tween-20 et 4 % d'éthanol) tous les jours de la semaine pendant 3 à 6 semaines, intrapéritoneal, à la fois chez les souris témoins et traitées au TNBS.
- Utilisez l'intestin de souris post-traités de TNBS de 6 semaines pour analyser les essais extracellulaires comprenant l'histologie, la cytométrie de flux, le ballonnement occidental et l'extraction d'ARN. Pour récolter des organes, euthanasier les souris à l'aide de l'inhalation de CO2 et confirmer l'euthanasie par luxation cervicale.
- Pour récolter des organes, euthanasier les souris à l'aide de l'inhalation de CO2 et confirmer l'euthanasie par luxation cervicale. Après l'euthanasie, longitudinalement ouvrir la souris sur son côté ventral en utilisant des ciseaux de qualité chirurgicale et des forceps. Retirez le côlon entier du rectum à la zone terminale d'ilium. Transférer rapidement le côlon à froid 1x HBSS et laver le côlon à l'aide du même tampon.
- Mesurer et comparer les longueurs du côlon des souris témoins et traitées au TNBS. Faites cette étape aussi vite que possible pour éviter de sécher les colons afin d'éviter les décès cellulaires.
- Couper le côlon en petits morceaux et le conserver à -80 oC pour le stockage à des fins futures (analyse de l'ARN/tache occidentale). Utilisez un autre morceau du côlon pour l'analyse FACS.
- Assurez-vous de couper et de recueillir des échantillons de tissus coloniaux provenant de régions similaires du côlon des animaux témoins et traités par le TNBS.
REMARQUE : On s'attend à une mortalité de 10 % à 20 % avec l'inoculation du TNBS, bien qu'avec l'expérience, le taux de mortalité puisse être considérablement réduit.
3. Évaluation immuno-histopathologique de la fibrose intestinale
- Fixez les tissus humains et/ou souris dans 4 % de paraformaldéhyde pendant 48 h, puis transférez-les à 70 % d'éthanol pendant 16 h.
REMARQUE : Le paraformaldéhyde est un produit chimique neurotoxique afin d'éviter l'inhalation; utiliser un masque facial pendant qu'il l'utilise. - La paraffine intègre les tissus fixes du côlon, tranche à une épaisseur de 5 m, et met directement les tissus sur des lames de verre pour l'histologie.
- Effectuez des taches h et E et Trichrome Blue selon les instructions du fabricant pour détecter le collagène.
- En bref, d'abord déparaffiniser les sections en submergeant la diapositive contenant des sections dans deux chambres de xylène pendant 5 min dans chaque chambre.
- Rincer les lames avec 100% d'alcool pendant 1 min; répéter cette étape trois fois. Rincer à nouveau avec l'eau du robinet pendant 1 min.
- Par la suite, plongez les diapositives dans la solution préchauffée de Bouin à 56 oC pendant 60 min. La solution de Bouin est jaune en apparence; laver après avoir sorti les diapositives de la solution de Bouin dans l'eau du robinet pendant 3 min ou jusqu'à ce que les diapositives deviennent incolores.
- Immerger les toboggans dans la solution d'hématoxylin de Mayer modifié pendant 7 min à température ambiante.
- Glissez les lames en plongeant dans la tache Trichrome pendant 5-8 min. Immédiatement, rincer les glissières dans l'eau courante pendant 5-10 s pour enlever la tache trichrome excédentaire.
- Déshydrater les glissières avec 100% d'alcool pendant 1 min. Répétez cette procédure trois fois.
- Nettoyez les diapositives avec du xylène pendant 1 min et répétez l'étape 3x.
- Monts toboggans avec supports de montage (Tableau des matériaux).
- Maintenez soigneusement la feuille de couverture à une extrémité avec des forceps et laissez-la couvrir toute la section sans avoir de bulles. S'il y a quelques bulles, enlevez rapidement les bulles en tapant sur le bordereau.
- Utilisez l'immunostaining pour détecter l'AMS.
- Bloquer les sections du côlon en bloquant le tampon (0,2 % Triton X-100 et 5 % de sérum de chèvre normal en 1x PBS) pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber avec 100 l d'anticorps primaires dilués pour la SMA(Tableau des Matériaux)sur la solution de lame (0,2% Triton X-100 et 3% sérum de chèvre normal en 1x PBS; anti-SMA 1:200) à 4 oC pendant la nuit.
- Laver les sections trois fois avec 1x PBS.
- Utilisez la chèvre anti-souris IgG (H et L) conjuguée à Alexa Fluor 488 (Table of Materials) comme anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante.
- Laver les sections trois fois avec 1x PBS.
- Utilisez DAPI pour contrer le noyau pendant 5 min.
- Laver les sections trois fois avec 1x PBS.
- Montez les glissières avec le support fluorescent de montage (Table des matériaux),et scellez avec un coverslip utilisant le vernis à ongles.
- Acquérir des images à l'aide du microscope confocal LSM 880 et traiter des images à l'aide d'un logiciel de microscope.
- Quantifiez les images en prenant en moyenne plusieurs zones sélectionnées dans la même section avec ImageJ.
4. Isolement de la lame intestinale propria et purification de Cx3Cr1- phagocytes mononucléaires
- Ouvrir longitudinalement le côlon dans la solution de sel équilibré de Hank glacée (HBSS; Tableau des matériaux) et laver le côlon avec le même tampon.
- Couper environ 5 cm de petits morceaux de tissus du côlon à l'aide de ciseaux stériles dans HBSS.
- Transférer de petits morceaux de tissu du côlon dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de tampon pré-digestion (1x HBSS avec 5 % de FBS, 5 mM EDTA et 1 mM DTT), et secouer pendant 20 min à 100 tr/min dans un incubateur de 37 oC11.
REMARQUE : L'incubation du tissu colonique dans 37 oC à 100 tr/min permet une digestion efficace des tissus de collagène et un rendement élevé de cellules viables. - Jetez l'épithélium du côlon détaché en passant par une passoire cellulaire de 40 m.
- Recueillir le tissu restant de la passoire et les digérer davantage dans un tampon de digestion contenant du collagène de type IV et d'une DNase I(tableau des matériaux)en 1x HBSS avec 5 % de FBS pendant 20 min à 37 oC à 100 tr/min.
- Vortex les tissus digérés pendant environ 20 s et passer à travers une passoire à cellules de 40 m pour obtenir des fractions de lamina propria.
- Centrifugeles les fractions de lalaïquepropria pour granuléles vers le bas les cellules à 700 x g dans 4 oC
- Pour exclure les cellules mortes de la lamina propria utiliser un gradient de densité (Tableau des matériaux).
REMARQUE : Le support de gradient de densité utilisé ici (tableau des matériaux) peut causer la perte des cellules mononucléaires ; cependant, il enlève considérablement les cellules mortes de la préparation, ce qui augmente globalement la pureté.- Faites 100 mL chacune de 30% et 70% de densité de solutions multimédiagradient. Resuspendre les cellules obtenues dans 10 ml de la solution de 30% et superposer sur 5 ml de la solution de 70% dans un tube de 15 ml.
- Centrifuger le gradient dans un état sans frein à 1 000 x g et température ambiante. Recueillir la phase d'anneau blanc contenant des lymphocytes lamina propria, qui sera entre les 30% et 70% couches de gradient.
- Laver les cellules obtenues en se rependant dans le HBSS et la centrifugeuse à 500 x g, 20 oC, pendant 10 min. Re-suspendre les cellules dans le tampon FACS (tri des cellules activées par fluorescence) (PBS, pH 7,4, avec 1% BSA et 2 mM EDTA).
- Purifie les phagocytes mononucléaires de la purification des cellules collectées à l'aide de perles magnétiques et/ou de tri FACS.
- Purification magnétique
- Avant de tacher avec des anticorps, premier bloc de la surface cellulaire des cellules lamina propria en coucuba avec anti-souris CD16/CD32 Fc bloqueur pendant 15 min sur la glace.
- Incuber les cellules avec des anticorps anti-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) ainsi que des microbilles anti-PE (Table of Materials) pendant 30 min sur glace, pour capturer les cellules liées. Laver les cellules avec le tampon FACS.
- Passer les cellules liées par l'anticorps/perles à travers une colonne de tri cellulaire activée par magnétique dans un champ magnétique pour enlever les cellules non liées. Laver trois fois avec le tampon FACS. Retirez la colonne du champ magnétique et poussez le piston dans la colonne pour produire des cellules liées aux perles.
- Tri FACS
REMARQUE : Le tri FACS peut être utilisé au lieu de la purification magnétique. Même si la purification magnétique est une méthode facile et rentable, elle se limite à ne purifier que les cellules individuelles, et non pour les sous-populations de cellules. Par conséquent, pour isoler les sous-populations de cellules, la méthode de tri FACS est une méthode efficace de tri des cellules individuelles ainsi que des sous-populations de cellules.- Bloquer les cellules lamina propria avec anti-souris CD16/CD32 Fc blocker (Table of Materials).
- Cellules de tache en couvant avec des anticorps anti-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C, et mhCII.
- Trier à l'aide d'un cytomètre de débit FACS, gating pour CD11c-CD64- CD11b- Cx3Cr1- Ly6C- cellules pour purifier la population CX3Cr1 (P3 - P4).
- Purification magnétique
- Lyse tria les cellules pour la préparation totale de l'ARN et détectez les marqueurs cytokine et fibrotique (voir la section 6 pour la préparation de l'ARN et de l'ADNc).
- Analyser l'expression de l'ARNm des marqueurs fibrotiques et l'analyse inflammatoire de cytokine des suspensions unicellulaires isolées de la purification magnétique.
- Pour l'analyse FACS, bloquer les cellules avec anti-souris CD16/CD32 Fc bloqueur (Tableau des matériaux) avant de tacher avec des anticorps contre la surface ou les marqueurs intracellulaires.
5. Analyse de cytométrie de flux
- Coloration et analyse de la surface cellulaire
- Resuspendre 5-10 à 105 cellules lamina propria isolées dans 50 mL de tampon FACS (1 % de BSA, 2 mM EDTA en PBS, pH 7,4).
- Incuber les cellules avec anti-souris CD16/CD32 (Table of Materials) à une dilution de 1:50 pour bloquer les récepteurs Fc sur la glace pendant 10 min.
- Laver les cellules avec un tampon FACS de 500 l l à froid pour enlever les anti-CD16/CD32 non liés avant la coloration de la surface cellulaire.
- Suspensions unicellulaires du côlon de surface (106 cellules/50 ml) avec anticorps fluorescents à 1:100 dilution sur glace pendant 30 min pour évaluer la lamina propria du côlon.
- Laver les cellules étiquetées à l'abri de 500 lde de tampon FACS glacé deux fois pour éliminer les anticorps non liés.
- Analyser les cellules mononucléaires étiquetées par cytométrie de flux. Porte pour Live, puis pour FSCetSSC, suivi sa CD11bet Cx3Cr1, puis analyser d'autres marqueurs d'activation des macrophages, y compris MHCII, CD80, CD86 et CD40.
- Coloration et analyse de cytokine intracellulaire
- Pour la coloration intracellulaire de cytokine, fixer et perméabiliser les cellules de surface-tachées utilisant un kit de solution de fixation/perméabilisation (tableau des matériaux); s'il vous plaît suivre les instructions du fabricant pour des étapes détaillées.
- Gate lamina propria cellules pour Live, puis pour FSC-SSC- suivie par CD11b- Cx3Cr1-IL23- pour détecter le niveau intracellulaire de cytokine IL23 et CD11b- Cx3Cr1-IL1 détecter le niveau intracellulaire de cytokine IL1MD.
- Coloration et analyse de la SMA
- Laver les cellules avec un tampon FACS deux fois en centrifuge à 200 x g et 4 oC pendant 5 min pour enlever l'excès de tampon fixatif.
- Pour déterminer le niveau de l'AMA, perméabilize des cellules avec un kit de solution de fixation/perméabilisation (Tableau des matériaux).
- Incuber les cellules avec un anticorps anti-SMA-AF488(Tableau des matériaux)en utilisant 1:1,000 dilution sur la glace pendant 30 min.
- Lavez les cellules deux fois, puis faites l'analyse FACS. Porte pour la vie, FSCetSSC, suivi de la détection descellules de l'AMA dans les cellules du côlon.
6. Isolation d'ARN, RT-PCR, PCR en temps réel
- Isoler l'ARN des cellules purifiées MACS ou FACS ou des tissus excisés du côlon en les homogénéisant dans le réactif d'extraction (Tableau des matériaux).
REMARQUE : Utilisez des lunettes de sécurité et d'autres équipements de protection de laboratoire lorsque vous travaillez avec ce réactif, car il s'agit d'un irritant pour les poumons et la peau. Travaillez en toute sécurité dans une hotte. - Ajouter 0,5 l de glycogène sans RNase à partir de la solution de stock de glycogène de 20 g/mL (Tableau des matériaux) afin d'améliorer la récupération de l'ARN total avant de précipiter l'ARN avec l'isopropanol.
- Resuspendre la pastille d'ARN dans 50 oL d'eau libre de RNase(Tableau des matériaux)et incuber à 55 oC pendant 5 min pour dissoudre complètement le palais de l'ARN.
- Lisez les concentrations d'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre à 260 nm.
- Synthétiser l'ADNc à l'aide d'un ARN total de 1 g et d'un kit de synthèse de transcription inversée (Tableau des matériaux).
- Analyser l'expression des gènes à l'aide de 2 L d'ADNc comme modèles via PCR en temps réel. Utilisez un kit de 96-bien PCR plaque qPCR Master Mix (Table of Materials). Utilisez les valeurs CT pour calculer le changement de pli de l'abondance de l'ARN après la normalisation des valeurs GAPDH/HPRT.
7. Le ballonnement occidental
- Lyse tissu du côlon en utilisant RIPA tampon de lyse (1% NP40).
- Résoudre le lysate protéique dans un gel bis-Tris de 8 % à une tension constante de 80 V.
- Transférer le gel-protéine dans la membrane de nitrocellulose dans un tampon de transfert à froid fonctionnant à un courant constant de 50 mA pendant 2 h à 4 oC.
- Bloquer les régions non spécifiques sur la membrane transtitique transférée en utilisant 5 % de lait non gras dans le TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 0,05 % Tween-20) pendant au moins 1 h à température ambiante.
- Pour détecter les niveaux de l'AMS, incuber la membrane avec l'anticorps de détection primaire de la SMA à 4 oC pendant la nuit.
- Laver les membranes 3-4 fois à l'aide de TBST en intervalles de 15 min.
- Incuber avec un anticorps secondaire conjugué par HRP (1:10,000) dans 5 % de lait non gras dans le TBST.
- Développer des membranes à l'aide d'un kit de développement ECL.
- Normaliser les intensités de signal protéique avec GAPDH comme un contrôle de chargement pour l'analyse de la densitométrie.
8. Analyse statistique
- Analyser les données à l'aide d'un logiciel d'analyse de données de choix en comparant entre le type sauvage et les animaux KO.
- Considérez la valeur P de l'identifique de 0,05 à l'importance (P 'lt; 0.05; 'P 'lt; 'P 'lt; 'P 'lt; 0.001).
- Utilisez le test t de l'étudiant pour tester les différences entre deux groupes et le test ANOVA pour l'analyse entre plus de deux groupes.
Representative Results
Nous avons adopté le modèle de souris de colite de TNBS pour étudier et élucider les mécanismes sous-jacents de la fibrose intestinale8. Ici, nous avons effectué une étude détaillée de la colite médiée par TNBS, où le TNBS a été administré de façon rectale chaque semaine à des souris de type sauvage pendant six semaines comme représenté schématiquement (Figure 1A). Après six semaines de traitement TNBS, nous avons remarqué que les longueurs du côlon raccourcissent progressivement au cours du traitement tNBS, d'une moyenne de 5 à 0,5 cm dans le groupe témoin à 3 à 0,5 cm dans le groupe TNBS; une telle analyse quantitative de la longueur du côlon représente une réduction très apparente de la longueur du côlon (figure 1B). Pour nous assurer que le modèle de la maladie de TNBS Crohn est comparable au modèle de fibrose de Crohn humain et n'était pas un artefact lié à la méthodologie, nous avons analysé les marqueurs fibrotiques à plusieurs niveaux dans une étude détaillée de cours de temps pour l'injection de TNBS au type sauvage . L'accumulation de l'actine musculaire alpha-lisse (SMA) des cellules positives et des dépôts de collagène dans les couches submucosales ont été signalés dans la plupart des incidences de fibrose et est considéré comme une marque pour les événements fibrotiques14. Nous avons constaté que les sections du côlon des souris tNBS-traitées qui ont été souillées avec 'SMA ont montré une augmentation de 4-6 fois de la couche de submucosa du côlon positivement tachée avec 'SMA (Figure 1C). En outre, la coloration bleue Trichrome pour ces sections a également montré une augmentation de 2-4 fois, suggérant le dépôt significatif de collagène, qui valide la fibrose intestinale grave (figure 1D). Nous avons en outre évalué l'activation des myofibroblastes en détectant les cellules positives de l'AMA par l'analyse FACS chez les souris du côlon traitées par TNBS et avons constaté une accumulation significative de taches positives à l'AMA (Figure 1E). De plus, nous avons constaté une induction importante dans l'expression de l'AMS, du Col-I et du Col-III mesurée par l'analyse qPCR chez les souris traitées au TNBS(figure 1F). L'expression accrue de la protéine SMA dans l'analyse de tache occidentale a indiqué la fibrose accrue (figure 1G). Dans l'ensemble, le traitement cinétique TNBS offre la possibilité d'accéder à la réponse immunitaire putative dans les conditions chroniques, qui imite étroitement la condition de phase chronique de CD et est essentielle au développement de fibrose.
Pour comparer la fibrose de TNBS avec la fibrose associée de Crohn, nous avons analysé l'expression des marqueurs de fibrose et des cytokines dans la biopsie fraîche de tissu de l'ileum des patients présentant le CD actif ou sous remise. Remarquablement, nous avons trouvé l'induction marquée de l'épaississement des couches sMA-positives et le dépôt accru de collagène tel que détecté par la coloration trichrome dans les sections actives de CD (figure 2A). Nous avons également effectué l'analyse de la tache occidentale et confirmé l'induction de l'expression de l'AMA dans des échantillons de CD actifs (figure 2B). De plus, nous avons observé une induction significative de marqueurs de fibrose, y compris l'AMA, Col1, tel que détecté par l'analyse qPCR(figure 2C).
Ensuite, pour déterminer un mécanisme pour limiter la fibrose TNBS nous avons évalué les effets de la rapamycine, un inhibiteur pharmacologique de l'activité mTOR15,16. En conséquence, nous avons traité des souris avec le TNBS et la rapamycine et analysé le niveau de SMA et de collagène dans l'histologie du côlon et avons montré la mesure quantitative de la SMA et du collagène dans l'intrigue de densitométrie (Figure 3A). Nos données suggèrent que la rapamycine réduit la coloration positive de l'AMA dans la couche submucosal et diminue le dépôt de collagène. Pour valider et quantifier davantage les réponses fibrotiques, nous avons déterminé les expressions de l'AMC, du collagène et du TGF par qPCR, et l'expression de la SMA par cytométrie de flux dans le côlon traité par TNBS(figure 3B, 3C). Nous avons également montré Cx3Cr1- phagocytes mononucléaires induire une réponse immunitaire inflammatoire à la blessure9. Ainsi, nous voulions voir si l'administration de la rapamycine chez les souris traitées au TNBS pouvait inverser les effets inflammatoires et fibrotiques. Par conséquent, nous avons purifié Cx3Cr1- phagocytes mononucléaires résidents à partir de suspensions de cellules individuelles du côlon en utilisant des microbilles magnétiques (Figure 3D). Nous avons constaté une augmentation du niveau de p-p70 et p-S6 dans Cx3Cr1- phagocytes mononucléaires résidents par l'analyse de tache occidentale de souris tNBS-traitées, et ce niveau a été bloqué par la rapamycine (Figure 3E). En outre, nous avons constaté que le traitement de la rapamycine amortit l'IL-23 et l'IL-1 dans le groupe traité par TNBS (figure 3F). En outre, ces résultats élucident le mécanisme efficace impliqué dans l'induction de TNBS-fibrosis et ont prouvé que la rapamycine atténue l'induction de la fibrose.
Figure 1 : Une administration réussie du TNBS entraîne le développement de la fibrose intestinale chez la souris. A. Représentation schématique de diagramme du traitement hebdomadaire de TNBS donné aux souris sauvages-type. B. Images du côlon et mesure des longueurs du côlon des souris traitées au TNBS, récoltées sur les semaines 0, 2, 4 et 6 traitements post-TNSB. C-D. L'analyse histologique des sections de colon souillée avec l'anticorps anti-SMA pour l'activation des myofibroblastes et de la coloration bleue trichrome pour le collagène ; barre d'échelle de 100 m. E. L'analyse FACS pour identifier les cellules sMA-positives dans le côlon et la quantification des cellules sMA-positives. F. Marqueurs fibrotiques et cytokines détectés par qPCR. G. analyse de tache occidentale de 'SMA du lysate de deux points des souris TNBS-traitées et témoins. Ce chiffre modifié est réutilisé avec la permission de la publication précédente9 dans Mucosal Immunology, 2019 par Mathur et al. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : La fibrose tNBS est comparable à la fibrose intestinale associée à Crohn. R. Images représentatives des biopsies du côlon de contrôle, CD actif montrant une augmentation significative de la coloration bleu trichrome et de la coloration positive de l'AMA dans les couches submucosales, barre d'échelle de 50 m. B. Analyse de tache occidentale de l'expression et de la quantification de l'AMA. Analyse C. qPCR des marqueurs fibrotiques et des cytokines. Ce chiffre modifié est réutilisé avec la permission de la publication précédente9 dans Mucosal Immunology, 2019 par Mathur et al. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Le traitement de rapamycine améliore efficacement la fibrose TNBS-induite. A. Analyse histologique du côlon - images représentatives de la coloration myofibroblaste avec des taches d'anticorps anti-SMA et de collagène avec le bleu Trichrome, barre d'échelle de 100 m. Analyse B. qPCR de l'expression de l'AMM, du collagène et du TGF dans Control/ colons de souris traités par TNBS. C. FACS analyse de la SMA dans la suspension à cellule unique du côlon de souris traité avec le contrôle/TNBS. D. Schématique pour la purification des cellules Cx3Cr1de la fraction de propria de la lamina du côlon et de l'analyse FACS des cellules purifiées. E. Analyse de tache occidentale des niveaux de p-p70 et de p-S6 dans les phagocytes mononucléaires purifiés de Cx3Cr1MD des souris traitées avec TNBS et/ou rapamycine. F. qPCR analyse de l'expression dans les phagocytes mononucléaires cx3Cr1MD purifiés, qui produisent l'IL-23 et l'IL-1. Ce chiffre modifié est réutilisé avec la permission de la publication précédente9 dans Mucosal Immunology, 2019 par Mathur et al. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
La cicatrisation ou la réparation des tissus est un processus biologique étroitement réglementé17. Pendant les dommages de tissu avec un état chimique, mécanique et d'infection, une réponse inflammatoire déclenche le processus de réparation de tissu. Cependant, une réponse inflammatoire dysrégulée et pathologique conduit à développer des cicatrices ou une réaction fibrotique, qui pourrait altérer la fonction de réparation des tissus9,18,19. Ici, nous montrons la procédure pour le modèle animal de fibrose TNBS-induit, qui partage de manière significative la pathophysiologie avec la maladie humaine de Crohn. L'inoculation successive de l'exposition chimique de TNBS pour endommager l'épithélium de souris cause des ulcérations profondes et induit le développement de la fibrose. Avec un fiable, à faible coût, et l'induction rapide de l'début de la maladie, cette méthode est largement acceptée par de multiples groupes de recherche impliqués dans des études pour les lésions tissulaires, l'inflammation transmurique et l'axe intestin-cerveau.
Pour mettre en œuvre avec succès le modèle de fibrose TNBS, il y a plusieurs étapes essentielles. Par exemple, une posologie adéquate et le moment de l'administration du TNBS sont très importants. Une inoculation de TNBS de 6-8 semaines permet l'ulcération profonde de tissu et est fortement recommandée pour des études fibrotiques chroniques. Les selles sortantes de souris et le réflexe rétrograde du TNBS inoculé sont deux problèmes majeurs, qui pourraient avoir comme conséquence la livraison des doses variables aux souris. La pression douce près du rectum de souris peut aider à libérer des selles avant l'administration de TNBS. Maintenir la tête de l'animal vers le bas pendant quelques secondes aide considérablement à arrêter le reflux inverse de TNBS. Garder les souris dans une cage, placer la cage sur un coussin chauffant et fournir aux souris du nectar de Napa pourraient également être des stratégies utiles pour prévenir une mortalité élevée.
Ici, nous discutons également de l'inflammation d'intestin pendant la fibrose de TNBS et de leur impact sur la réponse fibrotique. le rôle de mTOR/autophagie est largement impliqué sur l'homéostasie intestinale et dans la pathogénie d'IBD20,21. Nous avons identifié que la signalisation mTOR/autophagie est essentielle pour moduler les réponses pro-inflammatoires des cytokines IL-23 et IL1MD de Cx3Cr1- phagocytes mononucléaires qui affectent l'axe pro-fibrotique IL-23/IL-22 (Figure 3A)9 . Par conséquent, la purification des cellules mononucléaires Cx3Cr1et Cx3Cr1 pour l'immunoprofiling et l'expression des gènes est une étape critique du modèle. Nous discutons en détail du protocole pour isoler lalame propria et fournissons la procédure de purification pour les cellules mononucléaires Cx3Cr1à l'aide de perles magnétiques.
Collectivement, malgré la présence de modèles génétiques et spontanés pour la maladie de Crohn, TNBS-colite reste un outil puissant pour étudier l'immuno-pathogénie de CD et a le potentiel d'évaluer les traitements de la fibrose de Crohn. La principale limitation de l'utilisation de modèles de fibrose induits chimiquement tels que le TNBS est la possibilité d'une grande variabilité d'un utilisateur à l'autre et la possibilité de valeurs aberrantes dans les données. Une taille d'échantillon de 5-8 animaux par groupe ainsi qu'une plus grande expérience utilisateur peuvent augmenter la cohérence du modèle. Cependant, la recherche d'un modèle génétique approprié causant la fibrose spontanée de Crohn est et sera toujours justifiée.
Disclosures
Intérêts contradictoires : Les auteurs ne déclarent aucun intérêt opposé.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH R01NS093045 (Y.H.), la subvention des NIH K08DK088950 (X.Z.), R03DK0956 (X.Z.), et la Crohn's and Colitis Foundation of America research Fellowship (CCFA) 481637 (R.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 | e-bioscience | 53-9760-82 | |
| Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 | e-bioscience | 149760-80 | |
| Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 | Biolegend Inc | 101226 | |
| Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 | Biolegend | 149006 | |
| Anti-mouse purified CD16/32 Fc block | Biolegend Inc | 14-9760-80 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-105-639 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | e-bioscience | 7074 | |
| Bovine Serum Albumin | InvivoGen | tlrl-isdn | |
| Collagenase type IV | Roche | 1088866001 | |
| DAPI | SIGMA | D9542 | |
| DMEM | Corning | 10013-CV | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | D263-5vl | |
| Falcon® 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit | BD Bioscience | 555028 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | www.flowjo.com | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | e-bioscience | 5018 | |
| Graphpad Prism 7 | GraphPad Software Inc | www.graphpad.com | |
| H&E kit | American Mastertech Kit | HXMMHPT | |
| Image J | NIH | www.imagej.nih.gov/ij/ | |
| Mouse: C57BL/6J | Jackson Laboratories | 664 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Percol | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| PMA/Ionomycin salt | Sigma | P8139 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermofisher | A25777 | |
| Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 | Cell signaling | 5174 | |
| Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 | Cell signaling | 2708 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 | Cell signaling | 9208 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E | Cell signaling | 4858 | |
| Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein | Cell signaling | 2217 | |
| Rapamycin | LC LABORATORIES | 1003799 | |
| TNBS | Sigma | 92823 | |
| Trichorme staining kit | American Mastertech Kit | STOSTBPT | |
| TRIzol | Life technologies | 15596018 | |
| Verso cDNA Synthesis Kit | Thermofisher | AB1453B | |
| Zen black 2.1 | Carl Zeiss | www.zeis.com | |
| Zen blue lite 2.3 | Carl Zeiss | www.zeis.com |
References
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