Summary
이 연구에서는, 우리는 Crohn의 섬유증에 비교병생리학을 전시하는 TNBS 중재장 섬유증의 상세한 절차를 기술합니다. 우리는 또한 라파마이신이 장 섬유증에 대한 억제 효과를 촉진에 비추어이 접근법을 논의합니다.
Abstract
장 섬유증의 효과적인 관리를 이해하기 위해 중요한 연구가 수행되었습니다. 그러나 섬유증에 대한 더 나은 지식의 부족은 예방 약물의 개발을 방해했습니다. 1차적으로, 적합한 동물 모형을 찾는 것은 Crohn의 관련되는 장 섬유증 병리의 기계장치를 이해에서 도전적입니다. 여기에서, 우리는 마우스 직장에 TNBS 화학 노출이 실질적으로 깊은 궤양 및 만성 염증을 생성하는 효과적인 방법을 채택하고, 마우스는 그 때 만성적으로 장 섬유증을 개발합니다. 또한, 우리는 라파마이신 주사가 마우스 모델에서 TNBS 매개 섬유증에 대한 억제 효과를 보여주는 기술을 설명합니다. 섬유증의 근본적인 기계장치를 평가하기 위하여는, 우리는 체계적으로 TNBS 처리및 대조마우스의 라미나 프로피로부터 Cx3Cr1+ 세포를 정화하는 절차를 토론합니다. 이 상세한 프로토콜은 섬유증의 기계장치를 조사하고 Crohn의 관련장 섬유증을 위한 더 나은 치료 발명을 찾아내기 위하여 경로를 포장하는 연구원에게 도움이 될 것입니다.
Introduction
장에서 면역 항상성의 이질조절은 병원성 염증을 유도하고 염증성 장질환(IBD)을 유발하는 것으로 널리 알려져 있다1,2. 장 섬유증은 크론병(CD)과 같은 염증성 장 질환(IBDs)의 만성적인결과이다 3. CD의 돌이킬 수 없는 병리생리학은 처리 선택권을 제한하는 창자의 장 협착 또는 협착을 포함하고, 현재 유효한 아무 약물도 없는, 유일한 처리는 수술입니다. 궁극적으로, 부적절한 염증에 대처하기 위한 효과적인 치료법의 개발은 CD의 메커니즘을 연구하는 데 많이 필요하며, 이것은 우리에게 한 걸음 더 가까이 다가갈 것입니다.
다양한 유전자 마우스 모델은 IL10 KO, SAMP/Yit 및 입양 CD45+RB 고세포 전지 전달을 포함한 IBD를 SCID 마우스4,5,6으로연구할 수 있다. 여기에서, 우리는 인간 크론의 섬유증의 병리학에 필적하는 CD의 마우스 모형에 있는 TNBS 중재한 섬유증을 위한 절차를 보여줍니다. TNBS 유도 모델은 특정 장점이 있습니다. 이 모델은 기술적으로 간단합니다. 질병 발병은 신속하고, 저렴하며, 상이한 동물(예를 들어, 마우스, 쥐 및 기니피그7)에서널리 사용될 수 있다. 에탄올과 TNBS (2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산)의 병용 투여는 장 장벽을 갑자기 손상시키고 결장 조직 단백질을 TNBS에 노출시키고 실질적인 면역학적 반응을유도하는 8,9. TNBS의 반복된 노출염증 및 부상에 응답 하는 과민 성 복구 프로세스에 이르게, 창 자에 섬유 반응을 개발. 따라서, TNBS-유도 섬유증 모델은 크론의 관련 장 섬유증을 연구하는 매우 매력적인 모델이 될 수 있다.
더욱이, 단핵식세포는10,11,12,13에서발병기전 및 상해에 대한 선천적인 면역 반응을 중재하는 1차 세포이다. 세포 메커니즘을 해명하고 TNBS 섬유증 모델에서 Cx3Cr1+ 단핵 식세포의 역할을 확립하기 위해, 우리는 단핵 식세포 정화의 절차를 보여줍니다. Cx3Cr1+ 세포의 분석은 염증 성 마커를 평가하고 장 섬유증에 대한 수반되는 메커니즘을 결정하기 위한 필수적인 단계입니다. 집합적으로, TNBS 섬유증을 위한 이 상세한 절차는 장 섬유증의 세포 기계장치를 설명하는 것을 도움이 될 것입니다.
Protocol
이 원고에 대 한, 모든 인간의 샘플 연구소 검토 위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 조달 되었다 (IRB) 그리고 알바니 의과 대학에서 인간 연구위원회에 의해. 동물과 관련된 모든 연구는 알바니 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회뿐만 아니라 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 엄격하게 수행되었습니다. .
1. 인간의 장 표본의 수집
- 기관의 연구위원회 프로토콜에 따라 인간 조직 샘플을 수집합니다.
- 섬유증으로 진단된 CD 환자의 장 조직(ileocolonic)을 조달하고 IBDs의 병력이 없는 환자로부터 샘플을 제어합니다.
- 면역학을 위한 장 조직의 부분, mRNA를 분석하기 위한 조직의 또 다른 부분 및 섬유성 및 사이토카인 유전자/마커의 단백질 발현을 위한 마지막 부분을 사용하십시오.
- 면역학 분석을 위해, 먼저 적어도 48 시간 동안 4% 파라포름알데히드에 인간 조직 견본을 고치고 적어도 16 시간 동안 70% 에탄올을 포함하는 관으로 옮김을 옮기십시오. 조직 마이크로토메를 사용하여 단면도를 사용한다.
- 브러쉬를 사용하여 유리 슬라이드의 각 컷 부분을 부드럽게 펴서 얼룩을 냅니다.
- 얼룩 조직 섹션 슬라이드 콜라겐 침착을 감지 하기 위해 trichrome 얼룩, 그리고 αSMA 얼룩 myofibroblasts를 감지 하기 위해 (참조 섹션 3 삼조 및 αSMA 염색에 대 한 자세한 내용은 참조). 가벼운 현미경으로 염색된 부분을 검사합니다.
- 수득된 인간 조직 샘플의 또 다른 부분을 처리하여 단백질 용해하여 서쪽 얼룩을 통해 αSMA를 검출합니다(웨스턴 블롯 분석에 대한 자세한 내용은 섹션 7 참조).
- 추출 시약(재료 표)을사용하여 인간 조직 샘플의 최종 부분에서 RNA를 얻고 RT-PCR을 통해 mRNA를 cDNA로 변환합니다.
- qPCR에 의하여 섬유성 및 사이토카인 유전자를 분석합니다(mRNA 준비에 대한 자세한 내용은 섹션 6 참조).
2. 마우스에서 TNBS 섬유증 및 라파마이신 치료의 유도
- 기관에서 승인한 동물 연구 프로토콜에 따라 동물 연구를 수행합니다.
- 진피 노출을 통해 TNBS에 미리 과민화하기 위하여 목 지역 의 주위에 성숙한 마우스를 면도하십시오. 면봉에 TNBS를 담근 다음 TNBS를 마우스 넥의 면도 부위에 바하십시오.
참고: TNBS 매개 염증을 개시하기 위하여 연기한 과민반응을 향상하기 때문에 사전 과민반응은 아주 중요한 단계입니다. - 8 일 사전 과민성, 6 주 동안 일주일에 한 번 직장 내 투여에 의해 대장염을 유도. 3.5 프렌치 폴리우레탄 카테터에 부착된 1 mL 주사기를 통해 100 μL 관장내를 사용하여 TNBS(25% 에탄올내)의 4 mg을 적용하고 대조군 마우스에게 25% 에탄올만 100 μL을 준다.
- 펜토바르비탈(25 mg/kg 복막)으로 마우스를 마취하거나 TNBS 투여 중 산소 1L/min과 함께 2.5% 이소플루란에 노출시다. 발가락을 부드럽게 꼬집고 반사가 없는 것을 찾아 마취를 확인하십시오.
- 쥐가 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 수의 연고를 사용합니다.
- 라파마이신을 2 mg/kg/day 또는 비히클(5% 트웬-20 및 4% 에탄올)에 매주 평일 3-6주 동안 주입하여 복강 내, 대조군 및 TNBS 처리 마우스모두에 주입합니다.
- 6주 TNBS 후 처리된 마우스 장에서 조직학, 유세포 분석, 서부 블로팅 및 RNA 추출을 포함한 세포외 분석방법을 분석합니다. 장기를 수확하기 위해CO2 흡입을 사용하여 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구로 안락사를 확인하십시오.
- 장기를 수확하기 위해CO2 흡입을 사용하여 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구로 안락사를 확인하십시오. 안락사 후 수술용 가위와 집게를 사용하여 복부 쪽에 마우스를 세로로 엽니다. 직장에서 말단 일륨 부위까지 결장 전체를 제거하십시오. 결장재를 얼음으로 차가운 1x HBSS로 빠르게 옮기고 동일한 버퍼를 사용하여 결장세척하십시오.
- 대조군 및 TNBS 처리 마우스의 결장 길이를 측정하고 비교한다. 세포 사망을 피하기 위해 결장밖으로 건조하지 않도록 가능한 한 빨리이 단계를 수행하십시오.
- 결장을 작은 조각으로 자르고 미래의 목적을 위해 -80 °C에서 보관하십시오 (RNA / 서쪽 얼룩 분석). FACS 분석을 위해 결장의 다른 부분을 사용합니다.
- 절단 하 고 제어 및 TNBS 처리 동물의 결장의 유사한 지역에서 결 장 조직 샘플을 수집 해야 합니다.
참고: TNBS 접종으로 10%-20%의 사망률이 예상되지만 경험으로는 사망률이 현저히 감소할 수 있습니다.
3. 장 섬유증의 면역 조직 병리학 평가
- 인간 및/또는 마우스 조직을 48시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정한 다음 16시간 동안 70% 에탄올로 옮김을 합니다.
참고 : 파라 포름 알데히드는 신경 독성 화학 물질이므로 흡입을 피하십시오. 사용하는 동안 얼굴 마스크를 사용하십시오. - 파라핀은 고정 된 결장 조직을 포함하고 5 μm 두께로 슬라이스하고 조직학을 위해 유리 슬라이드에 직접 조직을 놓습니다.
- 콜라겐을 검출하기 위해 제조업체의 지침에 따라 H&E 및 트라이크롬 블루 염색을 수행합니다.
- 간단히, 먼저 각 챔버에서 5 분 동안 자일렌의 두 챔버에 포함 된 섹션을 포함하는 슬라이드를 침수하여 섹션을 분리.
- 1 분 동안 100 % 알코올로 슬라이드를 헹구십시오. 이 단계를 세 번 반복합니다. 수돗물로 다시 1분 동안 헹구십시오.
- 그 후, 60 분 동안 56 °C에서 예열 된 Bouin의 용액에 슬라이드를 담그십시오. 3 분 동안 또는 슬라이드가 무색이 될 때까지 수돗물에 Bouin의 용액에서 슬라이드를 복용 한 후 씻어.
- 실온에서 7분 동안 수정된 메이어의 헤마톡실린 용액에 슬라이드를 담그십시오.
- 5-8 분 동안 트리크롬 얼룩에 침지하여 얼룩 슬라이드. 즉시, 여분의 트리크롬 얼룩을 제거하기 위해 5-10s에 대한 흐르는 물에 슬라이드를 헹구십시오.
- 1 분 동안 100 % 알코올로 슬라이드를 탈수하십시오.
- 자일렌으로 슬라이드를 1분 동안 지우고 3x 단계를 반복합니다.
- 장착 매체가 있는 슬라이드를 장착합니다(재료표).
- 포셉으로 한쪽 끝에 커버 슬립을 조심스럽게 잡고 거품없이 전체 섹션을 덮도록하십시오. 거품이 있는 경우 커버슬립을 눌러 거품을 빠르게 제거합니다.
- αSMA를 검출하기 위해 면역 염색을 사용하십시오.
- 실온에서 1시간 동안 차단 완충제(0.2% 트리톤 X-100 및 1x PBS에 5% 정상 염소 혈청)에서 결장 부분을 차단합니다.
- 슬라이드 용액에 αSMA(재료 표)에대한 희석 된 1 차 항체 100 μL로 배양 (0.2 % 트리톤 X-100 및 1 x PBS에서 3 % 정상 염소 혈청; 항 αSMA 1:200)에서 밤새 4 °C.
- 1x PBS로 섹션을 세 번 씻으소서.
- 실온에서 2시간 동안 이차 항체로서 알렉사 플루어 488(물자표)과접합된 염소 항 마우스 IgG(H+L)를 사용한다.
- 1x PBS로 섹션을 세 번 씻으소서.
- DAPI를 사용하여 5분 동안 핵을 염색합니다.
- 1x PBS로 섹션을 세 번 씻으소서.
- 형광 마운팅 매체(재료 표)로슬라이드를 장착하고 매니큐어를 사용하여 커버 슬립으로 밀봉하십시오.
- LSM 880 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득하고 현미경 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다.
- ImageJ를 사용하면 동일한 섹션에서 선택한 여러 영역의 평균을 취하여 이미지를 정량화합니다.
4. 장 내 라미나 프로피아의 분리 및 Cx3Cr1+ 단핵 식세포의 정제
- 얼음 차가운 행크의 균형 잡힌 소금 솔루션 (HBSS)에서 결장열립니다. 재료 표) 동일한 버퍼로 콜론을 세척하십시오.
- HBSS에서 멸균 가위를 사용하여 결장 조직의 약 5cm 작은 조각을 잘라.
- 10 mL의 사전 소화 완충액(5% FBS, 5 mM EDTA 및 1 mM DTT를 함유한 1x HBSS)을 함유하는 50 mL 원엽 튜브에 작은 결장 조직 조각을 옮기고, 37°C 인큐베이터11에서100 rpm에서 20분 동안 흔들어.
참고 : 100 rpm 흔들림 상태에서 37 °C에서 대장 조직을 배양하면 효율적인 콜라게 나아제 조직 소화와 생존 가능한 세포의 높은 수율을 허용합니다. - 40 μm 세포 여과기를 통과하여 분리 된 대장 상피를 폐기하십시오.
- 여비과기로부터 남은 조직을 수집하고 콜라게나아제 타입 IV 및 DNase I(물질표)를함유하는 소화 완충액에서 추가로 소화하고 100 rpm에서 37°C에서 20분 동안 5% FBS로 1x HBSS를 함유한다.
- 약 20 s에 대 한 소화 된 조직 소용돌이 및 40 μm 세포 여과기를 통과 하 여 라미나 프로피아 분획을 얻을 수 있습니다.
- 4 °C에서 700 x g에서 세포를 펠렛에 라미나 프로프리아 분획을 원심 분리기
- 라미나 프로피아에서 죽은 세포를 제외하려면 밀도 그라데이션(재료표)을사용한다.
참고 : 여기에 사용되는 밀도 구배 매체(재료 표)는단핵 세포의 손실을 일으킬 수 있습니다. 그러나, 그것은 크게 준비에서 죽은 세포를 제거, 이는 전반적인 순도를 증가.- 각각 30% 및 70% 밀도 그라데이션 미디어 솔루션을 100mL로 만듭니다. 30% 용액의 10 mL에서 얻은 세포를 재중단하고 15 mL 튜브에서 70% 용액의 5 mL 위에 오버레이한다.
- 1,000 x g 및 실온에서 브레이크가 없는 상태에서 그라데이션을 원심분리합니다. 30 % 및 70 % 그라데이션 층 사이에있을 것이다 라미나 프로피아 림프구를 포함하는 흰색 링 상을 수집합니다.
- 500 x g,20 °C에서 얼음 차가운 HBSS 및 원심 분리기를 다시 일시 중단하여 얻은 세포를 10 분 동안 FACS (형광 활성화 세포 선별) 버퍼 (PBS, pH 7.4, 1 % BSA 및 2 mM EDTA)에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.
- 자기 비드 및 / 또는 FACS 선별을 사용하여 수집 된 세포에서 단핵 식세포를 정화합니다.
- 자기 정화
- 항체로 염색하기 전에, 제1 블록 세포 표면을 얼음에 15분 동안 항마우스 CD16/CD32 Fc 차단제로 인큐베이팅하여 라미나 프로피아 세포의 표면을 배양하였다.
- 항-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) 항체와 함께 항 PE 마이크로 비드(재료 표)를얼음에 30 분 동안 배양하여 경계 세포를 포획합니다. FACS 버퍼로 세포를 씻으하십시오.
- 자기장의 자기 활성화 세포 정렬 컬럼을 통해 항체/비드 경계 세포를 통과하여 언바운드 셀을 제거합니다. FACS 버퍼로 세 번 씻으시고 세탁하십시오. 비드 바운드 셀을 생성하기 위해 컬럼의 자기장 및 푸시 플런저에서 컬럼을 제거합니다.
- FACS 정렬
참고 : FACS 정렬은 자기 정화 대신 사용할 수 있습니다. 자기 정화는 쉽고 비용 효율적인 방법이지만, 세포의 하위 집단이 아닌 단일 세포를 정화하는 것으로 제한됩니다. 따라서, 세포의 하위 모집단을 분리하기 위해, FACS 정렬 방법은 세포의 하위 집단뿐만 아니라 단일 세포를 정렬하는 효과적인 방법이다.- 안티 마우스 CD16 / CD32 Fc 차단제(재료의 표)와블록 라미나 프로프리아 셀.
- 항 CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C 및 MHCII 항체로 배양하여 세포를 얼룩.
- CX3Cr1(P3+ P4) 모집단을 정화하기 위해 FACS 유동 세포계를 사용하여, CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C에 대한 게이팅을 정렬한다.
- 자기 정화
- 총 RNA 제제를 위한 Lyse 분류된 세포를 검출하고 사이토카인 및 섬유성 마커를 검출합니다(RNA 및 cDNA 제제에 대한 섹션 6 참조).
- 자기 정제로부터 분리된 단세포 현탁액으로부터 섬유성 마커 및 염증성 사이토카인 분석의 mRNA 발현을 분석한다.
- FACS 분석을 위해, 표면 또는 세포 내 마커에 대하여 항체로 염색하기 전에 반대로 마우스 CD16/CD32 Fc 차단제(물자의 표)를가진 세포를 막습니다.
5. 유세포 분석
- 세포 표면 염색 및 분석
- FACS 완충액 의 50 mL에서 5-10 × 105 단리 라미나 프로피아 세포를 다시 일시 중단하십시오 (1 % BSA, PBS에서 2 mM EDTA, pH 7.4).
- 반대로 마우스 CD16/CD32(재료의 표)를가진 세포를 1:50 희석하여 얼음에 있는 Fc 수용체를 10분 동안 차단합니다.
- 500 μL의 얼음 차가운 FACS 버퍼로 세포를 세척하여 세포 표면 염색 전에 언바운드 안티 CD16/CD32를 제거합니다.
- 표면 얼룩 결장 단세포 현탁액 (106 세포 / 50 mL) 형광 표지 항체와 얼음에 1:100 희석 30 분 대장 라미나 프로프리아를 평가.
- 500 μL의 얼음 차가운 FACS 버퍼로 표지 된 세포를 두 번 씻어 언바운드 항체를 제거하십시오.
- 유세포분석에 의해 표지된 단핵 세포를 분석한다. 라이브 게이트, 다음 FSC+SSC+ CD11b+ Cx3Cr1+다음에, 다음 MHCII, CD80, CD86 및 CD40을 포함한 다른 대식세포 활성화 마커를 분석합니다.
- 세포내 사이토카인 염색 및 분석
- 세포내 사이토카인 염색의 경우, 고정/퍼메아빌화 용액키트(재료 표)를사용하여 표면 염색 된 세포를 수정하고 투과화하십시오. 자세한 내용은 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 라이브용 게이트 라미나 프로피리아 셀, FSC+SSC+에 이어 CD11b+ Cx3Cr1+IL23+ IL23 의 세포 내 수준을 검출하여 IL23 사이토카인 및 CD11b+ Cx3Cr1+IL1β+ IL1β 사이토카인의 세포내 수준을 검출합니다.
- αSMA 염색 및 분석
- FACS 버퍼로 세포를 200 x g 및 4°C에서 원심분리하여 5분 동안 세척하여 과도한 고정 버퍼를 제거합니다.
- αSMA 레벨을 결정하려면 고정/퍼메아빌화 솔루션키트(재료 표)로셀을 투과합니다.
- 항 αSMA-AF488 항체(재료표)로세포를 배양하여 얼음에 1:1,000 희석을 사용하여 30 분 동안.
- 세포를 두 번 세척한 다음 FACS 분석을 수행합니다. 라이브, FSC+SSC+에 대한 게이트는 콜로닉 세포에서 αSMA+ 세포의 검출에 의해 뒤따릅니다.
6. RNA 절연, RT-PCR, 실시간 PCR
- MACS 또는 FACS 정제 세포 또는 결장 절제 조직을 추출 시약에서 균질화하여 RNA를 분리합니다(재료표).
참고: 폐와 피부 자극제이기 때문에 이 시약으로 작업할 때는 안전 고글과 기타 실험실 보호 장비를 사용하십시오. 후드에서 안전하게 작업할 수 있습니다. - 20 μg/mL 글리코겐 스톡 솔루션(표)에서 RNase-free 글리코겐 0.5 μL을 첨가하여 RNA를 이소프로판올로 침전시키기 전에 총 RNA의 회수를개선합니다.
- RNA 펠릿을 RNase 자유물(재료표)의50 μL에서 다시 중단하고 55°C에서 5분 동안 배양하여 RNA 구개를 완전히 용해시다.
- 260 nm에서 분광광도계를 사용하여 RNA 농도를 읽습니다.
- 총 RNA 1 μg 및 역전사 합성키트(물자 표)를사용하여 cDNA를 합성한다.
- 실시간 PCR을 통해 cDNA의 2 μL을 템플릿으로 사용하여 유전자 발현을 분석합니다. 96웰 PCR 플레이트 qPCR 마스터 믹스키트(재료 표)를사용하십시오. CT 값을 사용하여 GAPDH/HPRT 값을 정규화한 후 RNA 풍부도의 배 변화를 계산합니다.
7. 웨스턴 블로팅
- RIPA 용해 완충액을 사용하여 결장 조직을 용해 (1% NP40).
- 80V의 일정한 전압에서 8% 비스-트리스 젤로 단백질 을 풀어주세요.
- 4°C에서 2시간 동안 50 mA의 일정한 전류에서 실행되는 차가운 전달 완충액에서 겔 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮김을 전달합니다.
- TBST에서 5% 비지방 우유(25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1.5 M NaCl, 0.05% 트위엔-20)를 사용하여 실온에서 적어도 1시간 동안 단백질 이송막상에서 비특이적 영역을 차단한다.
- αSMA 수준을 검출하기 위해, αSMA 1차 검출 항체를 밤새 4°C에서 배양한다.
- 15 분 간격으로 TBST를 사용하여 멤브레인을 3-4 회 씻으하십시오.
- TBST에서 5% 무지방 우유에 HRP-컨쥬게이트 이차 항체(1:10,000)로 배양합니다.
- ECL 개발 키트를 사용하여 멤브레인을 개발합니다.
- 고밀도 분석 분석을 위한 로딩 제어로서 GAPDH로 단백질 신호 강도를 정상화합니다.
8. 통계분석
- 야생형과 KO동물을 비교하여 선택한 데이터 분석 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석합니다.
- P 값 (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001)을 고려하십시오.
- Student의 t 검정을 사용하여 두 그룹 간의 차이를 테스트하고 두 그룹 이상의 분석을 위해 ANOVA 테스트의 차이점을 테스트합니다.
Representative Results
우리는 장 섬유증의 근본적인 기계장치를 공부하고 해명하기 위하여 TNBS 대장염 마우스 모형을 채택했습니다8. 여기에서, 우리는 TNBS 중재한 대장염의 상세한 시간 과정 연구 결과를, TNBS는 개략적으로 표현된 대로 최대 6 주 동안 야생 형 마우스에 매주 정성적으로 관리되었습니다(그림 1A). TNBS 치료의 6 주 후, 우리는 대장 길이TNBS 치료의 과정을 통해 점진적으로 단축 것으로 나타났습니다, 대조군에서 평균 5 ± 0.5 cm에서 3 ± 0.5 cm TNBS 그룹에서; 이러한 대장 길이의 정량적 분석은 결장 길이의 매우 명백한 감소를나타낸다(그림 1B). TNBS Crohn의 질병 모델이 인간 크론의 섬유증 모델과 비교되고 방법론과 관련된 유물이 아닌지 확인하기 위해 야생 형에 대한 TNBS 주입에 대한 상세한 시간 과정 연구에서 여러 수준에서 섬유성 마커를 분석했습니다. . 알파-평활근 액틴(αSMA)의 축적은 계개층 내의 양성 세포 및 콜라겐 침착이 대부분의 섬유증 발생률에서 보고되고 있으며 섬유성이벤트(14)에대한 특징으로 간주된다. αSMA로 염색된 TNBS 처리 마우스의 결장 절편이 αSMA로 긍정적으로 염색된 대장 점막 층에서 4-6배 증가를 보였다는 것을 발견했습니다(도1C). 게다가, 이 단면도를 위한 Trichrome 청색 염색은 또한 2-4 배 증가를 보여주었습니다, 중요한 교원질 증착을 건의하, 이는 가혹한 장 섬유증을 유효하게 합니다(그림 1D). 우리는 TNBS 처리된 마우스 결장에서 FACS 분석에 의해 αSMA 양성 세포를 검출함으로써 근섬유아세포의 활성화를 더욱 평가하고 αSMA 양성 염색의 상당한 축적을 발견하였다(도1E). 더욱이, 우리는 TNBS 처리된 마우스에서 qPCR 분석에 의해 측정된 αSMA, Col-I 및 Col-III의 발현에서 상당한 유도를발견했다(도 1F). 서쪽 얼룩 분석에서 αSMA 단백질의 증가된 발현은 증가된 섬유증을 밝혀냈다(도1G). 전반적으로, TNBS 역학 처리는 CD 만성 단계 조건을 밀접하게 모방하고 섬유증 발달에 필수적인 만성 조건에서 putative 면역 반응에 접근할 수 있는 기회를 제공합니다.
TNBS 섬유증을 Crohn의 관련 섬유증과 비교하기 위하여는, 우리는 활성 CD를 가진 환자의 ileum에서 신선한 조직 생검에 있는 섬유증 마커 그리고 사이토카인의 표현을 분석했습니다 또는 면제의 밑에. 놀랍게도, 우리는 활성 CD 섹션에서 삼각 염색에 의해 검출 된 바와 같이 αSMA 양성 층의 두껍게하고 콜라겐 증착을 증가시키는 현저한 유도를 발견했습니다(그림 2A). 우리는 또한 서양 얼룩 분석을 수행하고 활성 CD 샘플에서 αSMA 발현의 유도를 확인하였다(도2B). 또한, 우리는 qPCR 분석에 의해 검출된 바와 같이 αSMA, Col1을 포함하는 섬유증 마커의 유의한 유도를 관찰하였다(도2C).
다음으로, TNBS 섬유증을 제한하는 메커니즘을 결정하기 위해 mTOR 활성15,16의약리학적 억제제인 라파마이신의 효과를 평가하였다. 따라서, 우리는 TNBS와 라파마이신 둘 다로 마우스를 처리하고 결장 물학에서 αSMA 및 콜라겐 수준을 분석하고 밀도 측정 플롯에서 αSMA 및 콜라겐의 정량적 측정을보여주었다(그림 3A). 우리의 데이터는 라파마이신이 점막 층의 αSMA 양성 염색을 감소시키고 콜라겐 침착을 줄인다는 것을 시사합니다. 섬유성 반응을 더욱 검증하고 정량화하기 위해, 우리는 tNBS 처리된 결장에서 의한 αSMA, 콜라겐 및 TGFβ 발현을 qPCR에 의해, 및 αSMA 발현을 TNBS 처리결장에서 유동세포측정에 의해 결정하였다(그림3B, 3C). 우리는 또한 Cx3Cr1+ 단핵 식세포가 상해에 선동적인 면역 반응을 유도한다는 것을보여주었습니다 9. 따라서, 우리는 TNBS 처리된 마우스에 있는 라파마이신의 행정이 선동적인 섬유성 효력을 반전할 수 있는지 보고 싶었습니다. 따라서, 우리는 자기 마이크로 비드를 사용하여 콜로닉 단일 세포 현탁액으로부터 Cx3Cr1+ 상주 단핵 식세포를 정제하였다(그림3D). 우리는 TNBS 처리된 마우스로부터의 서쪽 얼룩 분석에 의한 Cx3Cr1+ 상주 단핵 식세포에서 p-p70 및 p-S6의 증가된 수준을 발견하였고, 이 수준은 라파마이신에 의해 차단되었다(그림3E). 게다가, 우리는 라파마이신 처리가 TNBS 처리군에서 IL-23 및 IL-1β를 약화시키는 것을 발견하였다(그림3F). 더욱이, 이 사실 인정은 TNBS 섬유증의 유도에서 관련시킨 효과적인 기계장치를 설명하고 라파마이신이 섬유증의 유도를 감쇠한다는 것을 보여주었습니다.
그림 1: 성공적인 TNBS 투여는 마우스에서 장 섬유증을 개발하도록 이끈다. 야생형 마우스에주어진 주간 TNBS 치료의 개략도 표현. B. 결장 이미지 및 TNBS 처리 마우스에서 결 장 길이의 측정, 주에 수확 0, 2, 4, 그리고 6 포스트 TNSB 치료. C-D. 콜라겐에 대한 조섬유아세포 및 삼조청 염색의 활성화를 위한 항αSMA 항체로 염색된 결장단의 조직학적 분석; 스케일 바 100 μm E. FACS 분석은 대장에서 αSMA 양성 세포를 식별하고 αSMA 양성 세포의 정량화를 확인하였다. F. qPCR에 의해 검출된 섬유성 마커 및 사이토카인. G. TNBS 처리 및 대조군 마우스의 결장 용해제로부터 αSMA의 서쪽 블롯 분석. 이 수정 된 그림은 Mucosal 면역학에서 이전 간행물9의 허가와 함께 재사용되고있다, 2019 Mathur 외. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: TNBS 섬유증은 크론의 관련 장 섬유증과 유사합니다. A. 대조군 대장 생검의 대표적인 이미지, 활성 CD는 점막 층에서 삼각판 청색 염색 및 αSMA 양성 염색의 유의한 증가를 나타내는, 스케일 바 50 μm B. αSMA 발현 및 정량화의 웨스턴 블롯 분석. C. 섬유성 마커 및 사이토카인의 qPCR 분석. 이 수정 된 그림은 Mucosal 면역학에서 이전 간행물9의 허가와 함께 재사용되고있다, 2019 Mathur 외. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 라파마이신 치료는 효과적으로 TNBS 유도 섬유증을 개량한다. A. 결장 조직학 분석 - 항 αSMA 항체로 염색된 근섬유아세포의 대표적인 이미지와 트리크롬 블루로 염색한 콜라겐, 스케일 바 100 μm. B. αSMA, 콜라겐 및 TGFβ 발현의 qPCR 분석 TNBS 처리 마우스 콜론. C. 제어/TNBS로 처리된 마우스 결장으로부터의 단일 세포 현탁액에서 αSMA의 FACS 분석. D. Cx3Cr1+ 정제 세포의 콜로니아 프로피아 분획 및 정제 된 세포의 FACS 분석으로부터세포를 정제하기 위한 회로도. E. TNBS 및/또는 라파마이신으로 처리된 마우스로부터 정제된 Cx3Cr1+ 단핵 식세포에서 p-p70 및 p-S6 수준의 서쪽 얼룩 분석. F. 정제된 Cx3Cr1+ 단핵 식세포에서발현의 FPCR 분석은 IL-23 및 IL-1β를 생성한다. 이 수정 된 그림은 Mucosal 면역학에서 이전 간행물9의 허가와 함께 재사용되고있다, 2019 Mathur 외. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
상처 치유 또는 조직 수리는 엄격하게 조절된 생물학적과정(17)이다. 화학, 기계 및 감염 상태와 조직 손상 동안, 염증 반응은 조직 복구 과정을 트리거. 그러나, dysregulated 및 병리학적인 선동적인 반응은 조직 복구 기능을 손상시킬 수 있는 흉터 또는 섬유성 반응을 개발하기 위하여지도합니다9,18, 19. 여기에서, 우리는 인간 크론병과 병리생리학을 현저하게 공유하는 TNBS 유도된 섬유증 동물 모형을 위한 절차를 보여줍니다. TNBS 화학적 노출의 연속적인 접종은 마우스 상피를 손상시키는 깊은 궤양을 일으키고 섬유증 발달을 유도한다. 믿을 수 있는, 낮은 비용, 그리고 질병 개시의 급속한 유도로, 이 방법은 조직 상해, transmural 염증 및 창자 두뇌 축을 위한 연구 결과에 관련시킨 다중 연구 단에 의해 넓게 받아들여집니다.
TNBS 섬유증 모델을 성공적으로 구현하기 위해서는 몇 가지 필수 단계가 있습니다. 예를 들어, TNBS 관리의 적절 한 복용량 및 타이밍은 매우 중요 하다. 6-8 주 TNBS 접종은 깊은 조직 궤양을 허용하고 만성 섬유성 연구에 적극 권장됩니다. 마우스에서 나오는 대변 및 접종된 TNBS의 역행 반사는 마우스에 가변 복용량의 납품귀착될 수 있던 2개의 중요한 문제입니다. 마우스 직장 근처의 부드러운 압력은 TNBS 투여 전에 대변을 풀어 줄 수 있습니다. 동물의 머리를 몇 초 동안 아래로 잡은 것은 극적으로 TNBS의 역류를 중지하는 데 도움이됩니다. 케이지에 마우스를 유지, 열 패드에 케이지를 배치, 나파 꿀과 마우스를 제공 또한 높은 사망률을 방지에 유용한 전략이 될 수 있습니다.
여기에서, 우리는 또한 TNBS 섬유증 도중 창자 염증 및 섬유성 반응에 대한 그들의 충격을 토론합니다. mTOR/autophagy 역할은 장 항상성 및 IBD병인20,21에광범위하게 연루됩니다. 우리는 mTOR/autophagy 신호가 친섬유성 IL-23/IL-22 축에 영향을 미치는 Cx3Cr1+ 단핵 식세포에서 IL-23 및 IL1β 사이토카인에서 프로 염증 반응을 조절하는 것이 중요하다는 것을 확인했습니다(그림 3A)9 . 이에 따라, 면역프로파일링 및 유전자 발현을 위한 단일 Cx3Cr1+ 단핵 세포를 정제하는 것은 모델의 중요한 단계이다. 우리는 라미나 프로프리아를 분리하기위한 프로토콜을 자세하게 논의하고 자기 구슬을 사용하여 Cx3Cr1+ 단핵 세포에 대한 정제 절차를 제공합니다.
총체적으로, 크론병에 대한 유전적 및 자발적인 모델의 존재에도 불구하고, TNBS-대장염은 CD의 면역 병인을 연구하는 강력한 도구로 남아 있으며 크론의 섬유증 치료를 평가할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. TNBS와 같은 화학적으로 유도된 섬유증 모델을 사용하는 주요 제한 사항은 사용자마다 높은 가변성 및 데이터에서 이상치의 가능성입니다. 더 큰 사용자 경험과 함께 그룹당 5-8 마리의 동물 샘플 크기는 모델의 일관성을 높일 수 있습니다. 그러나, 자발적인 Crohn의 섬유증을 일으키는 원인이 되는 적당한 유전 모형을 찾아내는 것은 항상 보증될 것입니다.
Disclosures
경쟁 관심사: 저자는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 교부금 R01NS093045 (Y.H.), NIH 교부금 K08DK088950 (X.Z.), R03DK099566 (X.Z.), 그리고 크론의 & 대장염 재단 (CCFA) 481637 (R.M.)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 | e-bioscience | 53-9760-82 | |
| Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 | e-bioscience | 149760-80 | |
| Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 | Biolegend Inc | 101226 | |
| Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 | Biolegend | 149006 | |
| Anti-mouse purified CD16/32 Fc block | Biolegend Inc | 14-9760-80 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-105-639 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | e-bioscience | 7074 | |
| Bovine Serum Albumin | InvivoGen | tlrl-isdn | |
| Collagenase type IV | Roche | 1088866001 | |
| DAPI | SIGMA | D9542 | |
| DMEM | Corning | 10013-CV | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | D263-5vl | |
| Falcon® 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit | BD Bioscience | 555028 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | www.flowjo.com | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | e-bioscience | 5018 | |
| Graphpad Prism 7 | GraphPad Software Inc | www.graphpad.com | |
| H&E kit | American Mastertech Kit | HXMMHPT | |
| Image J | NIH | www.imagej.nih.gov/ij/ | |
| Mouse: C57BL/6J | Jackson Laboratories | 664 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Percol | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| PMA/Ionomycin salt | Sigma | P8139 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermofisher | A25777 | |
| Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 | Cell signaling | 5174 | |
| Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 | Cell signaling | 2708 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 | Cell signaling | 9208 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E | Cell signaling | 4858 | |
| Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein | Cell signaling | 2217 | |
| Rapamycin | LC LABORATORIES | 1003799 | |
| TNBS | Sigma | 92823 | |
| Trichorme staining kit | American Mastertech Kit | STOSTBPT | |
| TRIzol | Life technologies | 15596018 | |
| Verso cDNA Synthesis Kit | Thermofisher | AB1453B | |
| Zen black 2.1 | Carl Zeiss | www.zeis.com | |
| Zen blue lite 2.3 | Carl Zeiss | www.zeis.com |
References
- Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H.
- Park, S. G., et al. T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells. Immunity. 33, 791-803 (2010).
- Speca, S., Giusti, I., Rieder, F., Latella, G. Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18, 3635-3661 (2012).
- Keubler, L. M., Buettner, M., Hager, C., Bleich, A. A Multihit Model: Colitis Lessons from the Interleukin-10-deficient Mouse. Inflammatory Bowel Disease. 21, 1967-1975 (2015).
- Strober, W., Nakamura, K., Kitani, A. The SAMP1/Yit mouse: another step closer to modeling human inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 107, 667-670 (2001).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology-Gastroenterology and Liver Physiology. 296, G135-G146 (2009).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery. 11, 9-15 (2016).
- Loeuillard, E., et al. 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced chronic colitis with fibrosis and modulation of TGF-beta1 signaling. World Journal of Gastroenterology. 20, 18207-18215 (2014).
- Mathur, R., et al. Induction of autophagy in Cx3cr1(+) mononuclear cells limits IL-23/IL-22 axis-mediated intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. 12, 612-623 (2019).
- Joeris, T., Muller-Luda, K., Agace, W. W., Mowat, A. M. Diversity and functions of intestinal mononuclear phagocytes. Mucosal Immunology. 10, 845-864 (2017).
- Mathur, R., et al. A mouse model of Salmonella typhi infection. Cell. 151, 590-602 (2012).
- Zhao, X., et al. Noninflammatory Changes of Microglia Are Sufficient to Cause Epilepsy. Cell Reports. 22, 2080-2093 (2018).
- Murugaiyan, G., et al. MicroRNA-21 promotes Th17 differentiation and mediates experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 125, 1069-1080 (2015).
- Hinz, B., Celetta, G., Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Chaponnier, C. Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity. Molecular Biology of the Cell. 12, 2730-2741 (2001).
- Yang, J., et al. Rapamycin Inhibition of mTOR Reduces Levels of the Na+/H+ Exchanger 3 in Intestines of Mice and Humans, Leading to Diarrhea. Gastroenterology. 149, 151-162 (2015).
- Mutalib, M., et al. The use of sirolimus (rapamycin) in the management of refractory inflammatory bowel disease in children. Journal of Crohns and Colitis. 8, 1730-1734 (2014).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3209-3213 (2009).
- Paul, J., et al. IL-17-driven intestinal fibrosis is inhibited by Itch-mediated ubiquitination of HIC-5. Mucosal Immunology. 11, 427-436 (2018).
- Sohail, I., Ghosh, S., Mukundan, S., Zelewski, S., Khan, M. N. Role of Inflammatory Risk Factors in the Pathogenesis of Streptococcus pneumoniae. Frontiers of Immunology. 9, 2275 (2018).
- Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149, 274-293 (2012).
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).
