Summary
Immunoglobuline G (IgG) N-glycan wordt gekenmerkt met behulp van hydrofiele interactie CHROMATOGRAFIE UPLC. Daarnaast is de structuur van IgG N-glycan duidelijk gescheiden. Hier gepresenteerd is een inleiding tot deze experimentele methode, zodat het op grote schaal kan worden gebruikt in onderzoeksinstellingen.
Abstract
Glycomics is een nieuwe subspecialiteit in het omics-systeem onderzoek dat een significant potentieel biedt bij het ontdekken van de volgende generatie biomarkers voor ziekte gevoeligheid, detectie van drugs doel en precisie geneeskunde. Alternatieve IgG N-glycans zijn gemeld bij verschillende gemeenschappelijke chronische ziekten en suggereerden veel potentieel in klinische toepassingen (d.w.z. biomarkers voor diagnose en voorspelling van ziekten). IgG N-glycans worden op grote schaal gekenmerkt door de methode van hydrofiele interactie chromatografie (HILIC) Ultra-Performance vloeistofchromatografie (UPLC). UPLC is een stabiele detectietechnologie met een goede reproduceerbaarheid en een hoge relatieve kwantitatieve nauwkeurigheid. Bovendien, de structuur van IgG N-ontwikkelen is duidelijk gescheiden, en ontwikkelen samenstelling en relatieve overvloed in plasma worden gekenmerkt.
Introduction
N-glycosylatie van menselijke eiwitten is een gemeenschappelijke en essentiële post-translationele modificatie1 en kan het optreden en de ontwikkeling van ziekten relatief nauwkeurig voorspellen. Vanwege de complexiteit van de structuur, wordt verwacht dat er meer dan 5.000 ontwikkelen structuren, het bieden van grote potentie als diagnostische en voorspellende biomarkers voor ziekten2. N-glycans gekoppeld aan immunoglobuline G (IgG) zijn essentieel gebleken voor de functie van IgG, en IgG N-glycosylatie neemt deel aan de balans tussen de Pro-en ontstekingsremmende systemen3. Differentiële IgG N-glycosylatie is betrokken bij ziekte ontwikkeling en progressie, die zowel een aanleg als een functioneel mechanisme dat betrokken is bij ziekte pathologie representeren. De ontstekings functie van IgG N-glycosylation is geassocieerd met veroudering, ontstekingsziekten, auto-immuunziekten, en kanker4.
Met de ontwikkeling van detectietechnologie worden de volgende methoden het meest gebruikt in hoge doorvoer glycomics: hydrofiele interactie chromatografie (HILIC) Ultra-Performance vloeistofchromatografie met fluorescentiedetectie (UPLC-FLR), multiplex capillaire gel elektroforese met laser geïnduceerde fluorescentiedetectie (xCGE-LIF), matrix-geassisteerde Laser desorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF-MS), en vloeibare chromatografie elektro spray massaspectrometrie (LC-ESI-MS) . Deze methoden hebben overwonnen eerdere tekortkomingen van lage flux, instabiele resultaten, en slechte gevoeligheid specificiteit5,6.
UPLC wordt veel gebruikt om de associatie te onderzoeken tussen IgG N-glycosylatie en bepaalde ziekten (d.w.z. veroudering7, obesitas8, dyslipidemie9, type II diabetes10, hypertensie11, ischemische beroerte12, en de ziekte van Parkinson13). In vergelijking met de andere drie bovengenoemde methoden heeft UPLC de volgende voordelen5,14. Ten eerste biedt het een relatieve kwantitatieve analysemethode en de gegevensanalyse die de totale gebieds normalisatie omvat, verbetert de vergelijkbaarheid van elk monster. Ten tweede zijn de kosten van apparatuur en vereiste expertise relatief laag, wat het gemakkelijker maakt om glycosylatie biomarkers in klinische toepassingen te implementeren en te transformeren. Hier gepresenteerd is een inleiding tot UPLC, zodat het meer op grote schaal kan worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle onderwerpen die in het protocol zijn opgenomen, zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de Capital Medical University, Peking, China12. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van elk onderwerp aan het begin van de studie.
1. IgG-isolatie
- Bereid de chemicaliën inclusief bindende buffer (fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), neutraliserende buffer: 10x PBS (pH = 6,6-6.8), eluent: 0,1 M mierenzuur (pH = 2,5), neutraliserende oplossing voor eluent: 1 M Ammoniumbicarbonaat, opgeslagen buffer: 20% ethanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), reinigingsoplossing voor proteïne G: 0,1 M NaOH + 30% Propan-2-OL.
Opmerking: het niveau van de pH is van cruciaal belang in dit protocol. De elutie van IgG vereist een zeer lage pH en er bestaat een risico op verlies van sialic zuren als gevolg van zure hydrolyse. Daarom komt elutie binnen enkele seconden, en de pH wordt snel hersteld naar neutraliteit, behoud van de integriteit van IgG en de sialic zuren. - Bereid de monsters voor: ontdooit het bevroren plasma monster en centrifugeer vervolgens 10 minuten bij 80 x g en laat de proteïne g monolithische plaat en de bovengenoemde chemicaliën gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Breng een 100 μL monster (dat kan worden gebruikt om 2x te detecteren om de eerste storing te voorkomen) over in een 2 mL Verzamel plaat (hier, in totaal zes standaardmonsters, één controlemonster [Ultra-zuiver water] en 89 plasma monsters zijn ontworpen voor 96 put platen en willekeurig toegewezen aan de plaat).
- Verdun de monsters met 1x PBS met 1:7 (v/v).
- Reinig een 0,45 μm-filterplaat met hydrofiele polypropyleen (GHP) met 200 μL ultrazuiver water (Herhaal 2x).
- Breng de verdunde monsters in de filterplaat en filtreer de monsters in de opvang plaat met behulp van een vacuümpomp (controle-vacuüm druk bij 266.6-399.9 PA).
- Bereiding van de proteïne G monolithische platen
- Gooi de opslag buffer weg.
- Reinig de monolithische platen met 2 mL ultrazuiver water, 2 mL 1x PBS, 1 mL 0,1 M mierenzuur, 2 mL 10x PBS, 2 mL 1x PBS (opeenvolgend) en verwijder vloeiende vloeistof met behulp van een vacuümpomp.
- Breng de gefilterde monsters over naar de proteïne G monolithische plaat voor IgG binding en reiniging en reinig vervolgens de monolithische platen met 2 mL 1x PBS (Herhaal de reiniging 2x).
- Elute IgG met 1 mL van 0,1 M mierenzuur en filtreer de monsters door de vacuümpomp in de opvang plaat, voeg vervolgens 170 μL van 1 M Ammoniumbicarbonaat toe aan de opvang plaat.
- Detecteer de IgG-concentratie met behulp van een absorptie spectrofotometer (optimale golflengte = 280 nm).
- Open de software en selecteer de proteïne-CY3 modus.
- Trek 2 μL Ultra zuiver water en laad het in het scherm en klik vervolgens op ' leeg ' in de software om het scherm te wissen (1x herhalen).
- Trek 2 μL Ultra zuiver water en laad het in het scherm en klik vervolgens op sample in de software om het ultrazuivere water te detecteren.
- Trek 2 μL IgG-monster en laad het in het scherm en klik vervolgens op voorbeeld in de software om het monster te detecteren.
- Trek 2 μL Ultra zuiver water en laad het in het scherm en klik vervolgens op leeg in de software om het scherm te wissen.
- Sluit de software.
Opmerking: de formule voor het berekenen van de IgG-concentratie is als volgt:
CIgG = extinctiecoëfficiënt x (13,7) x 1.000 μg/ml
- Zet de geëxtraheerde IgG droog in een oven bij 60 °C en bewaar de geëxtraheerde IgG (300 μL geëxtraheerd IgG voor 4 uur).
- Verwijder 300 μL geëxtraheerde IgG als de concentratie groter is dan 1.000 μg/mL.
- Verwijder 350 μL geëxtraheerde IgG als de concentratie tussen 500-1000 μg/mL ligt.
- Verwijder 400 μL geëxtraheerde IgG als de concentratie tussen 200-500 μg/mL ligt.
- Verwijder 600 μL geëxtraheerde IgG als de concentratie kleiner is dan 200 μg/mL.
Opmerking: de concentratie van IgG moet bij voorkeur > 200 μg/mL voor de daaropvolgende detectie. De gemiddelde hoeveelheid IgG moet bij voorkeur > 1200 μg zijn, die 2x kan worden getest voor het geval de eerste test mislukt.
- Reiniging van de proteïne G monolithische plaat voor hergebruik
- Was de plaat met 2 mL ultrazuiver water, 1 mL 0,1 M NaOH (voor het verwijderen van neergeprecipiteerde eiwitten), 4 mL ultrazuiver water en 4 mL 1x PBS (opeenvolgend) en verwijder vervolgens de vloeiende vloeistof met behulp van een vacuümpomp.
- Was de plaat met 2 mL ultrazuiver water, 2 mL 30% propaan-2-OL (voor het verwijderen van gebonden hydrofobe eiwitten), 2 mL ultrazuiver water en 4 mL 1x PBS (opeenvolgend) en verwijder vervolgens vloeiende vloeistof met behulp van een vacuümpomp.
- Was de plaat met 1 mL buffer (20% ethanol + 20 mm tris + 0,1 M NaCl) en voeg 1 mL buffer (20% ethanol + 20 mm tris + 0,1 M NaCl) toe aan de plaat en laat de plaat vervolgens bij 4 °C.
2. glycan vrijlating
- Bereid de gedroogde IgG en bewaar de chemicaliën, waaronder 1,33% SDS, 4% Igepal (bewaren uit de buurt van licht), en 5x PBS bij RT.
- Bereid PNGase F enzym door verdunning 250 U enzym met 250 μL ultrazuiver water.
- Denaturatie van IgG
- Voeg 30 μL van 1,33% SDS toe en meng door vortexing, breng het monster 10 min in een oven van 65 °C, haal het uit de oven en laat 15 minuten rusten.
- Voeg 10 μL 4% Igepal toe en plaats het op de schud incubator gedurende 5 min.
- Verwijdering en afgifte van glycanen
- Voeg 20 μL 5x PBS en 30-35 μL 0,1 mol/L NaOH toe om een pH van 8,0 te reguleren en meng door vortexing. Voeg 4 μL PNGase F-enzym toe en meng door vortexing. Inincuberen voor 18-20 h in een waterbad van 37 °C.
- Zet de vrijkomende glycanen droog in een oven bij 60 °c voor 2.5-3,0 h.
- Bewaar de vrijgegeven glycanen bij-80 °c tot verdere meting.
Opmerking: deze stap is van cruciaal belang. De sleutel tot ontwikkelen release is het verbeteren van de activiteit van het pngase F-enzym om de efficiëntie te maximaliseren.
3. glycan-etikettering en-zuivering
- Bereid het 2-aminobenzamide (2-AB) etiketteer reagens met 0,70 mg 2-AB, 10,50 μL azijnzuur, 6 mg natrium cyanoborohydride (NaBH3CN) en 24,50 μL dimethylsulfoxide (DMSO) (totaal volume = 35 μL). Voeg vervolgens azijnzuur, 2-AB, en NaBH3cn in de DMSO in orde.
- Label de glycanen met behulp van 35 μL 2-AB etiketteer reagens, breng de gelabelde glycanen over naar de oscillator gedurende 5 minuten, zet deze over naar de oven voor 3 uur bij 65 °c en breng vervolgens 30 minuten over naar RT.
Opmerking: de hele ontwikkelen-etiketterings stap moet worden uitgevoerd terwijl deze beschermd is tegen licht. - Voorbehandelen van een 0,2 μm GHP filterplaat met 200 μL 70% ethanol, 200 μL ultrazuiver water, en 200 μL 96% acetonitril (4 °C), verwijder vervolgens afval met behulp van een vacuümpomp.
- Zuivering van 2-AB gelabelde ontwikkelen
- Voeg 700 μL 100% acetonitril toe aan de 2-AB met het label ontwikkelen en breng gedurende 5 minuten over op een schud incubator.
- Centrifugeer bij 134 x g gedurende 5 min (4 °c).
- Breng het monster gedurende 2 minuten over in een GHP-filterplaat van 0,2 μm en verwijder het filtraat (vloeiende vloeistof) met behulp van een vacuümpomp.
- Was 2-AB gelabeld ontwikkelen met 200 μL 96% acetonitril (4 °c) en verwijder het filtraat (vloeiende vloeistof) met behulp van een vacuümpomp 5x-6x.
- Elute 2-AB gelabelde ontwikkelen met 100 μL Ultra zuiver water 3x.
- Breng de 2-AB met gelabelde ontwikkelen over in een oven om te drogen bij 60 °c gedurende 3,5 uur.
- Bewaar het gelabelde N-glycans bij-80 °c tot verdere meting.
4. hydrofiele interactie chromatografie en analyse van glycanen
- Conditionering van UPLC-instrumenten en voorbereiding van mobiele fasen
- Bereid mobiele fasen voor, inclusief oplosmiddel A: 100 mM ammonium formaat (pH = 4,4), oplosmiddel B: 100% acetonitril, oplosmiddel C: 90% ultrazuiver water (10% methanol) en oplosmiddel D: 50% methanol (Ultra zuiver water).
- Open de software om de mobiele fases te controleren.
- Wash UPLC instrumenten met een debiet van 0,2 mL/min (50% oplosmiddel B en 50% oplosmiddel C) balanceren gedurende 30 min, vervolgens bij een debiet van 0,2 mL/min (25% oplosmiddel A en 75% oplosmiddel B) balanceren gedurende 20 min, vervolgens een debiet van 0,4 mL/min Balancing.
- Los het gelabelde N-glycans op met 25 μL van een mengsel van 100% acetonitril en ultra zuiver water bij een 2:1 ratio (v/v). Centrifugeer vervolgens op 134 × g gedurende 5 min (4 °c) en laad 10 μL van het gelabelde N-GLYCANS in de UPLC-instrumenten.
- Scheid de gelabelde N-glycans met een debiet van 0,4 ml/min met een lineair stijgingspercentage van 75% tot 62% acetonitril gedurende 25 minuten. Voer vervolgens een analytische uitvoering uit door dextran kalibratie ladder/glycopeptide kolom op een UPLC bij 60 °C (hier worden monsters vóór de injectie op 4 °C gehouden).
- Detectie van N-glycan-fluorescentie bij excitatie en emissie golflengtes van respectievelijk 330 nm en 420 nm.
- Integreer de glycanen op basis van piekpositie en retentietijd.
- Bereken de relatieve waarde van elke Glycan piek (GP)/alle Glycan pieken (GPs) (percentage,%) als volgt: GP1: GP1/GPs * 100, GP2: GP2/GPs * 100, GP3: GP3/GPs * 100, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals weergegeven in Figuur 1, werden IgG N-glycans geanalyseerd in 24 initiële IgG ontwikkelen pieken (GPS) op basis van piekpositie en retentietijd. De N-glycan structuren zijn beschikbaar via massaspectrometrie detectie volgens een eerdere studie (tabel 1)15. Om ervoor te zorgen dat de resultaten vergelijkbaar waren, werd de totale oppervlakte-normalisatie toegepast, waarbij de hoeveelheid glycanen in elke piek werd uitgedrukt als een percentage van het totale geïntegreerde gebied.
Om de reproduceerbaarheid en stabiliteit van de methode te beoordelen, werd het standaardmonster zes keer parallel getest. Zoals weergegeven in tabel 2, varieerde de variatiecoëfficiënt (CV) van 24 GPS van 1,84%-16,73%, 15 (62,50%) van minder dan 10%. GPs met relatief kleine proporties (≤ 1,16%) toonde hoge meetfouten (meer dan 10% van de CV). Bovendien, de IgG N-glycan profielen gecombineerd van 76 individuen (Figuur 2) aangegeven dat de positie van GP was stabiel, vorm van GP was vergelijkbaar, en integratie voor de monsters onderhouden dezelfde intervallen. De bovenstaande resultaten geven aan dat de methode stabiel en herhaalbaar is.
Zoals weergegeven in tabel 3, werden een extra 36 afgeleide eigenschappen die de relatieve abundanten van galactosylatie beschrijven, sialylatie, bisecting GlcNAc en kern fucosylation berekend door de overige 24 direct gemeten glycans. Bijvoorbeeld, G2/G0 (GP12/GP2) weerspiegelde het niveau van galactosylatie (di-/a-) zonder kern fucosylatie en bisecting GlcNAc. G2/G1 (GP14/[GP8 + GP9]) reflecteerde het niveau van galactosylatie (di-/mono-) met kern fucosylatie en zonder bisecting GlcNAc. Tot slot, G1/G0 ([GP10 + GP11]/GP6) reflecteerde het niveau van galactosylatie (mono-/a-) met kern fucosylatie en bisecting GlcNAc. Deze berekeningen van afgeleide glycanen volgen een principe, om de verandering van slechts één glycosylatie eigenschap te zien.
Figuur 1: UPLC-chromatogram van één individu. IgG N-glycans werden geanalyseerd in 24 initiële IgG ontwikkelen pieken (GPS) op basis van piekpositie en retentietijd. GP8 vertegenwoordigt de som van GP 8a en GP 8b. GP16 vertegenwoordigt de som van GP 16A en GP 16B. De structuur van glycanen in elke chromatografische piek en het gemiddelde percentage van de afzonderlijke structuren worden weergegeven in tabel 1 en tabel 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: UPLC-chromatogram van 76 individuen. De IgG N-glycan-profielen werden gecombineerd van 76 individuen om de reproduceerbaarheid en stabiliteit van de methode aan te tonen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: structuur van de 24 initiële IgG glycans. GP: ontwikkelen piek; F: fucose; A: aantal antenne verbonden aan de kern sequentie (bestaande uit twee NAcetylglucosamine (GlcNAc) en drie mannose residuen); B: bisecting GlcNac; G: galactose; S: sialinezuur. Structuur regelingen worden als volgt gedefinieerd: blauw vierkant: GlcNac; groene cirkel: mannose; rode driehoek: kern fucose/antennary fucose; gele cirkel: galactose; paars Rhomb: siaalzuur.
| Glycan-piek | Gemiddelde (SD) | CV (%) | Glycan-piek | Gemiddelde (SD) | CV (%) |
| GP1 | 0,23 (0,017) | 7,28 | GP13 | 0,50 (0,043) | 8,64 |
| GP2 | 0,24 (0,034) | 13,97 | GP14 | 19,54 (0,36) | 1,84 |
| GP3 | 0,96 (0,16) | 16,73 | GP15 | 1,16 (0,14) | 11,63 |
| GP4 | 19,52 (0,58) | 2,98 | GP16 | 2,79 (0,19) | 6,93 |
| GP5 | 0,17 (0,024) | 13,86 | GP17 | 1,29 (0,13) | 9,78 |
| GP6 | 3,19 (0,26) | 8,22 | GP18 | 13,16 (0,51) | 3,85 |
| GP7 | 0,29 (0,033) | 11,51 | GP19 | 2,12 (0,21) | 9,76 |
| GP8 | 16,45 (0,62) | 3,77 | GP20 | 0,12 (0,018) | 14,91 |
| GP9 | 8,97 (0,52) | 5,74 | GP21 | 1,05 (0,17) | 16,09 |
| GP10 | 2,97 (0,22) | 7,34 | GP22 | 0,18 (0,025) | 14,16 |
| GP11 | 0,30 (0,041) | 13,82 | GP23 | 2,14 (0,14) | 6,45 |
| GP12 | 1,27 (0,026) | 2,08 | GP24 | 1,43 (0,13) | 9,12 |
Tabel 2: precisie van de methode. Het standaardmonster wordt zes keer parallel getest om de reproduceerbaarheid en stabiliteit van de methode te beoordelen. CV: variatiecoëfficiënt; GP: Glycan piek; SD: standaarddeviatie.
| Afgeleide glycanen | Formules | Afgeleide glycanen | Formules |
| Galactosylatie | Fucosylation | ||
| G2/G0 | GP12/GP2 | F1/F0 | GP4/GP2 |
| GP14/GP4 | GP6/GP3 | ||
| GP15/GP6 | (GP8 + GP9)/GP7 | ||
| G2/G1 | GP12/GP7 | GP14/FGP12 | |
| GP14/(GP8 + GP9) | GP15/GP13 | ||
| GP15/(GP10 + GP11) | GP18/GP17 | ||
| G1/G0 | GP7/GP2 | GP23/GP21 | |
| (GP8 + GP9)/GP4 | GP24/GP22 | ||
| (GP10 + GP11)/GP6 | |||
| Verminderde | Bisecting GlcNAc | ||
| S2/S0 | GP21/GP12 | B1/B0 | GP3/GP2 |
| GP22/GP13 | GP6/GP4 | ||
| GP23/GP14 | (GP10 + GP11)/(GP8 + GP9) | ||
| GP24/GP15 | GP13/GP12 | ||
| S2/S1 | GP21/GP17 | GP15/GP14 | |
| GP23/GP18 | GP19/GP18 | ||
| GP24/GP19 | GP22/GP21 | ||
| S1/S0 | GP17/GP12 | GP24/GP23 | |
| GP18/GP13 | |||
| GP16/GP14 | |||
| GP19/GP15 | |||
Tabel 3: berekening van de afgeleide glycans. GP: ontwikkelen piek; F: fucose; B: bisecting GlcNac; G: galactose; S: sialinezuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UPLC dient als relatieve kwantitatieve analysemethode5,15. De resultaten geven aan dat UPLC een stabiele detectietechnologie is met een goede reproduceerbaarheid en relatieve kwantitatieve nauwkeurigheid. De hoeveelheid glycanen in elke piek wordt uitgedrukt als een percentage van het totale geïntegreerde gebied met behulp van UPLC, wat de relatieve waarde is. De relatieve kwantificering verbetert de vergelijkbaarheid van de test monsters. Daarnaast worden 96 well Protein G platen gebruikt om IgG te zuiveren met 96 samples in één keer voor een hoge doorvoer detectie. Het vermogen van proteïne G om IgG te binden is groter dan dat van proteïne A, zoals beschreven in eerdere onderzoeken15,16.
Daarnaast zijn de structuren van IgG N-glycan duidelijk gescheiden. De afgeleide IgG glycanen beschrijven het niveau van galactosylatie, sialylering, bisecting glcnac, en kern fucosylatie, die worden berekend door de initiële IgG N-glycanen. In een eerdere studie werden enkele afgeleide glycanen (FBn, FBG0n /G0n, FBn /FNtotaal, Bn /(Fn + FBn), FBG2n /FG2n, FG2 n /(BG2n + FBG2n), BG2n /(FG2n + FBG2n)) kan de verandering in meerdere glycosylatie niveaus weerspiegelen, maar niet het niveau van specifieke glycosylatie15weerspiegelen.
Onlangs toonde een grootschalig onderzoek aan dat IgG galactosylation (aangeduid als gal-ratio) kan dienen als een veelbelovende biomarker voor kankerscreening in meerdere kankertypes17. De verdeling van IgG galactosylatie wordt gemeten door berekening van de relatieve intensiteiten van agalactosylated (G0) versus Monogalactosylated (G1) en digalactosylated (G2) N-glycans volgens de formule (G0/[G1 + G2 x 2]). De gal-ratio weerspiegelt het niveau van galactosylatie met kern fucosylatie en zonder bisecting GlcNAc. Daarom werden meerdere initiële IgG N-glycans gecombineerd met een afgeleide glycan, die het niveau van een specifieke glycosylatie eigenschap representeren. De berekeningen van afgeleide glycanen volgen een principe dat de veranderingen in slechts één glycosylatie eigenschap vast over andere glycosylatie eigenschap verkent.
In het huidige protocol is pH belangrijk voor het behoud van de stabiliteit van IgG-en ontwikkelen-structuren, vooral voor het stabiliseren van de terminale sialylering. Daarom moet de pH-waarde van de oplossing streng worden gecontroleerd en moet de pH van de oplossing die aan IgG wordt blootgesteld, worden hersteld, evenals glycanen die op een neutraal pH-niveau worden gehouden. Bovendien is de ontwikkelen release stap van cruciaal belang in dit protocol. De sleutel tot ontwikkelen release is het verbeteren van de activiteit van het pngase F-enzym om de efficiëntie te maximaliseren. Bijvoorbeeld, bleek dat 18-20 h is optimaal voor PNGaseF spijsvertering. Deze stap moet volledig worden gereageerd.
Er zijn enkele beperkingen van deze techniek. De gebruikte methode kan geen onderscheid maken tussen glycanen uit de Fab en de FC porties van IgG. Glycans van Fab en FC zijn gekend om verschillend te zijn. Met de ontwikkelingen in glycoproteomica, detectietechnieken kunnen meten de niveaus van IgG combineren n-glycans om te verkennen van de rol van IgG N-glycans en n-glycosylation bij ziekten. De kosten van apparatuur zijn relatief laag; de kosten per steekproef zijn echter vrij hoog.
Samenvattend introduceert dit protocol UPLC zodat het op grote schaal kan worden gebruikt. Een uitgebreide waardering en standaardisatie van de analytische methoden is nodig voordat aanzienlijke hoeveelheden tijd en middelen worden geïnvesteerd in grootschalige studies. Aangezien UPLC vaker wordt gebruikt, kunnen de effecten van IgG N-glycans en n-glycosylatie op bepaalde ziekten nauwkeuriger worden bepaald, en kunnen glycosylatie biomarkers voor klinische toepassingen worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) en de Australische-Chinese samenwerkings beurs (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
References
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T. C., Anthony, R. M.
- Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
- Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
- Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
- Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
- Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
- Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
- Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
- Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
- Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
- Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
- Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
- Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
- Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
- Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).
